寻找一种诊治心肌损伤的新方法：鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景：为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体，必须降低鼠源性抗体的免疫源性，克服其人抗鼠抗体反应，需要对其进行人源化改造。目的：克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析。设计：单一样本研究。单位：一所医科大学附属医院的心血管病研究所。材料：本实验于2003—01／2004—05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及K轻链引物，从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析。主要观察指标：重链Fd段和K轻链基因序列及其所属亚型。结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段。经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1 Fab段特征：在GenBank登录，登录号为AY484430(重链)，AY484431(轻链)；氨基酸序列登录号为AAR83243(重链)，AAR83244(轻链)。结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因，为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

急性心肌梗死患者血小板反应素1单核苷酸多态性

目的探讨血小板反应素1基因第13外显子单核苷酸多态性致血小板反应素1蛋白第700位氨基酸丝氨酸转换为天冬氨酸与中国汉人急性心肌梗死的相关性。方法应用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性技术筛查了汉族172例急性心肌梗死患者和270例对照者血小板反应素1基因第13外显子钙结合活性片段8831A→G,对筛查到含有突变的片段进行序列测定,并与正常序列进行对照分析,探讨两者之间的关系。结果血小板反应素1基因8831A→G不是中国汉人急性心肌梗死发生的独立危险因素(GA比AA:相对危险度为3.19,95%可信区间为0.578～17.61,P=0.160)。结论血小板反应素1基因8831A→G在汉人中发生频率低,与汉人急性心肌梗死发生无相关性,补充了血小板反应素1基因单核苷酸多态性的数据库信息。     

crp基因c+1444t多态性与中国苏皖地区汉族人群acs的易感性无关

目的:探讨C反应蛋白(C-reactive portein,CRP)基因C+1444T多态性与急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)的易感性。方法:选择2003年11月～2008年5月住院的ACS患者443例(ACS组)和同期经冠脉造影排除冠心病者285例(对照组),采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RELP)方法检测CRP基因C+1444T多态性。结果:ACS组的CC、CT和TT基因型以及C等位基因频率分布与对照组无显著性差异(83.7%vs 86.7%、14.4%vs 12.3%、1.8%vs 1.1%和91.0%vs 92.8%,P值分别为0.292、0.439、0.540和0.243)。调整年龄、性别、吸烟、收缩压、舒张压、血糖和血脂等多因素后采用多元Logistic回归分析显示,CRP基因C+1444T多态性与ACS的发生仍无显著性关联(P>0.05)。结论:在中国苏皖地区汉族人群中,CRP基因C+1444T多态性与ACS的易感性无显著相关性。     

培哚普利对肾血管性高血压大鼠心肌钙调神经磷酸酶及丝裂原活化蛋白激酶的影响

目的研究两肾一夹高血压大鼠心肌肥厚过程中钙调神经磷酸酶(CaN)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK，包括胞外信号调节激酶、c-Jun NH2-末端激酶、p38丝裂原活化蛋白激酶)的变化，探讨血管紧张素转换酶抑制剂培哚普利对心肌肥厚和CaN、MAPK的影响。方法制作两肾一夹高血压大鼠模型；以左心室重、左心室重与体重比值、心肌细胞横截面积、左心室后壁和室间隔厚度作为大鼠心肌肥厚指标；应用RT-PCR法测定大鼠心肌CaN和MAPK mRNA表达，采用免疫印迹法检测CaN蛋白表达，以对硝基苯磷酸作底物测定CaN活性。结果两肾一夹术后2个月大鼠已发生心肌肥厚，术后3个月心肌肥厚进一步加重；手术组大鼠左心室心肌CaN mRNA、蛋白表达和CaN活性以及c-Jun NH2-末端激酶mRNA表达均高于同龄假手术组。培哚普利治疗可逆转大鼠心肌肥厚和CaN、c-Jun NH2-末端激酶的变化。结论培哚普利可通过抑制胞内CaN和c-Jun NH2-末端激酶信号通路逆转两肾一夹高血压大鼠心肌肥厚。     

钙调神经磷酸酶在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的　探讨钙调神经磷酸酶 (CaN)在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用及抑制CaN活性对心肌肥厚的影响。方法　制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型 ,术后 2月 ,经心脏超声证实大鼠心肌肥厚后 ,分别予环孢菌素A(CsA)或培多普利治疗。观察CsA、培多普利对大鼠心肌肥厚程度 ,CaNmRNA、蛋白质表达和CaN活性的影响。结果　两肾一夹术后 2月 ,手术组大鼠左室后壁和室间隔厚度均较假手术组增高 2 1 % (P <0 0 1 ) ,CsA治疗后较治疗前分别下降 1 6 %和 1 4 % (P <0 0 1 ) ,培多普利治疗后左室后壁和室间隔厚度亦较治疗前下降。同时大鼠左室心肌CaNmRNA和蛋白质表达、CaN活性均显著下降。结论　CaN参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚 ,抑制CaN活性可逆转心肌肥厚     

