乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP4的克隆化研究

目的 筛选并克隆乙型肝炎病毒X蛋白(HBxAg)反式激活新型靶基因。方法 以HBxAg表达质粒pcDNA3．1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现,其中之一为新型基因片段,与GenBank(中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列。从转染了pcDNA3．1(-)-X的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为348个核苷酸(nt),编码产物由116个氨基酸残基(aa)组成,并测序证实,命名为XTP4,在Gen-Bank中注册,注册号为AF490253。结论 通过分子生物学技术与生物信息学技术的结合,发现并鉴定、克隆HBxAg反式激活作用的新型靶基因XTP4,为进一步研究HBxAg反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础。     

噬菌体展示技术筛选乙型肝炎病毒X抗原基因启动子DNA结合蛋白

目的筛选乙型肝炎病毒（HBV）X抗原基因启动子（Xp）DNA结合蛋白,为HBV复制机制研究探索新的途径。方法应用噬菌体展示技术,以HBV-Xp的PCR产物DNA作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”筛选,经噬斑的PCR扩增后,构建克隆载体,最后对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性搜索。结果噬菌体经富集后,从随机筛选的30个克隆中得到17个阳性克隆,成功构建了克隆载体。经测序分析及序列比对,最后得到5种已知基因编码蛋白（人血白蛋白、还原型烟酰胺二核甘酸脱氢酶亚型4、激肽酶原、泛素特异性蛋白酶10、睾丸增强因子转录子）和9种未知功能基因序列。结论从噬菌体人肝cDNA文库筛选得到多种具有不同生物学功能的蛋白,与HBVX抗原基因启动子具有结合作用。     

基于中医“同身寸”理念修正门静脉直径对肝硬化门静脉高压症的提示效能

目的：基于中医“同身寸”理念,对以门静脉直径（PVD）≥1.3 cm作为提示门静脉高压症（PHT）的临界值进行个体化评估,说明PVD存在较大个体差异性,PVD在肝硬化不同个体应该存在不同临界值。方法：本研究基于文献学调研及2010年1月至2019年12月解放军总医院第五医学中心收治的640例肝硬化患者。将640例肝硬化患者分为PHT组（531例）和非PHT组（109例）,其中PHT组有75例肝硬化患者行肝静脉压力梯度（HVPG）测定。在640例患者中,有168例患者通过收集既往病历获得了其未出现门脉高压前正常状态下PVD。结果：非PHT组中有86例患者的PVD≥1.3 cm。75例行HVPG测定的诊断为PHT的患者中,有7例有严重PHT患者的PVD<1.3 cm。在168例患者中,通过PVD≥1.3 cm作为临界值提示PHT与通过PVD个体化（△D）为修正提示PHT的ROC曲线下面积分别为0.692和0.763。△D与直接以PVD≥1.3 cm作为提示临界值的Z检验结果为Z=2.824,P<0.05。结论：通过对肝硬化患者门静脉宽度进行个体化修正,其PVD对肝硬化PHT的提...     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5B反式激活基因的克隆化研究

目的：应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白5B（HCV NS5B）转染细胞差异表达cDNA消减文库，克隆HCV NS5B蛋白反式激活相关基因。方法：以HCV NS5B表达质粒pcDNA3.1（-）-NS5B转染HepG2细胞，以空载体pcDNA3.1（-）为对照，制备转染后的细胞裂解液，提取mRNA并逆转录为cDNA，进行抑制性消减杂交（SSH）分析。随机挑取克隆进行测序及同源性分析。结果：文库扩增后得到35个阳性克隆，经菌落PCR分析显示其中26个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段。测序及同源性分析，显示16种已知基因编码蛋白和1种未知功能基因序列，包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因，可能是NS5B反式激活靶基因。结论：成功构建了HCV NS5B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库，为进一步阐明HCV NS5B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据。     

应用基因表达谱芯片技术筛选HBV前-S2蛋白反式调节基因

目的：乙型肝炎病毒(HBV)前-S2蛋白是由HBV—S基因编码的具有多种功能的蛋白质。前-S2蛋白的表达对于HBV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响。为了研究前-S2蛋白反式调节的靶基因，本实验应用基因芯片技术对于pcDNA3．1(-)和pcDNA3．1(-)-preS2分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析。方法：以含有HBV全基因组的质粒G．376—7(GenBank号：AF384371)作为模板，应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增前-S2蛋白编码基因片段，以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3．1(-)-preS2。以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2，提取总mRNA，逆转录为cDNA．，与转染空白表达载体pcDNA3．1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较。结果：构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定，证实准确无误，提取高质量的总mR—NA并进行逆转录成为cDNA，进行DNA芯片技术分析。在1152个基因表达谱的筛选中，发现有42个基因表达水平显著上调，36个基因表达水平显著下调。结论：HBV的前-S2蛋白是一种反式激活因子，前-S2基因的表达对肝细胞基因表达谱有显著影响。     

