MPP+诱导PC12细胞损伤的蛋白质组学研究

目的研究Mpp~ 作用PC12细胞48h后蛋白质表达谱的改变,进一步在蛋白质水平上阐明帕金森病的发病机制。方法建立Mpp 诱导的PC12细胞帕金森病模型,提取对照组与实验组的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统构建双向电泳图,DeCyder软件分析蛋白表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定差异蛋白质。结果与对照组相比,实验组共有32个蛋白点发生变化;鉴定了其中7种结构和功能各异的蛋白。结论本研究鉴定出氧化应激和线粒体损伤相关的蛋白thioredoxin、MPPs,与细胞骨架相关的蛋白NF-L、ezrin,具有分子伴侣活性的蛋白NAC、crystaillin,与免疫炎症相关的蛋白gClqBP。这些蛋白的显著改变可能与PD的发病机制密切相关。     

NGF诱导PC12细胞早期分化的DIGE分析

目的筛选神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)处理后PC12细胞分化早期相关蛋白,寻找NGF药物作用靶点,为深入进行神经保护药物的研发提供理论依据。方法在建立NGF诱导PC12细胞分化模型的基础上,分别提取NGF处理前后的细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳(Differential Gel Electrophoresis,DIGE)系统获得蛋白点表达差异信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质。结果NGF处理组有7个蛋白点发生变化;通过数据库检索,鉴定了3种结构和功能各异的蛋白。结论eEF-2、Rab GDIα和DPP与NGF诱导PC12细胞分化早期过程有关,可能是NGF的作用靶点。     

蛋白质组学技术鉴定帕金森病模型中的3种新蛋白质

目的 利用蛋白质组学技术对MPP 诱导的PC12细胞帕金森病(PD)模型进行研究,以期发现PD发病机制中的新蛋白.方法 建立MPP 诱导的PC12细胞PD模型并提取细胞总蛋白,荧光差异凝胶电泳(D1GE)进行蛋白样品标记与分离,应用DeCyder软件分析蛋白质差异表达信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定差异蛋白质.结果 质谱分析和数据库检索鉴定了3种可能同PD发病相关但在有关PD研究文献中尚未见报道的新蛋白质,他们分别足与线粒体功能相关的蛋白MPPs,具有分子伴侣活性的蛋白NAC和与免疫炎症相关的蛋白gc1qBP.结论 这些新发现蛋白可能与PD的发病机制密切相关.     

PSI诱导PC12细胞的PD模型中分子伴侣家族的氧化修饰

目的 鉴定蛋白酶体抑制剂(PSI)处理的PC12细胞帕金森病(PD)模型中发生氧化修饰的蛋白质;从蛋白质水平探讨PD的发病机制.方法 本实验分为对照组和实验组.PC12细胞孵育24h后,实验组加入终浓度10 μmol/L的PSI(以DMSO溶解),对照组加入DMSO,继续孵育24h后进行研究.MTT法检测细胞存活率;吖啶橙(AO)和溴化乙啶(EB)染色检测凋亡细胞;HE染色观察细胞内包含体的形成.采用2D凝胶电泳、质谱鉴定与Western blot技术相结合的方法在PD细胞模型中筛选氧化修饰的蛋白质.结果 在实验组中,MTT法检测显示细胞存活率降至85.46%±1.75%(对照组设为100%),差异有统计学意义(P<0.05);AO和EB染色显示早期凋亡细胞,凋亡百分率为12.41%±3.61%(P<0.05);HE染色可见胞浆内嗜酸性包含体的形成.经2D Evolution软件对Western blot图像及考染的制备胶图像进行分析和统计学处理,与对照组比较实验组有统计学意义的氧化水平显著升高的蛋白点有40个,其中13个蛋白点被质谱鉴定出来,其中3个蛋白点为分子伴侣家族成员:含TCPI的伴侣素亚单位3、葡萄糖调节蛋白58及热休克蛋白700结论首次在PD细胞模型中发现分子伴侣家族蛋白的氧化修饰,为PD发病机制的研究提供了新的线索.     