不稳定型心绞痛患者血小板反应素-1基因 G1678A多态性分析

目的:探讨血小板反应素-1(TSP-1)基因G1678A(Ala523Thr)多态性与中国汉族人群不稳定型心绞痛(UAP)的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测110例UAP患者(UAP组)和319例非冠心病者(对照组)的TSP-1G1678A多态性。结果:TSP-1G1678A多态性AA、GA和GG基因型频率在UAP组和对照组的分布差异无统计学意义(AA,46.4%∶40.4%;GA,40.0%∶46.1%;GG,13.6%∶13.5%,均P>0.05)。A等位基因频率在UAP组(66.4%)和对照组(63.5%)分布差异也无统计学意义(P>0.05)。结论:TSP-1基因G1678A多态性与中国汉族人群UAP无显著相关性。     

肾性高血压大鼠心、肾α_1肾上腺素能受体的变化

以3H-哌唑嗪为放射配基，测定肾性高血压大鼠不同药物治疗前后心肌α_1肾上腺素能受体的密度和亲和力，并观察血压。治疗前后心肌α_1受体无明显改变（P＞0．05）；治疗前肾脏α_1受体密度明显升高（P＜0.05），治疗后α_1受体恢复近正常，其改变与血压改变吻合；各组亲和力无明显变化。心肌和肾脏α_1受体可能以不同的亚型（α_1a，α_1b）为主。狭窄肾α_1受体调节可能与血压改变有关。     

T型钙通道阻断剂对肥厚心肌L型钙通道电流及单细胞mRNA表达的影响

钙通道阻断剂咪拉地尔对T型钙通道有较高的选择性,在整体模型中对L型钙通道的作用尚不明确。本研究联合运用膜片钳技术及单细胞RT-PCR方法,研究二肾一夹肥厚     

黄芪总皂甙对培养大鼠心肌细胞钙超载的影响

目的：研究黄芪总皂甙是否对培养大鼠心肌细胞钙超载产生影响，为研究和开发中药的新成分提供理论依据。方法：异丙肾上腺素干预培养大鼠(1～3d的SD乳大鼠80只)心肌细胞造成心肌细胞钙超载的模型，同时用黄芪总皂甙、维拉帕米和美托洛尔分别作用于细胞72h。分为异丙肾上腺素(isoproterenol，ISO)组，黄芪总皂甙1(astragaosidesl，ASl)组，AS2组，ISO+ASl组，ISO+AS2组，[SO+美托洛尔(metoprolol，M)组，ISO+维拉帕米(verapamil，V)组及正常对照组(control，C)组。检测肌细胞内游离钙离子浓度和肌质网的钙负荷，测定心肌细胞内脂质过氧化物丙二醛(maleic dialdehvde，MDA)的含量和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。结果：异丙肾上腺素引起心肌细胞游离钙离子浓度和肌质网钙负荷明显增加(分别增加89％和116％)。黄芪总皂甙可浓度依赖性的抑制异丙肾上腺素的作用，从低浓度(10mg／L)到高浓度(100mg／L)。与ISO组比较，ISO+AS1组与ISO+AS2组可使细胞内的钙离子浓度分别降低37％和50％[(169．2&;#177;24．2)，(132．6&;#177;29．2)，(267．6&;#177;82．0)nmol／L，t=2．57，P&;lt;0．05；t=3．81，P&;lt;0．01]，使肌质网钙负荷分别降低23％和35％(P&;gt;0．05；t=2．48，P&;lt;0．05)，但是黄芪总皂甙的这种作用不如维拉帕米，美托洛尔可基本阻断异丙肾上腺素的作用。异丙肾上腺素使心肌细胞内的丙二醛含量增加(t=2．57，P&;lt;0．05)，黄芪总皂甙对异丙肾上腺素引起的丙二醛的增加有降低趋势，并对SOD的活性有增加趋势。结论：黄芪总皂甙可抑制异丙肾上腺素引起的心肌细胞钙超载，机制之一是黄芪总皂甙减少了心肌细胞肌质网的钙负荷，并抑制了脂质过氧化。     

应用聚合酶链反应技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体

目的:利用聚合酶链反应定点突变技术构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体。方法:实验于2005-03/06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。选择南京医科大学第一附属医院体检中心健康体检者血标本提取人基因组DNA,设计、合成两对引物,将突变位点设计在引物内,突变位点包含限制性内切酶BseNI酶切位点,采用聚合酶链式反应定点突变技术,应用高保真TaqDNA聚合酶,通过三轮聚合酶链扩增反应对血小板反应素1基因的第13外显子进行扩增,将第13外显子碱基8831A置换为G,对最终扩增产物进行酶切鉴定和测序。结果:获得人血小板反应素1第13外显子编码钙结合域突变体,经酶切鉴定和测序分析,除引入突变点产生预期A8831→G突变外,其余碱基序列无改变。结论:采用聚合酶链反应体外定点突变技术,成功构建人血小板反应素1基因第13外显子编码钙结合域突变体,为研究血小板反应素1基因该位点突变导致血小板反应素1蛋白的结构、功能变化奠定了基础。