隐匿性HBV感染患者HBVS基因突变特点及突变病毒株致瘤性研究

目的 研究肝病人群中隐匿性HBV感染(occult hepatitisB virus infection,OBI)患者HBVS基因主要亲水区(major hydrophilic region,MHR)的突变特点及突变病毒株的致瘤性。方法 回顾性分析2011年9月—2016年3月中国人民解放军总医院第五医学中心血清库中收集的10359例样本及其患者临床资料,分析OBI检出率及其HBVS基因MHR突变特点。通过细胞增殖、平板克隆、细胞划痕、细胞小室迁移和细胞周期等实验方法,分析1株典型的新型突变病毒株的致瘤性。结果 筛查出血清HBsAg阴性及HBVDNA阳性的OBI患者14例,OBI检出率为0.191%(14/7323)。14例患者中检出9种MHR突变类型,其中新发现126-127“RPCMNCTI”插入和F161S2种突变。细胞肿瘤表型实验结果显示,与空载体对照组和野生组细胞相比,突变组细胞的增殖、克隆形成和迁移能力均明显增加(P均<0.05)。结论 本研究显示肝病人群中有较高的OBI检出率,且多数患者可检出文献报道的OBI相关突变。HBVS基因126-127“RPCMNCTI”插入新型突变具有促进肿瘤生长的细胞生物学特点,可能会增加慢性HBV感染患者向肝癌进展的潜在风险。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B反式激活基因的克隆化研究

目的应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)转染细胞差异表达cDNA消减文库,克隆HCV NS4B蛋白反式激活相关基因.方法以HCV NS4B表达质粒pcDNA3.1(-)-NS4B转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,进行抑制性消减杂交分析.将富集的二次PCR产物与T/A载体连接,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑取克隆聚合酶链反应(PCR)扩增后进行测序及同源性分析.结果文库扩增后得到33个阳性克隆,经菌落PCR分析显示其中28个克隆含有大小不等的200～1000 bp插入片段.测序及同源性分析显示,12种已知基因编码蛋白,包括一些与细胞周期、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因,可能是NS4B反式激活靶基因.结论成功构建了HCV NS4B反式激活基因差异表达的cDNA消减文库,为进一步阐明HCV NS4B反式调节的靶基因在肝炎、肝纤维化和肝细胞癌发生的分子生物学机制提供理论依据.     

应用抑制性消减杂交技术筛选HBeAg结合蛋白1反式激活基因

目的筛选与克隆HBeAg结合蛋白1(HBEBP1)新基因的反式激活基因,了解其可能存在的调节功能线索。方法应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆HBEBP1反式激活的新型靶基因。以HBEBP1表达质粒pcDNA3．1(-)-HBEBP1转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3．1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与2种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T／A载体连接,构建cDNA消减库,并转染大肠杆菌进行库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建人HBEBP1反式激活基因差异表达的cDNA消减库。库扩增后得到85个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。对26个插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得15种编码基因,包括14种已知基因和1种未知基因。结论筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBEBP1可能存在的调控机制的线索。     

补阳还五汤加减治疗气虚血瘀型眩晕疗效及对患者脑血流动力学、血浆神经肽Y、D-二聚体水平的影响

目的:研究补阳还五汤加减治疗气虚血瘀型眩晕的疗效及对脑血流动力学、血浆神经肽Y(NPY)、D-二聚体(D-D)水平的影响。方法:选择99例气虚血瘀型眩晕患者,随机数字表法分为对照组(49例)和研究组(50例),前者给予常规治疗,后者在其基础上给予补阳还五汤加减治疗。比较两组患者治疗前后中医症候积分、脑血流动力学、血液流变学指标以及血浆NPY、D-D水平,并评估疗效和安全性。结果:研究组与对照组治疗有效率比较,差异有统计学意义(P<0.05); 治疗前两组患者各项中医症候积分比较,均无统计学差异(P>0.05),治疗后研究组与对照组比较,均有统计学差异(P<0.05); 治疗前两组患者脑血流动力学指标比较,均无统计学差异(P>0.05),治疗后研究组和对照组比较,均有统计学差异(P<0.05); 治疗前两组患者血液流变学指标比较,均无统计学差异(P>0.05),治疗后研究组与对照组比较,均有统计学差异(P<0.05); 治疗前两组患者血浆NPY、D-D水平比较,均无统计学差异(P>0.05),治疗后研究组与对照组比较,均有统计学差异(P<0.05); 两组均无明显不良反应发生。结论:补阳还五汤应用于气虚血瘀型眩晕患者安全有效,可促进其临床症状的改善,该药的作用机制可能与改善脑血流动力学,降低血液黏稠度和血浆NPY、D-D水平有关。     

慢性丙肝治疗的难点和对策

慢性丙型肝炎病毒感染可以导致肝硬化及肝癌,是严重的公共卫生问题,近些年来,丙肝抗病毒药物发展迅猛,治疗方法简单、效果显著,一般患者病毒持久应答率将近100%,并彻底解决了病情进一步进展的后顾之忧。一些特殊患者如HCV导致的失代偿期肝硬化、既往DAA治疗失败、合并严重肾功能不良等患者是目前治疗的难点;另一个更重要且急迫的问题是我国慢性HCV感染患者约980万,诊断率不足20%,治疗率更低,如何唤醒这些患者,是全社会的大问题。加强卫生宣传教育,实现患者早诊早治,对疑难复杂患者进行正规治疗等是未来需要重点解决的问题。     

