实时荧光定量检测人血浆中RASSF1A基因启动子甲基化

目的 建立检测人血浆DNA中RASSF1A基因甲基化的方法.方法 以肺癌细胞株NCI-H460作为RAssF1A基因启动子区甲基化阳性样本,传统酚/氯仿法提取细胞DNA,经紫外分光光度计定量后以10倍稀释的浓度梯度依次投入到200 μl健康人血浆中,制备得到模拟肺癌患者血浆.用磁珠法从模拟血浆样本和15例早期肺癌患者血浆中提取总DNA.对血浆DNA模板进行亚硫酸氢盐化学修饰,并以TaqMan技术的实时荧光定量甲基化特异性PCR(MSP)进行检测.以模拟血浆样品作为标准品,用外标准曲线法对肺癌患者血浆中的甲基化RASSF1A进行定量.结果 实时荧光定量MSP对模拟肺癌患者血浆的检测最低限为150拷贝(甲基化的肿瘤DNA)/ml(血浆).15例肺癌患者5例RASSF1A甲基化阳性(33.3%).5例肺癌患者血浆中甲基化的RASSF1A基因的浓度分别为2.56×103,8.20×104,1.45×104,3.31×104和4.24×104拷贝/ml.结论 实时荧光定量MSP法检测肺癌患者血浆DNA中RASSF1A基因甲基化,灵敏度高,特异性强.     

黄芪总皂甙对培养大鼠心肌细胞钙超载的影响

目的：研究黄芪总皂甙是否对培养大鼠心肌细胞钙超载产生影响，为研究和开发中药的新成分提供理论依据。方法：异丙肾上腺素干预培养大鼠(1～3d的SD乳大鼠80只)心肌细胞造成心肌细胞钙超载的模型，同时用黄芪总皂甙、维拉帕米和美托洛尔分别作用于细胞72h。分为异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)组，黄芪总皂甙1(astragaosidesl，ASl)组，AS2组，ISO+ASl组，ISO+AS2组，[SO+美托洛尔(metoprolol，M)组，ISO+维拉帕米(verapamil，V)组及正常对照组(control，C)组。检测肌细胞内游离钙离子浓度和肌质网的钙负荷，测定心肌细胞内脂质过氧化物丙二醛(maleic dialdehvde，MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：异丙肾上腺素引起心肌细胞游离钙离子浓度和肌质网钙负荷明显增加(分别增加89％和116％)。黄芪总皂甙可浓度依赖性的抑制异丙肾上腺素的作用，从低浓度(10mg／L)到高浓度(100mg／L)。与ISO组比较，ISO+AS1组与ISO+AS2组可使细胞内的钙离子浓度分别降低37％和50％[(169．2&;#177;24．2)，(132．6&;#177;29．2)，(267．6&;#177;82．0)nmol／L，t=2．57，P&;lt;0．05；t=3．81，P&;lt;0．01]，使肌质网钙负荷分别降低23％和35％(P&;gt;0．05；t=2．48，P&;lt;0．05)，但是黄芪总皂甙的这种作用不如维拉帕米，美托洛尔可基本阻断异丙肾上腺素的作用。异丙肾上腺素使心肌细胞内的丙二醛含量增加(t=2．57，P&;lt;0．05)，黄芪总皂甙对异丙肾上腺素引起的丙二醛的增加有降低趋势，并对SOD的活性有增加趋势。结论：黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞钙超载，机制之一是黄芪总皂甙减少了心肌细胞肌质网的钙负荷，并抑制了脂质过氧化。     

中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白T基因突变研究

目的初步探讨中国人群肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白 T基因突变情况,为该病的早期防治和康复介入奠定理论基础. 方法提取 58例肥厚型心肌病( hypertrophic cardiomyopathy, HCM)患者外周血白细胞基因组 DNA,聚合酶链反应( PCR)扩增心肌肌钙蛋白 T( cTnT)基因 8、9、11号外显子,产物做单链构象多态性( SSCP)分析,出现异常条带者直接测序验证. 结果58例临床确诊的 HCM患者 cTnT基因 8, 9, 11号外显子,除 160位密码子存在 ATC和 ATT多态性外,未发现基因位点的异常. 结论与国外报道的肥厚型心肌病约 20%是由肌钙蛋白 T基因突变引起相比较,中国人群肥厚型心肌病患者基因突变可能存在不同的特点.     

