细胞核蛋白质磷酸化和c-myc转录的变化在胃粘膜损伤修复中的作用

1 材料和方法 1.1 材料 Tyrphostin-51、PD098059、N-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPES)、钒酸钠(Na_3VO_4)、亮抑蛋白酶肽(leupeptin)、抑蛋白酶肽(aprotinin)、1,10-菲咯啉(1,10-phenanthroline)、二硫苏糖醇(DTT)、精胺、亚精胺、NP-40、三硝基甲苯(Triton X-100)和苯甲基磺酰氟(PMSF)均购自美国Sigama公司,蛋白质定量检测试剂盒(Protein assay kit)购自美国Bio-Rad公司,α-~(32)p-UTP和γ-~(32)p-ATP购自北京亚辉生物试剂公司,2,5-二苯基唑(PPO)和1,4-双-[5-酚-2-恶唑]-苯(POPOP)购自上海化学试剂厂,其他试剂为国产分析纯。LS6500型闪烁仪为美国Beckman公司产品,透析袋购自北京东方试剂仪器公司,(?)成年SD大鼠(220g～250g,第一军医大学动物所提供),禁食24h,以4mL(20mmol/L)去氧胆酸钠灌胃损伤胃粘膜,应用PTK抑制剂Tyrphostin-51(300μg·kg~(-1))和MAPKK抑制剂     

肝细胞内游离钙分布及钙振荡的亚细胞特征

应用拟肾上腺素类药物去氧肾上腺素来刺激α受体,观察盯细胞内游离钙分布及钙振荡的动态变化,以明确肝细胞内游离钙分布及钙振荡的特征。 1.材料与方法:(1)试剂:去氧肾上腺素终浓度10μmol/L,购自上海化学试剂公刊,DMEM培养基购自美国Gibco公司,小牛血清购自本校传染病中心,Fluo-3/AM、F-127均购自美国Sigma公司。(2)细胞培养:人肝细胞分离按照我中心实验室常规方法分离培养。肝细胞用DMEM培养基加小牛血清常规培养。(3)仪器:激光扫描共聚焦显微镜(德国Leica公司),激光     

肝病病人血清糖苷酶酶谱的变化

用微量分光光度法测定了正常人、肝细胞癌(HCC)和其它肝病患者血清α-L-岩藻糖苷酶、N-乙酰氨基-β-D-葡萄糖苷酶、N-乙酰氨基-β-D-半乳糖苷酶和α-甘露塘苷酶活性,结果表明:HCC 患者血清四种糖苷酶活性都高于正常人,升高的四种糖苷酶之间密切相关,但与 AFP 无关;一些肝脏良性疾病也可有某种糖苷酶活性升高,肝炎患者都伴有血清转氨酶升高和其它肝功能的异常。提示:血清糖苷酶酶谱的研究有利于HCC 的诊断。     

库普弗细胞条件培养基对原代培养肝细胞的细胞毒性

目的 探讨内毒素血症时库普弗细胞激活对肝细胞损伤的作用机制.方法 用链霉蛋白酶和胶原酶原位灌流,Percoll密度梯度离心分离、纯化SD大鼠肝细胞和库普弗细胞,制备内毒素(LPS)刺激的库普弗细胞的条件培养基(KCCM)并作用于肝细胞,检测肝细胞培养基丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)的含量,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KCCM对大鼠原代肝细胞活性的影响.结果 KCCM作用于肝细胞2 h后,肝细胞培养基中ALT、AST及LDH含量均明显升高(P＜0.05),在2～4 h内随时间延长ALT、AST及LDH含量均逐渐增加,呈明显的时间-效应关系;MTT结果显示,KCCM作用后12 h、24 h时间点对肝细胞具有明显损伤作用(P＜0.05).结论 内毒素诱导库普弗细胞释放的可溶性因子作用一定时间后可直接对肝细胞造成损伤.     

一种可靠的大鼠肝星状细胞分离及培养方法

目的探讨一种高效、经济、稳定的肝星状细胞的分离方法,为肝纤维化研究提供细胞模型。方法应用链霉蛋白酶、胶原酶灌流,以Nycodenz为分离介质,采用密度梯度离心法分离大鼠的肝星状细胞。结果肝星状细胞的获得率为(3.2±0.67)×10~7/只、存活率为90%以上。结论该法是一种较理想的分离肝星状细胞的方法。     

大鼠肝脏细胞同步分离与培养方法的建立

目的建立一种同时分离大鼠肝细胞(parenchyma cell,PC)、肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell,SEC)与库普弗细胞(Kupffer cell,KC)的操作方案。方法采用EDTA/胶原酶两步灌注法获取肝细胞悬液,通过低速离心首先分离出PC组分,然后通过链蛋白酶E去除非实质细胞(nonparenchymal cell,NPC)中的PC,最后通Nycodenz和Percoll溶液进行梯度离心分离并纯化HSC、SEC和KC,体外培养并观察各细胞表型和功能的变化。结果 PC、HSC、SEC和KC平均每克组织产量分别为(26±9.2)×10~6、(1.5±0.2)×10~6、(7.4±1.5)×10~6和(3.1±0.9)×10~6,活力分别为(93.1±2.3)%、(90.1±3.4)%、(96.2±2.1)%和(98.2±1.7)%,纯度分别为(98.5±1.2)%、(95.1±2.5)%、(93.6±3.6)%和(98.1±1.4)%;HSC在体外培养过程中逐渐丧失维生素A,转化为肌成纤维样(myofibroblast,MF)细胞;SEC在体外培养第3天出现凋亡,至7天凋亡达到顶峰,随后少量存活的细胞在体外增殖,至培养14天时形成典型的"铺路石"形态;培养14天的SEC保留清道夫功能,但丧失窗孔结构;KC可在体外增殖,培养至14天仍具有吞噬功能,表达特征性标志CD68。结论本方法可同时分离大鼠肝脏细胞,细胞数量、纯度和活力可满足下游实验。     