乙型肝炎肝硬化患者血浆D-二聚体水平变化的临床意义

目的评估血浆D-二聚体水平与乙型肝炎肝硬化患者病情严重程度的相关性及诊断门静脉血栓形成(PVT)的价值。方法收集2018年1月-12月就诊于解放军第五医学中心的500例乙型肝炎肝硬化患者的临床资料,根据血浆D-二聚体水平是否正常分为正常组(n=217)和升高组(n=283),比较两组患者血浆D-二聚体水平与Child-Pugh分级、MELD评分的相关性。正态分布的计量资料两组间比较采用t检验。非正态分布的计量资料两组间比较采用Mann-Whitney U检验;多组间比较及进一步两两比较均采用Kruskal-Wallis H检验。计数资料两组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman相关分析。利用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析评价D-二聚体水平对乙型肝炎肝硬化患者PVT的早期预警效能。结果两组患者D-二聚体水平、ALT、AST、TBil、Alb、Child-Pugh分级、MELD评分、PVT发生率比较,差异均有统计学意义(P值均<0.05)。相关性分析结果显示,两组患者血浆D-二聚体水平与Child-Pugh分级、MELD评分均呈正相关(r值分别为0.463、0.455、0.214、0.756,P值均<0.05)。共50例乙型肝炎肝硬化患者合并PVT,PVT阳性患者的D-二聚体水平明显高于PVT阴性患者[1.96(0.82~4.91)mg/L vs 0.61(0.19~1.54)mg/L,Z=-6.02,P<0.001]。ROC曲线分析结果显示,最佳诊断界值为0.76 mg/L,ROC曲线下面积和95%可信区间为0.758(0.719~0.796)。结论D-二聚体水平与乙型肝炎肝硬化患者的病情严重程度密切相关,可作为判断乙型肝炎肝硬化患者预后的指标。对于D-二聚体水平升高的患者,需警惕PVT的可能。     

乙型病毒性肝炎患者自行停用抗病毒药物治疗的体验

目的探讨乙型病毒型肝炎患者自行停用抗病毒药物治疗的原因。方法 2015年6月至2017年6月,采用目的性抽样法选取在解放军第302医院治疗期间自行停用恩替卡韦分散片抗病毒治疗的乙型肝炎患者10名为研究对象。采用质性研究中的半结构访谈法,对其进行深入访谈,使用内容分析法对资料进行分析。结果乙型病毒性肝炎患者自行停药的原因共提炼出5个主题:疾病治疗认知不清;医保购药结构限制;考虑生育问题;患者自身工作原因;经济负担大。结论服用抗病毒药物治疗病毒性肝炎前患者要进行全面系统的检查,医生要针对特殊情况对其进行指导用药,以避免患者自行停药,从而提升其抗病毒药物治疗病毒性肝炎的效果。     

肝再生增强因子对细胞周期素依赖性激酶1基因表达的影响

目的研究人肝再生增强因子(ALR)对细胞周期素依赖性激酶1启动子(CDK1p)转录调节的作用,探讨ALR的生物学作用机制。方法根据GenBank中CDK1p序列的分析设计引物,应用聚合酶链反应(PCR)扩增人CDK1基因启动子基因序列,并克隆至真核报告载体pCAT3-Basic中,构建CDK1启动子报告基因表达载体pCAT3-CDK1p,以该质粒转染HepG2细胞系,并同时与pcDNA3.1(-)-ALR共转染HepG2细胞系,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果 pCAT3-CDK1p组CAT表达活性明显高于pCAT3-basic组,差异有统计学意义,pCAT3-CDK1p与pcDNA3.1(-)-ALR共转染组的CAT表达活性明显低于pCAT3-CDK1p组,差异有统计学意义。结论 CDK1启动子有顺式激活下游基因的活性,ALR对CDK1基因有下调作用。     

G1764A/C1766T/T1768A三联突变对HBV核心启动子活性的上调作用研究

目的 构建乙型肝炎病毒(HBV)核心启动子(CP)荧光素酶表达载体,探讨HBV CP变异对下游基因转录活性的影响.方法 2005年5月至2008年3月于解放军302医院就诊的慢性乙型肝炎(CHB)及慢加急性肝衰竭(ACLF)患者各40例,采集血清提取HBV DNA,采用巢式PCR法扩增HBV CP片段,克隆至pGEM-T Easy载体.挑选含有CP相关变异位点的质粒,经Kpn Ⅰ/Bgl Ⅱ双酶切后,构建pGL3-CP荧光素酶真核报告质粒,并采用定点突变方法获得野生型质粒,将两者同时转染肝癌细胞系HepG2,48h后进行荧光素酶检测.结果 患者临床资料经统计分析后显示,CHB患者HBeAg阳性率和HBV DNA载量均高于ACLF患者(P<0.01),而TBIL含量则低于ACLF患者(P<0.01);对CP区热点突变频率分析后发现:G1764A/C1766T/T1768A三联突变在CHB患者中为0.0%(0/40),在ACLF患者中为12.5%(5/40,P<0.05).细胞转染结果显示:典型CP双联突变A1762T/G1764A病毒株的启动子活性为相应野生株的1.67倍,而G1764A/C1766T/T1768A三联突变病毒株的启动子活性为相应野生株的1.43～1.80倍.结论 HBeAg阳性率、TBIL水平、HBV DNA载量与乙型肝炎重症化相关,HBV CP中存在的A1762T/G1764A、G1764A/C1766T/T1768A突变有顺式激活下游基因转录活性的作用.