应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的：利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。 方法：实验于2005—03／06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA，设计、合成两对引物，将突变位点设计在引物内，突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点，采用聚合酶链式反应定点突变技术，应用高保真TaqDNA聚合酶，通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增，将第13外显子碱基8831A置换为G，对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。 结果：获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体，经酶切鉴定和测序分析，除引入突变点产生预期A8831→G突变外，其余碱基序列无改变。 结论：采用聚合酶链反应体外定点突变技术，成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体，为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。     

中国汉族人血小板反应素蛋白1基因单核苷酸多态性与冠心病的关联研究

目的 探讨血小板反应素蛋白1(TSP-1)基因第13外显子单核苷酸多态性(SNPs),致TSP-1蛋白第700位氨基酸丝氨酸转换为天冬氨酸(700N→S)与中国汉族人冠心病有无相关性.方法 应用聚合酶链反应-限制性片断长度多态性技术(PCR-RFLP),筛查南京医科大学第一附属医院和上海中医药大学附属岳阳医院2003年11月至2007年5月437例汉族冠心病患者和对照组423例TSP-1基因第13外显子钙,结合活性片段8831A→G,对筛查到含有突变的片段进行序列测定,并与正常序列进行对照分析.结果 2组均以AA型为主,测序仅检测到AG杂合型19例,未检测到GG纯合子.在2组中AG杂合型所占比例比较差异无统计学意义(2.5%比1.9%,P＞0.05).TSP-1基因8831A→G在中国汉族人中发生频率低,与汉族人冠心病发生无相关性(AG对AA:OR=1.699;95%CI 0.309～9.348,P＞0.05).结论 TSP-1基因8831A→G不是中国汉族人冠心痛发生的独立危险因素.     

清道夫受体SR-AⅡ基因定点突变的研究

目的:利用聚合酶链反应技术对清道夫受体SR-AⅡ基因进行定点突变的研究。方法:利用聚合酶链反应定点突变技术,首先设计4条(其中2条包含预定突变位点)引物,通过3轮PCR反应扩增出含有所需突变位点的片段,通过酶切连接方法将其重组到pEGFP-C1中形成pEGFP-SR-AⅡ-335质粒。结果:在真核表达载体pEGFP-SR-AⅡ-335基础上获得了SR-AⅡcDNAA1201G和A1202C的突变体,测序结果表明在序列中发生了预期的突变,使SR-AⅡ受体蛋白第335位的赖氨酸变为丙氨酸。结论:SR-AⅡ定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

胆固醇酯转运蛋白基因15外显子D442G突变的检测

应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP) 的方法检测110例脑动脉粥样硬化患者胆固醇酯转运蛋白(CETP)基因15外显子D442G错义突变.首先用聚合酶链反应特异性扩增包含人CETP基因15外显子第1506位碱基的基因序列,扩增产物用限制性内切酶MspⅠ酶切,聚丙烯酰胺凝胶电泳后分析结果.110例脑动脉粥样硬化患者中发现4例杂合突变,突变率3.6%,与对照组4%比较无明显差异.该方法简单、快速、准确,适合于一般实验室开展及大规模人群调查.     

胆固醇酯转运蛋白基因15显子D442G突变的检测

应用聚合酶链反应－限制性片段长度多态性分析（ＰＣＲ－ＲＥＬＰ）的方法检测１１０例脑动脉粥样硬化患者胆固醇酯转运蛋白（ＣＥＴＰ）基因１５外显子Ｄ４２Ｇ错义突变。首先用聚合酶链反应行异性扩增包含人ＣＥＴＰ基因１５外显子第１５０６位碱基的基因序列，扩增产和用限制性内切酶ＭｓｐⅠ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后分析结果。１１０例脑动脉粥样硬化患者中发现４例杂俣突变。突变率３．６％，与对照组４％比较无明显差异。该     

清道夫受体SR-AII基因定点突变的研究

目的　利用聚合酶链反应( PCR)技术对清道夫受体SR-AII基因进行定点突变的研究。方法　利用PCR定点突变技术, 首先设计两对包含预定突变位点的引物, 通过3轮PCR法扩增出含有所需突变位点的片段, 通过酶切连接方法将突变点引入到pEGFP-C1-SR-AII中, 随后用TRANSfection转染试剂介导转染293T细胞。结果　在真核表达载体pEGFP-SR-AII基础上获得了SR-AII cDNA A1201G和A1202C的突变体, 测序结果表明在序列中发生了预期的突变。结论　SR-AII定点突变体的构建为进一步的功能研究奠定了基础。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的:自行构建人血小板源性生长因子B(PDGF-B)真核表达载体,为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法:实验于2002-01/2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据Genbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列,设计合成一对附加BamHⅠ,XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段,将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。③经测序鉴定后,再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果:反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论:成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因,构建了基因重组真核表达载体PcDNA4/PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究,在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

