内皮抑素基因重组腺病毒载体的构建及其对新生血管的影响

目的构建腺病毒介导的小鼠内皮抑素并观察其在体内、外的表达及对血管的抑制作用。方法以mEndostatin质粒为模板通过PCR方法扩增回收mEndostatin基因，将mEndostatin基因连接到腺病毒载体DC315中，构建PDC315-mEndo表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒pBGHE3通过lipofectamine 2000共同转染293细胞，经同源重组产生重组腺病毒Ad-mEndo，用氯化铯密度梯度超速离心法纯化。用50%组织培养感染剂量法测定病毒滴度。体外转染骨肉瘤细胞株MG-63，用western印迹检测感染的骨肉瘤细胞上清夜mEndostatin的表达并通过鸡胚绒毛尿囊膜实验（chorioallantoic membrane，CAM）观察其抑制血管生成的活性。结果酶切、PCR及DNA测序鉴定表明成功构建了携带内皮抑素（Endostatin，ES）融合基因的重组腺病毒载体，而在鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验中加入培养物上清的实验组与对照组相比鸡胚尿囊膜血管密度稀疏，平均血管数差异明显（P〈0.01）。结论腺病毒介导的小鼠内皮抑素基因在体外获得高效表达，并可显著抑制血管生成。     

K_6SiNiW_(11)O_(39)对碱性成纤维细胞生长因子诱导的血管生成的影响

目的:研究K6SiNiW11O39(SiWNi)对碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管生成的影响。方法:应用血管内皮细胞增殖、浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成等体内外生物学实验观察SiWNi对bFGF诱导的血管生成的影响。结果:SiWNi能够剂量相关性的抑制bFGF诱导的ECV-304细胞增殖;在SiWNi与bFGF(100μg/L)摩尔比为1∶1的观察点,SiWNi能够明显抑制bFGF诱导的ECV-304细胞的浸润、迁移、管形成以及鸡胚尿囊膜血管形成。结论:SiWNi对bFGF诱导的血管生成有明显抑制作用。     

Citrostatin的构建与活性分析

目的:本研究拟通过人工化学合成技术将2个不同机制发挥抗癌作用的小肽结合起来,产生一个融合肽Citrostatin,并研究其生物学活性,以期获得具有双重抗肿瘤功能的抗肿瘤肽.方法:化学合成Citrostatin并经HPLC分离纯化,通过内皮细胞杀伤实验、细胞毒活性分析、体外管状结构生成抑制实验,以及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成抑制实验分析Citrostatin的生物学活性.结果:Citrostatin可明显抑制内皮细胞ECV304的增殖(ED50为6.2 μg/ml),有效杀伤肿瘤细胞1990及NCI-H640细胞(ED50分别为50 μg/ml、16 μg/ml),并明显抑制体外管状结构生成及鸡胚绒毛尿囊膜血管的生成.结论:本研究成功构建并合成了抗肿瘤融合48肽Citrostatin,研究表明该融合肽同时具有抑制肿瘤组织新生血管形成和直接杀伤肿瘤的双重活性.     

椿皮对鸡胚尿囊膜血管生成的影响

目的:研究收涩中药椿皮对鸡胚尿囊膜血管生成的影响。方法:建立鸡胚绒毛尿囊膜血管模型,观察椿皮含药血清对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。结果:椿皮对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管数目有一定抑制作用。结论:椿皮对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有抑制作用。     

VEGF对内皮抑素诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用

目的 探讨血管内皮生长因子(VEGF)对内皮抑素(ES)诱导的血管内皮细胞凋亡的抑制作用.方法 构建携带ES基因的重组腺病毒Ad-ES感染脐静脉内皮细胞ECV-304,用RT-PCR及Western blot检测ES的转录和表达;实验组为Ad-ES+VEGF组,空白对照组为空载重组腺病毒Ad-Track组,阴性对照组为...     

重组腺病毒Ad-ES对人脐静脉内皮细胞的体外抑制作用

目的 构建携带人内皮抑素(ES)的重组腺病毒Ad-ES,体外感染人脐静脉内皮细胞ECV-304,观察抑制作用.方法 以Pshuttle-ES质粒为模板PCR扩增ES基因片断,利用AdEasy-1系统及AAV293细胞构建并包装出Ad-ES,感染ECV-304细胞,病毒感染48 h后,Western blot检测ES蛋白表达,流式细胞术及DNA ladder检测ECV-304细胞凋亡情况,绘制细胞生长曲线.结果 ECV-304细胞在感染Ad-ES后生长受到抑制,感染3 d后出现细胞凋亡.结论 重组腺病毒Ad-ES在体外可抑制ECV-304细胞的生长并诱导其凋亡.     