寻找一种诊治心肌损伤的新方法：鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景：为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体，必须降低鼠源性抗体的免疫源性，克服其人抗鼠抗体反应，需要对其进行人源化改造。目的：克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析。设计：单一样本研究。单位：一所医科大学附属医院的心血管病研究所。材料：本实验于2003—01／2004—05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及K轻链引物，从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析。主要观察指标：重链Fd段和K轻链基因序列及其所属亚型。结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段。经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1 Fab段特征：在GenBank登录，登录号为AY484430(重链)，AY484431(轻链)；氨基酸序列登录号为AAR83243(重链)，AAR83244(轻链)。结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因，为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

急性心肌梗死患者血小板反应素1单核苷酸多态性

目的探讨血小板反应素1基因第13外显子单核苷酸多态性致血小板反应素1蛋白第700位氨基酸丝氨酸转换为天冬氨酸与中国汉人急性心肌梗死的相关性。方法应用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性技术筛查了汉族172例急性心肌梗死患者和270例对照者血小板反应素1基因第13外显子钙结合活性片段8831A→G,对筛查到含有突变的片段进行序列测定,并与正常序列进行对照分析,探讨两者之间的关系。结果血小板反应素1基因8831A→G不是中国汉人急性心肌梗死发生的独立危险因素(GA比AA:相对危险度为3.19,95%可信区间为0.578～17.61,P=0.160)。结论血小板反应素1基因8831A→G在汉人中发生频率低,与汉人急性心肌梗死发生无相关性,补充了血小板反应素1基因单核苷酸多态性的数据库信息。     

肾性高血压大鼠心、肾α_1肾上腺素能受体的变化

以3H-哌唑嗪为放射配基，测定肾性高血压大鼠不同药物治疗前后心肌α_1肾上腺素能受体的密度和亲和力，并观察血压。治疗前后心肌α_1受体无明显改变（P＞0．05）；治疗前肾脏α_1受体密度明显升高（P＜0.05），治疗后α_1受体恢复近正常，其改变与血压改变吻合；各组亲和力无明显变化。心肌和肾脏α_1受体可能以不同的亚型（α_1a，α_1b）为主。狭窄肾α_1受体调节可能与血压改变有关。     

钙调神经磷酸酶在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的　探讨钙调神经磷酸酶 (CaN)在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用及抑制CaN活性对心肌肥厚的影响。方法　制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型 ,术后 2月 ,经心脏超声证实大鼠心肌肥厚后 ,分别予环孢菌素A(CsA)或培多普利治疗。观察CsA、培多普利对大鼠心肌肥厚程度 ,CaNmRNA、蛋白质表达和CaN活性的影响。结果　两肾一夹术后 2月 ,手术组大鼠左室后壁和室间隔厚度均较假手术组增高 2 1 % (P <0 0 1 ) ,CsA治疗后较治疗前分别下降 1 6 %和 1 4 % (P <0 0 1 ) ,培多普利治疗后左室后壁和室间隔厚度亦较治疗前下降。同时大鼠左室心肌CaNmRNA和蛋白质表达、CaN活性均显著下降。结论　CaN参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚 ,抑制CaN活性可逆转心肌肥厚     

不稳定型心绞痛患者血小板反应素-1基因 G1678A多态性分析

目的:探讨血小板反应素-1(TSP-1)基因G1678A(Ala523Thr)多态性与中国汉族人群不稳定型心绞痛(UAP)的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测110例UAP患者(UAP组)和319例非冠心病者(对照组)的TSP-1G1678A多态性。结果:TSP-1G1678A多态性AA、GA和GG基因型频率在UAP组和对照组的分布差异无统计学意义(AA,46.4%∶40.4%;GA,40.0%∶46.1%;GG,13.6%∶13.5%,均P>0.05)。A等位基因频率在UAP组(66.4%)和对照组(63.5%)分布差异也无统计学意义(P>0.05)。结论:TSP-1基因G1678A多态性与中国汉族人群UAP无显著相关性。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

肺癌中结肠多发性腺瘤样息肉基因启动子1A序列甲基化模式的研究

目的 探寻结肠多发性腺瘤样息肉（APC）基因启动子1A序列中肺癌甲基化位点及其存在模式。方法 用甲基化序列特异性引物，对阳性控制样品（CB＋）、阴性控制样品（CB-）、13份正常肺组织及19份肺癌组织进行APC基因启动子1A序列甲基化特异性扩增（MSP），其扩增产物直接测序和进行克隆测序分析。结果 在19份肺癌组织中，APC基因启动子1A序列的707、714、719和726位点发生高甲基化，甲基化率分别为95％（18／19）、74％（14／19）、74％（14／19）和74％（14／19），与正常肺组织比较，差异均有统计学意义（P〈0．001）。而679和687位点甲基化发生率均为11％（2／19），与正常肺组织甲基化发生率（0／13）接近（P〉0．05）。结论 在APC基因启动子1A序列中存在CpG胞嘧啶二核苷酸特定甲基化模式，其对肺癌早期诊断可能有重要意义。