过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪的体外干预

背景：树突状细胞在过敏性紫癜发病机制中可能具有重要的地位。已有报道黄芪在体内可以纠正过敏性紫癜患儿的Th1/Th2失衡,但目前关于黄芪在树突状细胞水平对过敏性紫癜病免疫功能调节的影响尚不清楚。 目的：观察过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞功能变化及黄芪对其的影响。 设计、时间及地点：病例对照分析,于2005-10/2007-12在青岛大学医学院附属医院儿科研究所完成。 材料：急性期过敏性紫癜患儿外周静脉血28份作为过敏性紫癜组,以门诊体检的健康同龄儿童外周静脉血18份作为正常对照组。黄芪水提剂由四川百利药业有限公司提供。 方法：采用密度梯度离心法获取过敏性紫癜患儿及健康儿童外周血单个核细胞,获取的外周血单个核细胞体外经重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α以诱生树突状细胞,并培养8 d,其中过敏性紫癜组又分成2组：对照组和黄芪干预组。 主要观察指标：ELISA法检测过敏性紫癜患儿及健康儿童血浆γ-干扰素和白细胞介素4水平及培养上清液中白细胞介素10,12,18水平,流式细胞仪检测树突状细胞表面CD83、CD86（B7-2）和CD80（B7-1）的表达率。 结果：过敏性紫癜患儿急性期外周血中Th1型细胞因子γ-干扰素水平减少,Th2型细胞因子白细胞介素4水平增加,γ-干扰素/白细胞介素4比值明显降低。过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞经诱导培养的树突状细胞表面CD86表达率较正常对照组明显升高,且两组CD86表达率与血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关,与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈显著负相关;CD80表达率明显低于正常对照组,且两组CD80表达率与血浆γ-干扰素水平及γ-干扰素/白细胞介素4比值均呈显著正相关。过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌白细胞介素12水平低于正常对照组（P < 0.05）,而白细胞介素10,18水平均高于正常对照组（P < 0.05）,两组树突状细胞分泌白细胞介素12水平与血浆γ-干扰素水平皆呈显著正相关(P < 0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈正相关(P < 0.01,P< 0 .05);白细胞介素10分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均< 0.01),与γ-干扰素/白细胞介素比值皆呈负相关(P < 0.01,P < 0.05);白细胞介素18分泌水平与其血浆白细胞介素4水平皆呈显著正相关(P均< 0.01),与γ-干扰素/白细胞介素4比值皆呈负相关(P < 0.01,P < 0.05)。黄芪干预组树突状细胞表面CD83、CD86和CD80的表达率与对照组差异不显著,树突状细胞分泌白细胞介素12水平高于对照组（P < 0.01）,白细胞介素10,18水平均低于对照组（P < 0.05,P < 0.01）。 结论：①过敏性紫癜患儿外周血树突状细胞存在明显功能紊乱,表现为CD86表达率升高、CD80降低,白细胞介素12分泌减少、白细胞介素10 和白细胞介素18增加,上述变化与Th1/Th2失衡关系密切。②黄芪主要是通过改变过敏性紫癜患儿树突状细胞分泌细胞因子的水平来调节其功能。     

系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞生长特性与相关细胞因子的表达

背景：骨髓造血依赖于干细胞所处的造血微环境，其中基质细胞及多种细胞因子在造血中发挥着重要的调控作用。系统性红斑狼疮具有淋巴细胞亚群及相关细胞因子表达，其基质细胞及细胞因子的异常可能导致造血微环境异常，损伤造血功能。 目的：观察体外培养系统性红斑狼疮基质细胞的生长特性及细胞因子白细胞介素6、白细胞介素8的表达，探讨细胞因子与系统性红斑狼疮活动的关系，阐明系统性红斑狼疮慢性病贫血可能的病理机制。 设计、时间及地点：细胞学体外培养，病例-对照观察，于2008-01/12在大连医科大学附属第二医院血液风湿科及血液学实验室完成。 对象：选择大连医科大学附属第二医院血液风湿科收治的活动期系统性红斑狼疮患者15例(实验组)，男1例，女14例，中位年龄32(20~55)岁；合并慢性病贫血者7例，无贫血者8例。另选健康个体10名作为对照，男9名，女1名，中位年龄46(38~57)岁。 方法：取系统性红斑狼疮患者及健康对照者的骨髓液分离单个核细胞培养。 主要观察指标：系统性红斑狼疮患者及健康对照者骨髓基质细胞生长特性及体外培养上清白细胞介素6和白细胞介素8的水平。 结果：系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞较健康对照生长及集落形成均延后，合并慢性病贫血的系统性红斑狼疮患者更加明显，集落内各细胞排列欠规整有序。与健康对照者相比，系统性红斑狼疮患者骨髓基质细胞体外培养上清细胞因子白细胞介素6、白细胞介素8的表达显著升高(P < 0.01)，并且与系统性红斑狼疮的疾病活动呈正相关。 结论：由于系统性红斑狼疮基质细胞可能存在功能的缺陷，并且高表达细胞因子如白细胞介素6、白细胞介素8，损伤了骨髓微环境，最终导致系统性红斑狼疮患者造血功能异常。细胞因子可能成为系统性红斑狼疮疾病活动的标志。     