蛋白质组学技术鉴定的PC12细胞的细胞骨架蛋白

目的:使用蛋白质组学的技术手段,鉴定大鼠肾上腺皮质细胞瘤细胞系PC12细胞内的细胞骨架蛋白。方法:提取PC12细胞的蛋白质,建立固相pH梯度双向电泳图谱,应用图像扫描仪及ImageMaster 2D Elite分析软件获得蛋白质点的数字化和匹配性信息,挑选匹配良好的高峰度蛋白点,进行基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)分析,鉴定。结果:用二维电泳技术分离,并用MALDI-TOF-MS成功鉴定出5个PC12细胞的细胞骨架蛋白。结论:PC12细胞蛋白质组中部分细胞骨架蛋白胶图位点的建立,为今后探讨这一类蛋白在神经系统疾病中的作用奠定了基础,并提供了新的侯选治疗靶点。     

王浆蛋白质及其生理药理作用分析

目的 从蛋白质组的角度分析王浆及其生理药理作用,为进一步理解王浆医用价值提供理论基础.方法 提取王浆全蛋白质组分进行双向电泳(2-DE)和质谱鉴定(MALDI-TOF/MS),然后利用蛋白质数据库进行比对.结果 2-DE图谱共检测出152个蛋白点,对其中57个高丰度蛋白进行了MALDI-TOF/MS鉴定,有45个属于王...     

6-羟基多巴胺诱导PC12细胞帕金森模型中GRP78表达的研究

目的 探讨神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导PC12细胞的帕金森（PD）模型中GRP78的表达.方法 在建立6-OHDA诱导PC12细胞帕金森模型的基础上,MTT法测细胞存活率和Hoechst33342染色检测细胞凋亡.分别提取6-OHDA处理组和对照组细胞总蛋白,应用荧光差异凝胶电泳（Differential Gel Electrophoresis,DIGE）技术获得蛋白点的差异表达信息,运用MALDI-TOF质谱鉴定出差异蛋白质.结果 实验组细胞存活率为60%±4.8%,与对照组比较显著下降（P＜0.05）.荧光染色可见细胞核呈固缩状或碎裂状的典型的凋亡形态学改变.DIGE分析发现6-OHDA组表达明显增高的一个蛋白质点,经质谱分析鉴定确认为GRP78.结论 6-OHDA能够诱导PC12细胞凋亡,凋亡过程中GRP78表达增高,提示GRP78增高可能与PD的发病机制有关.     

蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质***☆◆

背景：氧化修饰蛋白质在脑老化及阿尔茨海默病等老年变性神经病的发病机制中扮演着重要角色。蛋白质组学技术可以发现氧化修饰蛋白质,为相关疾病的药物治疗选择新的靶标。 目的：建立以双向电泳结合Western blot及生物质谱技术分离、鉴定人脑氧化修饰蛋白质的方法。 方法：取3个无神经系统疾患的男性脑组织蛋白,第一向等电聚焦电泳后,固相pH梯度胶条同二硝基苯肼反应,然后行第二向SDS-PAGE电泳。2张相同凝胶中的1张行考马斯亮蓝染色,另1张凝胶上免疫荧光显色。同PVDF膜上显色点相对应的考染凝胶上的蛋白质点即为氧化修饰蛋白质。凝胶蛋白胶内酶解,基质辅助激光解析飞行时间串联质谱鉴定氧化修饰蛋白质。 结果与结论：从提取的脑组织中鉴定出β-肌动蛋白、天冬氨酸氨基转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、磷酸甘油酸激酶、1,3-磷酸甘油醛脱氢酶、碳酰还原酶1、磷酸丙糖异构酶、转酮醇酶、丙酮酸激酶、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白质2、热休克蛋白60为氧化修饰蛋白质。说明实验成功建立了用蛋白质组学技术分离及鉴定人脑氧化蛋白质的方法。     

蛋白质组学技术筛选破裂颅内动脉瘤的血清标志物

目的探讨用双向凝胶电泳结合基质辅助激光解析离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)分析技术从血清中筛选颅内动脉瘤标志蛋白的可行性。方法分别采集6例破裂颅内动脉瘤患者和健康成人的血清,进行双向凝胶电泳分离血清总蛋白,考马斯亮蓝染色,全自动斑点处理工作站处理差异蛋白质斑点,MALDI-TOF MS分析获取肽质量指纹图谱,对鉴定的差异蛋白质进行分析。结果两组表达差异2倍以上的蛋白质斑点有81个,质谱鉴定出5个差异蛋白质,在颅内动脉瘤血清中均呈上调表达,即α2-巨球蛋白前体、补体3前体、玻璃黏连蛋白前体、缓激肽和载脂蛋白E3。结论蛋白质组学技术平台为大规模水平筛选破裂颅内动脉瘤血清标志物提供了新方法。     

