Ⅲ型登革病毒NS1单克隆抗体的制备及鉴定

目的 研制Ⅲ型登革病毒(DV3)非结构蛋白1(NS1)单克隆抗体,鉴定其血清型特异性.方法 以具有良好抗原性的重组DV3-NS1蛋白与DV3交替免疫Balb/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合,间接ELISA筛选阳性的杂交瘤细胞,并结合免疫荧光(IFA)和Weatern Blot对抗体的特异性进行鉴定.结果 经交替免疫法免疫Balb/c小鼠,共获得14株抗DV3-NS1单抗,其亚类测定1株为IgG2a,余为lgG1.其中3株特异性结合DV3及DV3-NS1蛋白,4株能同时结合4型登革病毒NS1蛋白,其余7株与其他3型登革病毒NS1蛋白存在交叉反应.结论 成功获得了针对DV3-NS1的特异性单抗及交叉性单抗,将为进一步研究登革病毒NS1蛋白的结构与功能及临床诊断试剂的研发奠定基础.     

细胞融合法制备抗人CD3-抗人IgM μ链双特异性抗体

目的制备抗人CD3-抗人IgMμ链双特异性抗体(Bispecific antibody,BsAb)的细胞株,并对建株的杂交-杂交瘤的稳定性及活性进行鉴定.方法将抗人CD3单克隆抗体细胞株采用8-AG诱变成HAT敏感杂交瘤细胞株.再通过FuGENETM6转染含neo基因质粒pCDaA3,制备成具有双标记杂交瘤αCD3 HATsG418R亚系,与抗人IgMμ链单克隆抗体细胞株融合.通过ELISA法及流式细胞仪筛选,制备分泌BsAb的细胞株.结果融合6次,共接种1 080孔,共得5株抗CD3-抗IgM杂交-杂交瘤.经亚克隆后,其中2株体外连续传代培养2月仍保持良好的分泌BsAb功能.结论采取细胞融合法可成功制备分泌BsAb的杂交-杂交瘤,其稳定性及效价与亲本杂交瘤相似.     

特异性靶向嵌合疫苗研究进展

特异性靶向嵌合疫苗,是用基因工程技术将抗原多肽或蛋白质分子与一些结合ＡＰＣ表面受体的分子融合,通过 ＡＰＣ表面受体与配体相互作用,使抗原特异性靶向ＡＰＣ,提高ＡＰＣ对有效剂量抗原摄取和加工处理,从而增强免疫应 答反应。     

特异性靶向嵌合疫苗研究进展

特异性靶向嵌合疫苗,是用基因工程技术将抗原多肽或蛋白质分子与一些结合APC表面受体的分子融合,通过APC表达受体与配体相互作用,使抗原特异性靶向APC,提高APC对有效剂量抗原摄取和加工处理,从而增强免疫应答反应。     

基因重组人睫状神经营养因子单克隆抗体的制备及初步鉴定

目的　制备基因重组人睫状神经营养因子 (rhCNTF)单克隆抗体。方法利用rhCNTF免疫BALB/C小鼠 ,取其脾细胞与小鼠NS -1骨髓瘤细胞融合 ,制备 3株抗rhCNTF的单克隆抗体 ,分别命名为CA2 、CA6 和BB11。结果 3株抗体类型均为IgG2a,免疫印迹试验证明为特异性抗CNTF的单克隆抗体 ;抗体相加试验表明 3株单抗是针对CNTF两个不同的抗原决定簇。     

人禽流感HSN1病毒HA1蛋白抗原表位及主要免疫功能区特征的研究

目的 确定人禽流感H5N1病毒HA1蛋白的单克隆抗体(McAb)抗识别表位及主要免疫功能区.方法 将16条人禽流感H5N1病毒HA1基因重叠片段克隆入真核表达载体pDisplay,构建表达HA1蛋白的重叠肽段重组质粒,转染HeLa细胞后制备细胞抗原片.利用灭活的H5N1病毒免疫BALB/C小鼠,制备病毒特异单克隆抗体(单抗)和多克隆抗体(多抗),采用间接免疫荧光法分析单抗、多抗与HA1肽段的反应性.确定HA1蛋白的单抗识别表位及主要免疫功能区.结果 成功克隆、表达了16条不同长度的H5N1肽段,并制备、获得30株分泌抗H5N1型禽流感病毒McAb的杂交瘤细胞株,其中18株为抗HA的单抗,18株中有6株单抗具有中和病毒活性.利用表达的H5N1肽段对单抗识别表位进行分析,初步确定3B5、3D1、3132、M6、M3等18株McAb识别表位区域分别位于氨基酸残基aa133-143、aa155-165、aa166-196、aa166-176、aa34-66及aa296-328之间,其中3B5、3D1、3B2、M6等McAb识别表位为序列依赖型表位,M3和M7等具有中和活性的McAb识别表位为构象性中和表位.结论 利用制备的H5N1病毒特异性McAb和表达的病毒HA1蛋白重叠肽抗原,初步确定了18株抗HA McAb的识别表位和HA1蛋白的主要免疫功能区,为进一步研究开发新型疫苗提供了重要理论依据.     