重组人促红细胞生成素对人脐静脉内皮细胞及鸡胚尿囊绒毛膜促血管生成的作用

目的 探讨重组人促红细胞生成素(rHuEPO)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及鸡胚尿囊绒毛膜(CAM)促血管生成作用.方法 分别以生理盐水(NS)和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为阴性和阳性对照,通过三维培养模型,观察rHuEPO对体外培养人脐静脉内皮细胞管腔结构形成的影响;并采用鸡胚尿囊绒毛膜法,通过一级、二级微血管计数来评价rHuEPO在体促血管生成作用.结果 rHuEPO组内皮细胞形成管腔数目及在CAM上形成血管数均较NS组明显增多.结论 rHuEPO具有促进培养HUVEC及鸡胚CAM的血管生成作用.     

软骨抗癌活性成分抑制血管生成机理的研究

目的:为了阐明从牛软骨中提取的抗癌活性成分:软骨抗肿瘤制剂(CATP)、软骨血管生成抑制剂(CAIP)和软骨血管生成抑制因子(CAIF)的作用机理。方法:参照Takigawa法和付生法等方法,分别测定了CATP、CAIP、CAIF对血管内皮细胞DNA合成、内皮细胞迁移运动以及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响。结果:CATP、CAIP和CAIF对内皮细胞的DNA合成和细胞迁移运动以及鸡胚绒毛尿囊膜血管生成具有明显的抑制作用。结论:提示从软骨中提取的这些抗癌活性成分有可能为临床开辟一条以抑制肿瘤血管生成为特色的抗癌治疗的新途径。     

IFN-α抑制肿瘤血管形成的实验研究

目的:探讨干扰素α(IFN-α)的抗肿瘤血管形成作用机制.方法:采用MTT法检测不同浓度IFN-α对体外培养的人脐静脉内皮细胞增殖的影响;检测不同剂量IFN-α对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成的影响.结果:IFN-α对血管内皮细胞增殖有直接抑制作用;而且对鸡胚绒毛尿囊膜新生血管形成也有抑制作用.结论:提示IFN-α可通过直接抑制血管内皮细胞增殖而发挥抗血管形成作用.     

hSulf-1基因腺病毒表达载体的构建及其对血管内皮细胞增殖、迁移能力的影响

目的 构建携带人硫酸酯酶1基因(hSulf-1)的腺病毒载体,研究其对于人脐静脉内皮细胞ECV-304增殖、迁移能力的影响。方法 通过基因操作技术将hSulf-1基因插入到腺病毒基因组中,构建重组腺病毒Ad5-hSulf1;应用蛋白质免疫印迹法检测hSulf-1蛋白在ECV-304细胞中的表达及细胞内磷酸化Akt、ERK的表达变化;MTT实验检测hSulf-1过表达对于ECV-304细胞增殖的影响;采用划痕实验研究hSulf-1过表达对于ECV-304细胞迁移的影响。结果 成功构建携带目的基因hSulf-1的腺病毒载体;免疫印迹结果表明hSulf1基因过表达会下调ECV-304细胞Akt和ERK信号分子的磷酸化水平;细胞增殖实验结果表明hSulf1基因过表达抑制了ECV-304细胞增殖,感染复数为50、100时细胞存活率下降至(68.49±0.05)%以及(67.78±0.06)%(P<0.05);划痕实验结果表明hSulf1基因过表达能够抑制细胞的迁移,相比于对照组细胞迁移能力减弱(P<0.01)。结论 重组腺病毒Ad5-hSulf1介导的hSulf-1基因在ECV-304细胞中的过表达明显抑制细胞增殖及迁移,为hSulf-1用于肿瘤及血管生长相关疾病的基因治疗奠定了基础。     