深低温脑保护的差异蛋白质组学研究

目的应用差异蛋白质组学技术，研究深低温和常温停循环后大鼠海马组织蛋白质的变化。方法采用深低温停循环模型，取大鼠海马组织，通过双向电泳、分离蛋白，然后通过胶内酶切、生物质谱分析差异的蛋白质点，鉴定出变化的蛋白质。结果通过Image Master软件分析报告发现有差异的Ratio值大于1．5的蛋白考染点14个。通过对这些蛋白考染点进行质谱鉴定，鉴定出28个蛋白质，其中4个为同一种蛋白，实际的蛋白数为24个。它们是细胞骨架蛋白、介导代谢的酶类、参与核酸合成、参与氧化应激反应的蛋白质及未知蛋白。结论鉴定出的差异蛋白质可能与深低温脑保护作用有关，某些蛋白质在低温脑保护中的作用尚未报道。     

原发性脑创伤后人脑皮层差异蛋白质组研究

目的应用蛋白质组学技术，研究不同程度脑创伤后的人脑皮层蛋白质组表达变化的情况。方法将临床标本以GCS评分分为中度和重度损伤组，提取脑挫伤部位皮层的总蛋白。通过双向电泳．分离蛋白。应用胶内酶切、生物质谱，鉴定由图像分析软件所得出的具有表达差异的蛋白质点。结果通过比较，目前已发现12个蛋白质点，表达水平具有显著性差异变化。在已鉴定出的蛋白点中，属于10种蛋白质。依其功能可分为：细胞骨架、代谢反应、氧化应激反应、功能未知等几类。在重伤组中，一共有9个蛋白点、6种蛋白表达上调（α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、5’磷酸吡哆醇氧化酶、crtstalin、stathmin-1、NP25）；中度损伤组3个蛋白点、4种蛋白表达上调（谷氨酰胺S转移酶、5’3’核苷酸酶、HSPC108、proapolipoprotein）。结论外伤后，神经系统由于受伤程度的不同，蛋白表达水平会发生变化。原发性脑创伤的损伤程度不同将产生神经系统病生理反应的差异。     

Effects of chronic risperidone treatment on the striatal protein profiles in rats

Extrapyramidal symptoms (EPS) commonly occur as side effects of antipsychotic drugs (APDs) and are most likely to arise when the occupancy of dopamine D(2) receptors in the striatum by these drugs exceeds 80%. We aimed to characterize changes in the protein expression profile in the striatum of rats after chronic (4 week) supra-therapeutic (EPS-inducing) treatment with risperidone (RIS), an atypical antipsychotic drug. Administration of RIS (2.1 mg/kg/day, via subcutaneous osmotic minipumps) induced significant vacuous chewing movements and catalepsy in male Sprague-Dawley rats over a 28-day treatment period compared with a vehicle (VEH) control group (n=12) (Karl et al., unpublished observation). Using two-dimensional gel electrophoresis (2DE), total protein extracts from the rat brain striatum were separated and protein expression was analyzed by Phoretix 2D Expression and Image Beta V4.02 software followed by matrix assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). 2DE gels resolved up to 450 protein spots, presumably different proteins and/or their isoforms. There were 30 protein spots showing statistically significant different densities between the RIS- and VEH-treated groups. All 30 proteins were successfully identified by MALDI-TOF MS, 28 of these were divided into groups based on their known functions. These included metabolic, signaling, transport, protein metabolism, chaperone, DNA binding and cell cycle categories. We conclude that chronic risperidone treatment accompanied by an EPS-like behavioral phenotype results in alterations in the striatal protein profile possibly subsequent to blockade of dopaminergic systems. These results suggest that possible mechanisms involved in APD-induced EPS include metabolic dysfunction and oxidative stress.     

