重组腺病毒rAdCDglyES的ES基因生物活性鉴定

目的:对构建的含融合自杀基因CDglyES的重组腺病毒中的ES基因是否具有独立的生物活性功能进行鉴定,为rAdCDglyES用于治疗恶性肿瘤奠定理论依据。方法:用重组腺病毒rAdCDglyES培养上清,在体外进行内皮细胞ECV-304生长抑制实验,同时做鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,观察血管生成抑制。结果:重组腺病毒rAdCDg-lyES培养上清对内皮细胞ECV-304的生成有抑制作用(抑制率78.7%),而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏,平均血管数差异明显(P<0.01)。结论:构建的重组腺病毒rAdCDglyES表达产物具有独立的ES功能即抑制内皮细胞增殖,抑制新生血管形成的生物功能。     

弱势群体致腹泻肠道原虫感染调查

弱势群体包括儿童、老人以及其他在身体上或精神上受到创伤的人群。随着社会的进步,弱势群体的经济与卫生状况等日益受到各国的关注。在美国、英国、日本等发达国家,不断有关于弱势群体大肠埃希菌、HIV病毒感染情况以及精神状况和犯罪行为调查,尤其是对老人身体及精神状况调查的报道[1,2]日渐增多。弱势群体中老年人因抵抗力下降,容易发生感染性疾病。本次仅对养老院老人肠道寄生原虫感染情况进行了调查,以便为我国弱势群体的健康评估提供科学依据。1对象与方法1.1调查对象为天津市南开区龙福宫养老院、鹤童养老院,河西区鹤童养老院,武清…     

rAdCDES的构建及对人肿瘤细胞抑制作用

目的:构建一种对肿瘤有直接和间接治疗作用的重组腺病毒rAdCDES。在体外进行抑瘤实验研究。方法:用PCR法扩增CD和glyES基因片段,插入腺病毒穿梭质粒。用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES。用MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7、人肝癌细胞株SMMC-7721和人肺腺癌细胞株A549的生长抑制情况。结果:成功构建了rAdCDES,其病毒滴度为1×1010.3TCID50/ml;rAdCDES在体外对人的MCF-7、A549、SMMC-77213种肿瘤细胞有明显抑制作用,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P<0.01)。结论:rAdCDES在体外对肿瘤细胞有明显的抑制作用,为其用于基因治疗奠定了基础。     

重叠延伸PCR方法的建立与应用

目的建立一种新型PCR技术（重叠延伸PCR）并用于腺病毒早期基因E1A与内核蛋白体进入位点IRES（internal ribosome entry site）的直接连接,为构建复制型腺病毒载体作准备.方法以PcAE1A质粒与PIRES-EGFP质粒为模板,通过引物设计,使E1A基因3＇端与IRES基因5＇端具有相互重叠的一段序列,用该组引物行PCR分别扩增E1A基因与IRES基因,再以这两种PCR产物的混合物作为模板,进行重叠延伸PCR扩增E1A-IRES基因片段.结果经酶切及测序鉴定重叠延伸PCR方法成功构建了E1A-IRES基因片段.结论重叠延伸PCR法能将任意两段DNA序列连接起来,其在分子生物学的领域中具有潜在应用价值.     

含胞嘧啶脱氨酶基因重组腺病毒的构建及其对肺癌抑制作用的研究

目的：构建含胞嘧啶脱氨酶基因（CD基因）重组腺病毒（AdE1CMVCD），并鉴定；用自杀基因治疗系统（AdE1CMVCD/5-FC）对肺癌进行抑瘤作用的实验研究。方法：体外实验：用不同稀释度的AdE1CMVCD)转染人肺癌细胞H460后分别加入不同浓度的5-氟胞嘧啶（5-FC），用MTT法检测OD570nm值，按公式计算细胞生长抑制率；体内实验：建立T739鼠肺腺癌荷瘤模型，瘤体内导入AdE1CMVCD，腹腔注射5-Fc，观察实验组及各对照组瘤体及生存期差异。结果：该系统转染的人肺癌H460细胞生长抑制率随前药5-FC浓度及感染重组病毒剂量的增加而增加，最大抑制率达61.29％，同时观察到了明显的旁杀伤作用；在体内实验中观察到AdE1CMVCD/5-FC对小鼠肺癌有明显的生长抑制作用，明显延长荷瘤小鼠生存期。结论：本文建立的AdE1CMVCD/5-FC系统体内外对肺癌均有明显的抑制作用，为临床肺癌基因治疗的应用奠定了基础。     

