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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B基因酵母表达载体的构建及表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS4B基因的酵母细胞表达载体,为探索HCVNS4B在细胞内的相互作用蛋白奠定基础。方法:用多聚酶链反应(PCR)的方法在HCV全长质粒pBRTM/HCV-1为模板扩增HCVNS4B基因,克隆到pGEM-T载体中,双酶切后回收连接到酵母表达质粒pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质,进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和Western免疫印迹分析。结果:成功构建HCVNS4B基因酵母表达载体,Western免疫印迹分析显示了HCVNS4B在酵母细胞中融合表达。表达产物在胞内存在,融合蛋白的相对分子量约为48ku左右。结论:HCVNS4B蛋白在酵母中表达成功。 相似文献
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磷脂酶A2(Phospholipase A2,PLA2)是一类能水解磷脂,广泛存在于生物组织,细胞利体液的酶,与多种生理和病理过程有关,它能特异性催化磷脂甘油分子第二位酰基水解的脂解酶,可将磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸等水解为一系列生物活性介质。在消化、炎症和细胞内、外信号转导过程中涉及了不同形式的PLA2。 相似文献
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目的 应用噬菌体展示技术筛选HBV前-S1蛋白反式激活基因1(PS1TP1)的启动子DNA结合蛋白,进一步阐述PS1TP1在慢性乙型肝炎发病机制中的作用.方法 根据GenBank中的PS1TP1启动子DNA序列设计引物,运用PCR技术以人基因组DNA为模板,扩增获得PS1TP1启动子的DNA片段,并通过亚克隆方法构建真核报告载体pCAT3-PS1TP1p后转染HepG2细胞系,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测转染细胞中氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性,以验证所获得的DNA片段具有启动子活性;将PS1TP1启动子DNA片段进行固相化,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行筛选,将所获得的噬斑裂解液进行PCR扩增,测序后进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索.结果 pCAT3-PS1TP1p瞬时转染的HepG2细胞中CAT表达活性是对照组(pCAT3-Basic空载体)的32.9倍,是pCAT3-promoter的4.2倍,提示所获得的DNA片段具有启动子活性;经4轮筛选共得到阳性克隆18个,经PCR扩增、测序,并经生物信息学分析后筛选出PS1TP1的启动子DNA结合蛋白编码基因共15个.结论 PCR扩增后所获得的PS1TP1启动子DNA片段具有顺式激活下游基因表达的作用,为研究PS1TP1启动子功能奠定了基础;噬菌体展示筛选结果提示PS1TP1可能参与了细胞周期调节、MAPK信号转导通路,并且有可能在辅助性T细胞亚群的发育和B细胞分化过程中发挥作用. 相似文献
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应用抑制性消减杂交技术筛选乙型肝炎病毒e抗原调节基因 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 筛选与克隆HBeAg激活基因,了解其在体内的凋节功能线索。方法 以HBeAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBeAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为eDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染人肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果 成功构建人HBeAg激活基因差异表达的cDNA消减文库。文库扩增后得到40个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200~800bp插入片段。对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得12种编码基因,包括11种已知基因和1种未知基因。结论 筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因,推测了HBeAg在体内可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明。 相似文献
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