广州地区病毒性腹泻的病原分布和病毒基因分型调查

摘要:目的　初步了解广州地区儿童和成人病毒性腹泻的病原学构成和分布情况及相关病毒的分子特征。方法　收集2012年11月-2013年5月于珠江医院就诊的腹泻患者的粪便标本,采用免疫层析法检测轮状病毒和腺病毒抗原,实时荧光PCR检测诺如病毒GI/GII,上述检测阳性标本进行病毒基因测序分型。结果　290例患者中,3种常见病毒的检出率分别为21.4%、15.5%和1.7%;男性患者病毒阳性率显著高于女性患者（χ2＝0.017,P＜0.05）;≤5岁患者轮状病毒阳性率最高,为28.49%（χ2＝0.017,P＜0.05）,＞5岁患者诺如病毒阳性率最高,为21.62%;轮状病毒性腹泻秋冬季节高发;轮状病毒G/P分型以G1P8、G9P8、G2P4和G3P8为主,占92.16%,诺如病毒共检测出8种基因型,以GII.4型为主,占53.33%;病毒合并其他常见腹泻病原体感染占病毒阳性标本的15.89%。结论　轮状病毒和诺如病毒分别是广州地区婴幼儿和成人病毒性腹泻的主要病原体,本地区流行的轮状病毒和诺如病毒优势株分别是G1P8和GII.4,诺如病毒基因型多样性更丰富;混合感染常见,需引起重视。     

Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

目的 利用毕赤酵母真核系统表达Ⅰ～Ⅳ型登革病毒E蛋白Ⅲ区(DENV-1～4EDⅢ),获得可分泌表达的重组蛋白ED Ⅲ.方法 PCR分别扩增Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ区基因,构建至pPIC9K毕赤酵母表达质粒.酶切线性化后电转化毕赤酵母菌GS115,涂板后经G418梯度浓度筛选,获得多株抗G418 4.0 mg/ml的高拷贝菌株,扩大培养后,利用甲醇诱导分泌表达重组蛋白,表达上清用Ni-NTA亲和树脂纯化后以免疫印迹鉴定.结果 成功构建pPIC9K-DENV-1～4 EDⅢ重组质粒,高拷贝菌株经甲醇诱导后分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ重组蛋白,纯化后获得的可溶性重组蛋白经变性凝胶电泳,相对分子质量约为12×103,与实际相符.免疫印迹鉴定结果表明该重组蛋白能与抗His单抗和抗Ⅰ～Ⅳ型DENV小鼠血清特异结合.结论 成功通过毕赤酵母高效分泌表达Ⅰ～Ⅳ型DENV EDⅢ蛋白,这些重组蛋白可进一步用于疫苗、诊断试剂和E蛋白生物学功能的研究.     

双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p抗体

目的建立一种检测马尔尼菲青霉特异性抗体的双抗原夹心ELISA方法。方法利用毕赤酵母系统表达重组马尔尼菲青
霉特异性甘露糖蛋白Mp1p,并利用改良过碘酸钠法标记Mp1p,经棋盘滴定法建立一种可检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体
的双抗原夹心ELISA法,并检测100例健康人群对照血清、21例血培养确诊其他真菌感染病人血清和15例血培养确诊马尔尼
菲青霉病人血清,联合本实验室前期建立的马尔尼菲青霉抗原检测方法评价其临床应用价值。结果成功建立一种检测马尔
尼菲青霉Mp1p特异性抗体的双抗原夹心ELISA法,经健康人群对照及其他真菌感染病人血清评价特异度为100%（121/121）,
检测15例马尔尼菲青霉病人血清,Mp1p特异性抗体2例阳性,Mp1p特异性抗原12例阳性,Mp1p抗体与抗原联合检测可明显
提高灵敏度,达到93.3%（14/15）。结论双抗原夹心ELISA法检测马尔尼菲青霉Mp1p特异性抗体具有高度的特异性,联合抗
原检测可提高马尔尼菲青霉感染诊断率。
     

Ⅰ型登革病毒ns1基因克隆及其表达产物的免疫原性研究

目的克隆并表达Ⅰ型登革病毒非结构蛋白1(NS1)基因,初步鉴定其免疫原性。方法登革热Ⅰ型病毒标准株感染C6/36细胞后,抽提病毒RNA,经RT-PCR方法扩增出NS1全长基因片段,经T-A克隆后,在QIA表达系统中表达,表达产物用Ni柱亲和层析纯化后,用兔抗Ⅰ型登革病毒免疫血清及登革热患者血清对重组蛋白进行Western Blot及ELISA鉴定。结果构建的重组质粒pQE-30/DV1NS1经IPTG诱导,重组蛋白NS1高效表达并纯化成功,经Western Blot及ELISA证实重组蛋白NS1可以被免疫血清和病人血清特异识别。结论Ⅰ型登革病毒非结构蛋白NS1表达载体在大肠杆菌M15中高效表达。纯化产物具有较强的免疫原性,为进一步研究NS1的生物学特性和血清学检测奠定了基础。