血友病A病人出血的预防及护理

血友病 A是由于凝血因子 (抗血友病因子 )缺乏或功能缺陷所引起的性联遗传性疾病 ,为性染色体隐性遗传。主要表现为出血倾向 ,以创口持续而缓慢地渗血、肌肉血肿、关节腔出血为常见症状 ,常反复发作 ,致慢性血友病性关节炎 ,造成永久性关节破坏、畸形、活动受限而致残。我院于 1 992年 5月至1 999年 1 2月收治血友病 A病人 1 8例 ,现将出血的预防及护理报告如下。1　临床资料1 8例均为男性 ,年龄 2～ 2 3岁 ,平均 1 1 .5岁。实验室检查 :1 8例病人的凝血酶原时间 (PT)、凝血酶时间 (TCT)、出血时间 (BT)、血小板计数均正常 ,活化部分凝…     

阿德福韦酯及拉米夫定治疗乙肝肝硬化的研究

目的探讨联合使用阿德福韦酯与拉米夫定在乙型肝炎肝硬化失代偿期病人中抗病毒治疗的安全性与疗效,从而寻找更加有效的治疗方法。方法应用前瞻性随机分组的方法,对64例乙型肝炎肝硬化失代偿期患者随机分成两组。A组予阿德福韦酯（10mg/d）联合拉米夫定（100mg/d）治疗;B组予阿德福韦酯（10mg/d）治疗;直至治疗结束。以上两组的疗程均为48周, 分别在治疗的12、24、36和48周抽血,检测各组血清ALT、HBeAg、HBV DNA及child分级变化。结果治疗结束后,两组患者HBV DNA阴转率为87.1%及78.8%,有效率分别为96.8%及87.9%;HBeAg阴转率分别为83.9%及57.6%;HBeAg/抗- HBe血清转换率分别为41.9%及24.2%;血清ALT复常率分别为96.8%及97.0%。结论联合用药可减少耐药的发生,并可增加抗病毒效果,且其安全性良好,但需扩大样本进一步研究。     

1121例慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区的耐药突变分析

目的 分析大样本慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶基因上的多位点核苷(酸)类似物的耐药相关突变情况及其临床意义.方法 提取1 121例患者血清HBV DNA,采用巢式PCR方法 扩增HBV反转录酶(RT)基因,对PCR产物进行DNA双向测序,对12个位点上的耐药相关突变进行检测,并结合临床资料进行分析.结果 检出拉米夫定(LAM)耐药突变228例,阿德福韦(ADV)耐药突变32例,恩替卡韦(ETV)耐药突变13例,替比夫定(L-dT)耐药突变4例.多药耐药5例.LAM耐药突变中以M204V和M2041最常见,前者通常伴随U80M突变,后者常单独出现;ADV耐药突变中以N236T±A181位碱基替换为主;ETV耐药突变发生在LAM耐药基础上,以T184位碱基替换为主;L-dT的耐药突变为M2041.结论 用基因序列测定法检测HBV RT基因多位点耐药相关突变,有助于临床及时发现乙肝患者是否存在HBV基因耐药,合理进行抗病毒治疗.     

原发性肝癌患者肝静脉压力梯度与门静脉压力梯度相关性研究

目的 探讨原发性肝癌患者肝静脉压力梯度（hepatic vein pressure gradient, HVPG）与门静脉压力梯度（portal pressure gradient, PPG）相关性。方法 161例原发性肝癌患者在TIPS术中测量下腔静脉压力（inferior vena cava pressure,ICVP）、肝静脉自由压（free hepatic vein pressure, FHVP）、肝静脉楔压（wedged hepatic vein pressure, WHVP）和门静脉压力（portal vein pressure, PVP）,计算HVPG(HVPG=WHVP-FHVP)和PPG(PPG=PVP-IVCP)。结果 161例患者HVPG为（20.18±9.22）mmHg,PPG为（26.44±6.82）mmHg,2者无相关性（r=0.112）;PPG明显高于HVPG (P <0.05)。HVPG与PPG相差在5 mmHg以上者90例,占55.9%,HVPG与PPG相差在5 mmHg以内者71例,占44.1%。球囊阻断肝静脉造影有肝内静脉-静脉侧支分流（in...