抗血管生成抑制裸鼠异位子宫内膜的生长

目的:研究抗血管生成对裸鼠异位子宫内膜病灶的抑制作用?方法:利用腺病毒AdEasy-1系统及AAV293细胞构建携带内皮抑素(ES)基因的重组腺病毒Ad-ES,体外感染脐静脉内皮细胞ECV-304,诱导其凋亡;建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型,将Ad-ES?空载腺病毒Ad-Track及生理盐水分别注射至裸鼠皮下病灶,观察病灶的形态学特点,检测微血管密度(MVD),TUNEL法检测血管内皮细胞及腺细胞凋亡?结果:Ad-ES经测序?PCR鉴定构建成功,滴度为2.06×1010 pfu/ml;ECV-304感染Ad-ES后,流式细胞术及Hoechest 33258染色均检测到细胞凋亡;成功建立人子宫内膜裸鼠皮下种植模型,Ad-ES治疗组病灶体积较其他两组明显缩小(P < 0.05),HE染色后,光镜下可见腺体萎缩明显,部分结构不完整,间质伴有不同程度的坏死,TUNEL法检测到细胞凋亡明显增加,MVD减少?结论:内皮抑素可诱导血管内皮细胞凋亡?抗血管生成,并可抑制裸鼠异位子宫内膜病灶的生长,抗血管生成可能作为治疗子宫内膜异位症的方法?     

中药白芨提取物抑制肿瘤血管生成机制的实验研究

目的　探讨中药白芨提取物抑制肿瘤血管生成的机制。方法　应用细胞培养方法 ,比较空白组、对照组及不同浓度白芨胶组之间人肝癌细胞系 (Hep G2 )细胞增殖率、凋亡率、血管内皮生长因子 (VEGF)分泌水平的差异 ,并观察细胞培养上清对人脐静脉内皮细胞系 (ECV 30 4)生长的影响。对Walker 2 5 6移植性肝癌大鼠行经动脉化疗栓塞治疗 ,分为对照组、单纯化疗组、碘油栓塞组及白芨微球栓塞组 ,每组 2 0只大鼠。栓塞术后 2周 ,用免疫组织化学法检测肿瘤细胞Ⅷ因子 [用以计算微血管密度 (MVD) ]、VEGF及碱性成纤维细胞生长因子 (b FGF)表达情况。结果　细胞培养各组之间Hep G2细胞增殖率、凋亡率及上清液中VEGF浓度的差异无显著意义 ,但经白芨胶处理后的Hep G2细胞上清液可明显抑制ECV 30 4内皮细胞的增殖 ,当白芨胶浓度为 0 5、1 0、2 0、4 0、8 0 μg/ml时 ,内皮细胞生长抑制率分别为 5 7 6 %、6 6 7%、86 4%、87 5 %、94 8% ,呈剂量依赖性。动脉化疗栓塞实验中 ,白芨微球栓塞组肿瘤MVD(血管计数 /视野 )为 5 9± 34,明显低于对照组 ( 81± 2 4)、单纯化疗组 ( 83±2 0 )及碘油栓塞组 ( 85± 2 4) (F =5 177,P =0 0 0 3) ;VEGF、b FGF的表达各组间差异无显著意义。结论白芨提取物可能通过抑制肿瘤血管内     

重组腺病毒rAdCDglyES体内抑瘤作用的研究

目的：探讨重组腺病毒rAdCDglyES对肺癌的体内抑、杀瘤作用。方法：建立近交纯系C57BL小鼠Lewis肺癌模型：于小鼠荷瘤部位注射定量的重组腺病毒rAdCDglyES并给予5-氟胞嘧啶。通过观测小鼠瘤体大小、重量，中位生存期．及组织病理学改变判定疗效。结果：对荷瘤小鼠连续10d的治疗观测后发现，实验组与对照组之间平均瘤重有显著性差异（P〈0．05）；对荷瘤小鼠的中位生存期比较发现实验组较对照组天数有显著性差异（P〈0．05）；对实验组和对照组肿瘤进行HE染色后病理检测，镜下所见，含ES基因的实验组小鼠瘤组织血管数明显少于对照组，仅为对照组的53．85％（14／26）。结论：rAdCDglyES／5-FC对C57BL小鼠的Lewis肺癌有明显的抑杀瘤作用。     

内皮抑素基因腺病毒载体的构建及表达

目的：构建人内皮抑素（Human Endostatin，hE）基因的腺病毒载体，并研究其对胃癌细胞株SGC-7901、MKN-45及人脐静脉内皮细胞系ECV304生物学特性的影响。方法：采用Lipofectamine2000法将含有人内皮抑素基因的质粒pCA13-hE与pBGHE3共同转染293细胞；免疫荧光法及Western Blot检测hE的表达；用不同感染复数（Muhiplicity of infection，MOI）的重组人内皮抑素基因的腺病毒感染ECV304细胞，观察细胞生长。结果：成功构建了含hE基因的腺病毒载体；经含hE基因腺病毒载体感染的人SGC-7901胃癌细胞株、MKN-45胃癌细胞株均表达hE蛋白；表达的hE蛋白具有一定的生物学活性，可以抑制人静脉内皮细胞系ECV304的生长。结论：获得了有表达功能活性的Endostatin腺病毒载体，表达产物可抑制ECV304细胞的增殖，为肿瘤的抗血管基因治疗提供了必要条件。     

