慢性乙型肝炎低水平病毒血症的研究进展

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)是一种广泛的全球性感染性疾病,可以发展为肝硬化甚至肝细胞癌.聚乙二醇化干扰素α和核苷(酸)类似物等治疗药物可以抑制HBV,延缓CHB患者的疾病进展,但部分患者经强效低耐药药物治疗后仍不能获得有效的病毒学应答,而持续存在的低水平病毒血症可以诱发耐药、促进肝纤维化进展、增加肝细胞癌发生风险,严重影响患者预后.明确低水平病毒血症的危害,探索阐明其发生机制,从而辅助调整个体化治疗方案,是目前的研究热点及难点.本文就低水平病毒血症相关的病因、危害及治疗等方面的研究进展进行阐述,以期为该类患者的诊疗提供参考.     

新基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6基因启动子转录活性的调节

目的探讨丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白反式激活基因TAHCCP1编码蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。方法以我室前期克隆的TAHCCP1基因表达谱芯片结果为基础,利用生物信息学方法确定NS3TP6基因的启动子区域（NS3TP6-p）,聚合酶链反应（PCR）扩增并克隆至真核报告载体pCAT3-basic中,构建重组报告质粒pCAT3-NS3TP6-p;以该质粒单独或与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1共转染肝癌细胞系HepG2细胞,用酶联免疫吸附法（ELISA）检测氯霉素乙酰转移酶（CAT）的表达活性;观察细胞中表达的TAHCCP1蛋白对NS3TP6启动子转录活性的调节。结果构建的重组表达载体pCAT3-NS3TP6-P在HepG2细胞中能够启动报告基因CAT表达,表明克隆的NS3TP6启动子有指导下游基因转录表达的活性;共转染实验中pCAT3-NS3TP6-p与pcDNA3．1（-）-TAHCCP1组CAT的表达活性是对照组的3．1倍,说明TAHCCP1蛋白能够在转录水平反式激活NS3TP6基因启动子活性。结论本实验验证了基因芯片的实验结果准确性,进一步完善了新基因TAHCCP1的生物学功能,为深入理解HCV核心蛋白的反式激活调节机制提供了新的依据。     

应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒表面抗原大蛋白的下调基因

目的筛选与克隆乙型肝炎表面抗原大蛋白(LHBs)的下调基因,以阐明HBV感染相关性疾病的分子生物学机制.方法应用常规分子生物学方法,克隆LHBs基因,构建真核表达质粒pcDNA3.1(-)-LHBs.将pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染肝癌细胞系HepG2,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性.分别以pcDNA3.1(-)-LHBs以及pcDNA3.1(-)转染HepG2细胞,提取mRNA并逆转录为cDNA,来源于pcDNA3.1(-)-LHBs转染细胞的cDNA为驱动(driver),来源于pcDNA3.1(-)的cDNA为测试(tester),进行抑制性消减杂交分析,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆进行测序及同源性分析.结果 ①成功构建pcDNA3.1(-)-LHBs真核表达载体;②pcDNA3.1(-)-LHBs与pCAT3-promoter共转染HepG2细胞的CAT表达活性较对照组的活性明显下降(P＜0.01),抑制率达93.9%;③成功构建人LHBs下调基因的cDNA消减文库.通过生物信息学分析获得14种编码基因.结论 LHBs是HBV基因组编码的一种反式调节因子,可以下调SV40早期启动子的活性.筛选到的LHBs下调的cDNA全长序列,包括与抗氧化防御、细胞生长调节、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,以此可以推测LHBs存在的调控机制以及HBV的致病(癌)机制.     

乙型肝炎肝硬化患者108例预后分析

目的比较MELD评分系统、CTP评分分级标准及并发症在判断乙型肝炎肝硬化患者短期(6个月)预后中的作用。方法分析108例乙型肝炎肝硬化患者的病历资料,随访6个月时转归,将患者分为存活组和死亡组。分析两组患者MELD分值、CTP评分分级,并运用ROC曲线评价两者预测能力。分析并发症数量与预后的关系。结果108例患者随访6个月时共有22例死亡。平均MELD分值存活组为11.6±6.3,死亡组17.6±7.5(P<0.01)。存活组和死亡组MELD≤9、10~19、20~29、≥30分患者分别为34例、41例、8例、1例和4例、9例、7例、2例(P<0.01);MELD<18、≥18分组分别为68例、16例和8例、14例(P<0.01)。平均CTP分值存活组为10.9±2.3,死亡组9.1±2.2(P<0.01)。存活组和死亡组CTP分级A级、B级、C级患者分别为13例、36例、37例和0例、4例、18例(P<0.01)。存活组并发症数量为0、1、2、3的患者为20例、52例、14例、0例,死亡组为4例、9例、7例、2例(P=0.01)。MELD分值和CTP评分分级判断6个月病死率的ROC曲线下面积分别为0.735和0.720,两者之间的差异无统计学意义。结论MELD≥18分为预测乙型肝炎肝硬化患者6个月病死率的独立因素;MELD与CTP相比,二者判断预后能力无显著差异。并发症数量与患者预后有关。     