系膜细胞丝裂原活化蛋白激酶在糖尿病肾病发病中的作用

蛋白激酶Ｃ(ＰＫＣ)在糖尿病肾病发病中的作用已受到广泛重视和研究〔1〕。本研究采用免疫组化和激光共聚焦显微镜技术 ,观察丝裂原活化蛋白激酶 (ＭＡＰＫ)在糖尿病大鼠肾脏中的表达和作用 ,并探讨其激活机制。一、材料和方法1.试剂和仪器 :链脲佐菌素 (ＳＴＺ)、血管紧张素Ⅱ (ＡｎｇⅡ )购自Ｓｉｇｍａ公司 ,ｐ4 2ＭＡＰＫ抗体购自ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司 ,激光共聚焦显微镜购自美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司 (10 2 4型 )。2 .糖尿病大鼠模型的建立和ＭＡＰＫ在肾脏的表达 :将Ｗｉｓｔａｒ大鼠分成糖尿病组和对照组 ,ＳＴＺ复制糖尿病模型 ,喂养…     

磁珠吸附法定量检测乙型肝炎病毒的效能

目的建立磁珠吸附定量检测HBV DNA的方法,并评价该方法的检测效率。方法将病毒载量为10~7IU/mL的血清样本,倍比稀释成不同浓度的HBV DNA作为血清标准品(理论值),分别用磁珠吸附定量法(试剂1)、磁珠法(试剂2)、煮沸法(试剂3)3种方法提取HBV DNA,从灵敏度、定量线性关系方面比较本实验方法与国产磁珠法核酸自动提取法和传统煮沸法的提取效果,并对本实验方法进行稳定性验证。结果灵敏度:HBV DNA定量的检测下限理论值为10~1IU/mL,试剂1为3.520×10~1 IU/mL,试剂2为9.123×10~3 IU/mL,试剂3为6.195×10~1 IU/mL。相关性:试剂1、试剂2、试剂3提取HBV DNA定量与理论值相关性分析的r值分别为0.986、0.950、0.979(均P0.01)。稳定性:3种方法检测的相对偏差均值分别为0.243±0.405(试剂1)、1.189±0.855(试剂2)、-0.439±0.618(试剂3),试剂1对同一样本在不同时间检测结果的相对偏差均值为0.505±0.659。结论本实验所设计的血清HBV DNA提取方法灵敏,定量线性关系好,结果稳定准确,为定量检测HBV DNA奠定了基础。     

Neuritin与HSP60表达水平与肝细胞凋亡调节的相关性

目的探讨Neuritin与HSP60在肝细胞中的表达水平及对细胞凋亡调节的分子机制。方法将含有肝细胞的培养皿,随机分为4大组,分别为Neuritin低表达组、Neuritin高表达组、HSP60低表达组、HSP60高表达组。每个大组分为5个小组,对照组(n=4)和实验组(n=16),对照组不做任何处理,Neuritin低表达组分别给予0.1、0.3、0.5、0.7μg/ml的Neuritin抗体;Neuritin高表达组分别给予0.5、1.0、1.5、2.0μg/ml的Neuritin蛋白;HSP60低表达组分别给予0.6、0.8、1.0、1.2μg/ml的HSP60抗体;HSP60高表达组分别给予10×10~(-3)、50×10~(-3)、100×10~(-3)、200×10~(-3)μg/ml的HSP60蛋白,BRI肝细胞培养48 h后使用Western印迹测定Neuritin、HSP60及Caspase-3在肝细胞中的表达水平。结果与对照组相比,Neuritin低表达、高表达各剂量组Neuritin相对表达程度渐渐减低、增高,差异均有统计学意义(P0.05);HSP60相对表达水平差异无统计学意义(P0.05);Caspase-3相对表达水平逐渐增高、减低,差异有统计学意义(P0.05)。Neuritin表达量与Caspase-3表达量呈明显负相关性(r=-0.993,P0.05)。与对照组相比,HSP60低表达、高表达各剂量组HSP60相对表达程度渐渐减低和增高,差异有统计学意义(P0.05);Neuritin表达水平基本一致,差异无统计学意义(P0.05);Caspase-3相对表达量渐渐增高和减低,差异有统计学意义(P0.05)。HSP60表达量与Caspase-3表达量呈明显负相关性(r=-0.996,P0.05)。结论 Neuritin蛋白和HSP60蛋白的表达变化与凋亡蛋白Caspase-3呈现相反的变化趋势,提示Neuritin和HSP60可能通过某种协同作用共同参与肝细胞的抗凋亡调控机制。     

小鼠红细胞性白血病细胞系GM_(979)免疫抑制因子的研究 Ⅲ、GM_(979)免疫抑制因子的某些物理化学性状

本文报告了白血病细胞系GM979免疫抑制因子的某些物理化学性状。研究结果指出这个免疫抑制因子对热、紫外线及乙醚敏感。而对蛋白酶、RNA酶及冻融有抵抗力。100000g超离心后上清消失抑制作用,而沉渣仍保持较明显的免疫抑制作用。以琼脂酿-2B柱层析提纯及测定这个免疫抑制因子的分子量,证明分子量大于25～40×10~6道尔顿。但用超过滤技术测定还有少部份免疫抑制分子量介于1×10~6～3×10~6道尔顿之间。根据上述结果可以说明GM979细胞的免疫抑制因子由两部份组成:主要部份是一个大分子量物质,少部份是小分子量物质。它们的本质尚待进一步研究。