原发性开角型青光眼患者TIGR基因突变筛选、序列分析

目的:观察原发性开角型青光眼(primaryopenangleglaucoma,POAG)患者小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白(trabecularmeshworkinducedglucocorticoidresponseprotein,TIGR)基因的突变情况。方法:实验于2001-01/2005-12在哈尔滨医科大学和暨南大学完成。应用聚合酶链式反应方法扩增90例原发性开角型青光眼患者和30例正常对照组的小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因3个外显子的片段,应用单链构像多态筛选可能突变的聚合酶链反应产物。将聚合酶链反应产物,以EcorⅠ酶切鉴定重组质粒,然后测序。结果:①用单链构像多态方法筛选的5例原发性开角型青光眼患者在小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因第3外显子中部(第6对引物)片段出现单链带型异常,余均未见异常;正常对照组未见异常。基因的3个外显子片段,包含各外显子的7对引物。②克隆测序的3例样品,在388密码子位置出现由GAT突变为AAT,氨基酸由天冬氨酸替换为天冬酰胺,即Asp388Asn。结论:原发性开角型青光眼患者的发病可能与小梁网糖皮质激素诱导反应蛋白基因突变有关。     

人β2—肾上腺素能受体基因第64位密码子突变频率的检测

建立一种简便，准确，实用的人β３－肾上腺素能受体基因第６４位密码子突变的检测方法。方法应用聚合酶链反应特异性扩增β３－肾上腺素能受体基因含编码６４位氨基酸的基因 列，扩增产物用限制性内切酶ＢｓｔＯＩ酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，观察酶切位点的限制性片段长度多态性图谱。     

人血小板源性生长因子B基因的体外扩增以及克隆和鉴定

目的：自行构建人血小板源性生长因子B（PDGF-B）真核表达载体，为人血小板源性生长因子B基因转染真核细胞的实验研究及基因治疗奠定基础。方法：实验于2002-01／2005-01在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成。①根据GeIlbank的人血小板源性生长因子B的全长基因序列，设计合成一对附加BamHⅠ，XhoⅠ两个限制性内切酶酶切位点的特异性引物。②采用反转录聚合酶链反应从人胎盘mRNA中扩增出人血小板源性生长因子B基因片段，将其插入真核表达载体PcDNA4构建成重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。⑧经测序鉴定后，再用双酶切和聚合酶链反应对插入片段进行分析和验证。结果：反转录-聚合酶链反应产物经琼脂糖电泳结果显示在预期位置有相对分子质量为725bp的特异性扩增带。②序列分析、双酶切和聚合酶链反应结果证实插入片段序列正确。结论：成功扩增出完整的人血小板源性生长因子B基因，构建了基因重组真核表达载体PcDNA4／PDGF-B。为人及动物细胞的转基因研究，在基因水平改变其遗传性状打下基础。     

临床护士心理压力源与工作满意度调查分析

目的了解临床护士面临的主要心理压力源,为护理管理者有效地帮助护士减轻和消除心理压力提供依据。方法采用自评式问卷调查的方法 ,对内江市2所三级乙等医院287名从事临床护理工作的护士进行问卷调查。结果临床护士的心理压力源依次来源于工作强度、职业需求、工作环境、人际关系、家庭经济收入等方面。其中来源于工作强度、人际关系及家庭方面的压力源,不同年龄组护理人员在其压力程度上差异有统计学意义(P0.05)。结论从事临床护理工作的护士存在着多种心理压力源,这些压力源是导致护士工作不满意的主要原因,也是护理的安全隐患之一,护理管理者应予以足够的重视,并定期针对不同的人群进行心理健康知识培训,建立有效的支持系统,及时帮助他们调整心理状态,减轻和消除压力,从而提高护士对本职工作的满意度和患者对护理服务的满意度。     

精神疾病患者家属教育的情况分析

目的：通过对精神疾病患者家属教育的调查，探讨家属教育的内容和教育方式。方法：采用自拟问卷对参加系列教育的家属进行调查分析。结果：患者和家属接受教育次数越多，对疾病知识了解越多；在患者的亲属中患者的父母参加教育比率较大。结论：家属教育对治疗疾病起着积极的作用，应更具有针对性，同时还应该注意教育方式。