Pick病的蛋白质组研究

目的为深入理解Pick病分子机制并寻找诊断治疗该疾病的蛋白质标记物，选取3例经病理证实的Pick病患者与4例正常老年人尸检脑标本进行蛋白质组学研究。方法死亡24h内新鲜取材的尸检额叶、颞叶蛋白质以固相pH梯度等电聚焦为第一向，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）为第二向进行双向电泳（2-DE），图像分析软件Image Master 2D Elite分析电泳图谱，基质辅助激光解析／电离-飞行时间（MALDI-TOF）质谱或MALDI-TOF／TOF串联质谱鉴定蛋白质。结果15种蛋白质的表达量在Pick病患者与正常老年人显著不同。8个在Pick病表达量上调的蛋白质被鉴定为热休克蛋白60、Mn超氧化物歧化酶、α-烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、胶质纤维酸性蛋白、硫氧还蛋白过氧化物酶1、RNA结合蛋白调节亚基、P25α；7个在Pick病表达量下调的蛋白质被鉴定为pemxiredoxin 5、cofilin、铁蛋白H链、血清白蛋白前体、二氢嘧啶酶相关蛋白2、丙酮酸激酶、碳酰还原酶[NADPH]1。结论氧自由基与抗氧化蛋白的平衡受损及重要代谢酶、神经原纤维缠结相关蛋白的变化同Pick病发病密切相关。     

PC12细胞人工合成蛋白酶体抑制剂的诱导性包含体：6个26S蛋白酶体亚基可能具有蛋白质组学特征

细胞质内被称为路易(小)体(Lewy bodies, LBs）的蛋白质性包含体是帕金森病的主要病理特征,26S蛋白酶体内存于LBs内,但是其存在形式可能是单个亚基或是完整复合体,为了广泛地揭示10 µmol/L人工合成蛋白酶体抑制剂（proteasomal inhibitor,PSI）作用大鼠嗜铬细胞瘤细胞（PC12细胞）48小时后富集在PSI诱导性包含体中的26S蛋白酶体亚基,通过生物化学分级分离（biochemical fractionation）,双向电泳（two-dimensional electrophoresis）和肽质量指纹鉴定（identification via peptide mass fingerprints,PMF)的蛋白质组学方法,我们从PSI诱导性包含体中鉴定了蛋白酶体β5、26S蛋白酶体ATP酶2,26S蛋白酶体ATP酶5、26S蛋白酶体ATP酶6、26S蛋白酶体非ATP酶11和26S蛋白酶体非ATP酶13等6个26S蛋白酶体亚基.这一结果提示当PC12细胞发生蛋白酶体抑制时至少6个26S蛋白酶亚基可能被富集到PSI诱导性包含体中.     

应用DIGE测定帕金森病脑脊液中蛋白变化

目的 测定帕金森病(PD)脑脊液中蛋白的变化,为进一步探索PD的生物标记物提供线索.方法 采用荧光差异凝胶电泳技术分离并筛选PD和正常对照者脑脊液中差异表达蛋白质,用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)或串联质谱技术进行鉴定并分析.结果 共发现20个明显的差异蛋白点,其中11个点在PD中上调,9个点下调.共鉴定出8个蛋白质,其中有3个未知蛋白,均表现为下调.蛋白MYPT1出现明显下调,载脂蛋白原、脂蛋白发生明显上调,载脂蛋白A-I的一个异构体发生上调,一个异构体发生下调.结论 MYPT1与突触功能有关,载脂蛋白原、脂蛋白、载脂蛋白A-I与胆固醇代谢有关,这些蛋白与PD发生有一定关联,有可能成为PD的生物标记物.     

四连接素在帕金森病脑脊液中的表达变化

目的探讨脑脊液中可能的帕金森病（PD）生物标记物。方法采用荧光差异凝胶电泳（DIGE）技术分离并筛选PD患者和正常对照者脑脊液中差异表达蛋白质，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDl-TOFMS）技术进行鉴定并分析，应用Westernblotting进行验证。结果DIGE发现20个明显的差异蛋白点，共鉴定出8个蛋白质。DIGE分析和Westernblotting验证均显示蛋白四连接素在PD患者脑脊液中发生显著下调。结论四连接素可能参与了PD发生，有可能成为PD的生物标记物。