人CD40分子基因转染人脐静脉内皮细胞ECV-304

目的 构建人CD40的真核表达载体，建立持续、稳定高表达CD40的人脐静脉内皮细胞ECV-304。方法 将含有CD40的克隆载体pUCD40酶切后，再克隆到真核表达载体pCDNA3．1中，构建重组质粒pCDNA3．1（＋）／CD40，并对重组质粒进行酶切鉴定。然后用脂质体法将重组质粒转染ECV-304，G418筛选转染的细胞。RT-PCR、Western-blotting和流式细胞仪定性定量检测转染后的ECV-304的CD40的表达情况。结果 经酶切鉴定，重组体中已插入目的基因片段CD40。RT-PCR和Western-blotting证实，重组质粒转染的ECV-304中有CD40基因的表达，流式细胞仪检测转染后的ECV-304的CD40的表达率为95％。结论 成功构建了真核表达载体pCDNA3．1（＋）／CD40．并建立了高表达CD40的ECV-304，为筛选抗动脉粥样硬化药物奠定了基础.     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的：通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的为酵母菌株；观察纯化的重组人内皮抑素（rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用，方法：利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组，获得可分泌表达人内皮抑素（endostatin)的菌株，用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子（bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组，分别给予rhES和磷酸缓冲盐液（PBS）皮下注射，每日1次，连续14d，观察2组小鼠肿瘤生长情况，结果：经筛选获得表达量较高的转化菌株，其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞的增殖，与对照组比较具有显著差异（P＜0．001），动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长（P＜0．001），结论：用毕赤酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生长学活性，能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。     

同型半胱氨酸对人脐静脉内皮细胞株ECV-304生长的抑制作用

目的: 观察同型半胱氨酸(Hcy)对人脐静脉内皮细胞株ECV-304细胞生长的影响,探讨高同型半胱氨酸血症(HHCY)致动脉粥样硬化(As)的机制。方法: 将不同浓度Hcy与ECV-304细胞体外共培养不同时间,倒置显微镜下观察细胞形态,MTT法检测细胞生长抑制率,3H-TdR掺入法检测细胞DNA合成。结果: 显微镜见对照组细胞呈单层鹅卵石样紧密排列,而实验组随Hcy浓度的升高及作用时间的延长,细胞排列杂乱,聚集成团。低浓度Hcy对细胞生长的抑制作用不明显,5.0、10.0 mmol/L Hcy对细胞生长呈现抑制作用,且两组浓度作用72 h的生长抑制率高于作用48 h (P< 0.01)。5.0、10.0 mmol/L Hcy作用48 h、72 h,3H-TdR掺入抑制率高于相应对照组和低浓度组,且作用72 h的掺入抑制率显著高于48 h (P<0.01)。结论: Hcy对VEC具有直接损伤作用,可以时间及剂量依赖方式抑制ECV-304细胞的生长及DNA的合成。     

人内皮抑素在毕赤酵母中的表达、纯化及其对小鼠肺腺癌LA795细胞生长的抑制

目的通过基因重组技术获得能高效分泌表达人内皮抑素的毕赤酵母菌株;观察纯化的重组人内皮抑素(rhES)对小鼠肺腺癌LA795生长的抑制作用。方法 利用氯化锂转化法将人内皮抑素基因整合入毕赤酵母基因组,获得可分泌表达人内皮抑素(endostatin)的菌株。用肝素亲和层析的方法纯化目的蛋白。观察人内皮抑素对碱性纤维生长因子(bFGF)刺激的人血管内皮细胞系ECV－304细胞增殖的作用。将接种LA795肺腺癌细胞的T739小鼠随机分成2组,分别给予rhES和磷酸缓冲盐液(PBS)皮下注射,每日1次,连续14d。观察2组小鼠肿瘤生长情况。结果经筛选获得表达量较高的转化菌株,其表达的rhES能明显抑制bFGF刺激的人血符内皮细胞系ECV－304细胞的增殖,与对照组比较具有显苫差异(P＜0．001),动物实验表明其有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长(P＜0．001)。结论用毕亦酵母作为宿主分泌表达的rhES具有良好的生物学活性,能有效抑制小鼠肺腺癌LA795的生长。