酵母双杂交技术筛选研究乙型肝炎病毒DNA聚合酶TP结合蛋白

目的筛选与乙型肝炎病毒 DNA 聚合酶-N末端蛋白(TP)相互结合的肝细胞蛋白,进一步探讨 TP 的生物学功能。方法酵母双杂交相关实验材料购自美国 Clontech公司,其中 pACT2为人肝配合表达的 cDNA 文库(HumanLiver MATCHMAKER cDNA Library),产品号为 HL4024AH。pGBKT7-53和 pGADT7-T 中的 p53和大 T 抗原在酵母双杂交试验中相互作用,为阳性对照,pGBKT7-Lam 中的 Lamin C既不与其他蛋白形成复合物又不与大多数蛋白发生反应,为阴性对照。含有 AF384372 HBV DNA P 全基因组 cDNA 的质粒 G318A7由解放军第三○二医院传染病研究所基因治疗研究中心合成并保存。TP 基因的上下游引物序列分别为:5′-GAA TTC ATG ATG CCC CTA TCT TAT CAA-3′,5′-GGA TCCTFA CTC TTG TTC CCA AGA ATA-3′,下划线部分为引物两端内切酶 EcoRI 和 BamHI 的酶切位点。引物合成及 DNA 测序由上海博亚公司完成。用聚合酶链反应(PCR)技术扩增 TP片段,连接人酵母表达载体 pGBKT7中构建诱饵质粒,用醋酸锂法转入酵母细胞 AH109并在其内表达,挑取在 SD/-Trp 培养基上的转化子-即 pGBKT7-TP(AH109)(计数大于1×10~9个细胞/ml),与转化了人肝 cDNA 文库质粒 pACT2的酵母细胞 Y187配合,生长6～18 d 后把长出的>2 mm 的酵母集落,在铺有 X-α-gal 的 QDO 培养基上检查α-gal 活性,蓝色菌落为真阳性集落。挑取阳性集落提取酵母质粒,以复杂冰冻高效感受态方法转化大肠埃希菌,于含有氨苄西林的 SOB 平板培养,所获得的菌落酶切鉴定后测序。提交 GenBank 分析。结果成功得到47个与 TP 特异性结合的阳性克隆,28个克隆与已知基因的部分序列高度同源(96%～100%),含21种目的基因,其余19个克隆基因为假设蛋白(hypothetical pro-tein)。筛选出的目的基因包括有:固醇调节元件结合蛋白1;UDP 糖基转移酶1家族多肽 A9;CD14抗原;B 糖蛋白血液结合素;Ⅰ类乙醇脱氢酶γ多肽;WW 域结合蛋白2;醛脱氢酶1;延伸因子2;S 蛋白基因;补体成分8,α多肽(C8A);唾液酸糖蛋白受体2,转录变异体3;肉毒碱酰基转移酶,转录变异体3;血浆铜蓝蛋白(CP);β激活素 E 亚基;Z 蛋白依赖性蛋白酶抑制剂前体;前列腺特异性膜抗原基因;11号染色体,克隆 RP11-107P7;RNA 聚合酶Ⅱ亚单位 hsRPB7 mRNA;跨膜蛋白4超家族成员2;跨膜蛋白14 A;铁蛋白 L 链。19个假设蛋白的同源性在97%～100%。结论 TP 蛋白可以与肝细胞内某些已知和未知功能蛋白相互结合,提示其具有较广泛的生物学功能。     

慢性丙型肝炎的治愈之路

HCV是慢性肝病的致病因素之一,自从直接抗病毒药物(direct-acting antiviral agent,DAA)相继上市以来,慢性丙型肝炎的治疗领域发生了迅猛的变化,所有慢性丙型肝炎患者似乎都可以通过DAA来"治愈"。然而我们也必须清楚的意识到HCV的清除并不能代表慢性HCV感染相关性肝病的治愈,本文就治愈丙型肝炎道路上面临的机遇与挑战作一评述。     

肝纤维化无创诊断研究进展

慢性肝脏疾病是一个全球性的重大公共健康问题,肝纤维化是疾病发展中关键病理阶段之一,其分期及程度对肝病的治疗和预后起决定性作用。近年来,随着新型无创诊断方法的不断涌现,其在很大程度上取代了肝穿刺活检来评估慢性肝病的严重程度。这些方法大致可分为以下两类:基于血清生物标志物的"生物学"方法和基于弹性成像技术的"物理学"方法。本文将对常见肝病中肝纤维化的无创诊断方法的相关研究进展进行简要综述。     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。