腺病毒介导CDES融合基因对乳腺癌细胞的抑制作用

目的:构建一种重组腺病毒rAdCDES,在体内外进行抑瘤和放疗增敏作用实验研究.方法:用细菌内同源重组法与腺病毒骨架质粒重组构建出重组腺病毒质粒,经脂质体介导转染293包装细胞扩增获取重组腺病毒rAdCDES.用测定生长曲线和MTT法检测其对人乳腺癌细胞株MCF-7的生长抑制情况;建立津白号鼠乳腺癌模型,观察rAdCDES和放疗对瘤体大小及鼠存活期的影响.结果:成功构建了rAdCDES;rAdCDES对MCF-7细胞生长抑制率达(83.1±8.1)%,与对照rAdLacZ(19.2±7.8)%相比较有显著性差异(P＜0.01);体内rAdCDES对小鼠乳腺癌MA737细胞有明显生长抑制作用,延长了小鼠的存活期,且对放疗有肯定的增敏作用.结论:本文所构建的rAdCDES在体内外对乳腺癌细胞均有明显的抑制作用和对放疗的增敏作用.     

高效化学转化菌内同源重组法构建重组腺病毒

目的：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒AdEasy系统加以改进，为制备具有更高抗肿瘤疗效的生物治疗制剂奠定基础。方法：将自杀基因CD和HSV—TK插入穿梭质粒pAdTrack—CMV中，Pme I酶切后，用酚：氯仿抽提、乙醇沉淀或切胶回收纯化；分别采用电穿孔转化法和化学转化法将线性穿梭质粒(pAdTrackCMV-CDglyTK)与腺病毒骨架质粒pAdEasy—1在细菌内实现同源重组；将重组腺病毒质粒rpAdEasyGFP-CDglyTK以脂质体介导至293细胞中进行包装、扩增。结果：采用切胶回收化学转化法获得阳性重组率最高(100％)。经PCR、酶切以及测序等方法鉴定，证实融合自杀基因已成功插入腺病毒中。结论：对细菌内同源重组法构建重组腺病毒的方法进行了改进，在降低实验成本的同时获得了较原法更高的阳性重组率，并成功构建了复制缺陷性重组腺病毒rAd-CDglyTK。     

对直接酶标HBV DNA探针检测乙肝患者血清中HBV DNA方法的改进

本文对Ｒｅｎｚ等＾〔１〕直接酶标ＨＢＶ ＤＮＡ探针检测乙肝患者血清ＨＢＶ ＤＮＡ法进行了改进，用其直接酶标ＨＢＶ ＤＮＡ 制备探针的方法，杂交后用增强化学发光检测系统取代直接酶标ＤＮＡ探针检测法中的酶催化底物显色法〔２〕。结果显示，改进后的方法在保持了特异性的同时，大大地提高了直接酶标ＨＢＶ ＤＮＡ探针检测法的敏感性，使这种方法成为可替代同位素探针测定血清中ＨＢＶＤＮＡ的一种新的快速简便的检测方法     

HSV-TK基因重组腺病毒旁杀伤效应机制初探

目的：探讨HSV-TK基因重组腺病毒（AdTK)旁杀伤效应的机制。方法：用MTT法计算细胞抑制率，数据采用单因素方差分析。结果：病毒感染过的肿瘤细胞和经AdTK/GCV系统处理的肿瘤细胞培养上清液与未感染的肿瘤细胞按不同比例混合均显示出对肿瘤细胞的抑制作用。前者的抑制率随感染AdTK细胞比例的增加而增高，后者随上清液浓度的增加而升高，结论：旁杀伤效应在TK自杀基因的治疗中起非常重要的作用。旁杀伤效应可能是基于多个环节的共同作用。