成骨诱导或干扰素γ预处理对胎儿骨髓源Flk-1+间充质干细胞免疫活性的调节

背景：骨髓间充质干细胞在修复异基因组织最终分化为特定细胞后，理论上会因MHC及共刺激分子上调而引起组织排斥，但实际上并没有发生排斥反应。推测骨髓间充质干细胞在异基因组织分化诱导及炎性因子微环境作用下，有可能分化成一种仍具有免疫调节活性的终末细胞，不被机体的免疫识别系统清除掉。 目的：在体外运用成骨诱导及干扰素γ预处理来模拟体内组织分化及炎性因子微环境，观察在此作用下胎儿骨髓源Flk-1+间充质干细胞是否能够保持其在自然条件下所呈现的免疫学活性。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-09/2008-05在北京协和医学院基础学院完成。 材料：2例骨髓样品取自流产胎儿，由北京回龙冠妇产医院提供。外周血样品取自15~35岁健康志愿者，由北京三○七医院提供。地塞米松等诱导因子和干扰素γ为美国Sigma公司产品。 方法：Ficoll法分离胎儿骨髓单个核细胞，取白环层以上细胞，以1×106/cm2密度接种，贴壁法纯化，采用阴性分选法去除CD45+、GlyA+和CD34+细胞，分离扩增得到Flk-1+骨髓间充质干细胞。以淋巴细胞分离液梯度离心分离外周血单个核细胞，用于混合淋巴细胞培养实验及有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖实验。 主要观察指标：流式细胞仪鉴定细胞表型，用成骨、成脂、成软骨和成内皮诱导液检测其分化潜能，成骨诱导或干扰素γ预处理后细胞表面抗原表达、对淋巴细胞增殖及活化抗原CD69、CD25表达的影响，对白细胞介素10和转化生长因子β分泌水平的影响。 结果：光镜下骨髓来源的间充质干细胞为成纤维细胞样贴壁生长，均高表达Flk-1，同时高表达黏附分子CD29、CD44、CD105，造血细胞标志CD34、CD45呈阴性；可向成骨、成脂肪、成软骨和成内皮方向分化；低表达MHC-Ⅰ类分子，不表达　　　　MHC-Ⅱ类分子，成骨诱导能上调MHC-Ⅰ表达，干扰素γ预处理可上调MHC-Ⅱ表达。骨髓源Flk-1+间充质干细胞经成骨诱导7 d或干扰素γ预处理48 h后，仍呈低免疫原性，不激发异基因淋巴细胞增殖，抑制植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖效果明显增强（t=2.57，P < 0.05），可进一步抑制CD69和CD25的表达，ELISA检测显示其培养上清分泌白细胞介素10水平增强（t=2.66，P < 0.05），但分泌转化生长因子β水平经成骨诱导后无明显变化，干扰素γ预处理后则明显升高。 结论：经成骨诱导或干扰素γ预处理后，骨髓源Flk-1+间充质干细胞仍能保持低免疫原性，且免疫调节活性进一步提高。     

体外条件下人骨髓间充质干细胞与NZBW F1鼠T淋巴细胞的免疫调节

背景：近年研究发现系统性红斑狼疮患者的间充质干细胞存在异常,自体造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮复发率高,有学者提出系统性红斑狼疮不仅是造血干细胞病,也是间质干细胞病。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞在体外对NZBW F1鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用。 设计、时间及地点：细胞共培养体外实验,于2008-03/09在江苏大学附属医院中心实验室完成。 材料：健康人骨髓由江苏大学附属医院研究生自愿捐献。SPF级20周龄NZBW F1雌鼠9只,购自南京大学动物模式研究所。 方法：Percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,取P3代细胞用于实验。20周龄NZBW F1小鼠适应性饲养至24周龄时,无菌分离脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A刺激下,将T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞分别以不同比例(1∶0.01,1∶0.02,1∶0.1)共培养72 h,并设立对照组。 主要观察指标：MTT法检测T淋巴细胞增殖,流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡和CD69,CD28表达,实时荧光定量PCR检测T淋巴细胞白细胞介素10、干扰素γ mRNA水平。 结果：与对照组比较,在体外人骨髓间充质干细胞能抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P < 0.05)。与对照组比较,T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.02和1∶0.1时,骨髓间充质干细胞可抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进T淋巴细胞干扰素γ mRNA表达,抑制白细胞介素10 mRNA表达;T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.01时,T淋巴细胞凋亡情况和干扰素γ、白细胞介素10 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：人骨髓间充质干细胞体外在一定比例下可能通过抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖和凋亡、干预Th1/Th2细胞因子mRNA表达,继而下调T淋巴细胞的免疫功能。     

脐带间充质干细胞移植对系统性红斑狼疮免疫系统的影响

背景：目前有关脐带间充质干细胞对系统性红斑狼疮的免疫抑制作用及对各个脏器的影响报道较少。 目的：探讨脐带间充质干细胞治疗MRL/lpr狼疮鼠的疗效及对免疫系统和各个脏器的影响。 方法：MRL/lpr狼疮小鼠随机分为对照组、环磷酰胺组、环磷酰胺+脐带间充质干细胞组、脐带间充质干细胞组。对照组给以生理盐水,其他各组分别给予相应的治疗。采用考马斯亮蓝法检测24 h尿蛋白定量;酶联免疫吸附法检测白细胞介素10、白细胞介素17、干扰素γ、PDGF、 抗ds-DNA抗体;间接免疫荧光法检测抗核抗体水平;常规病理苏木精-伊红染色观察小鼠的肾脏病理改变肾脏病理改变;免疫组织化学法检测间充质干细胞表面标志CD44、CD105在肾脏、肺脏、脾脏中的表达。 结果与结论：①环磷酰胺+脐带间充质干细胞组干扰素γ、白细胞介素17、白细胞介素10水平与对照组相比明显降低(P < 0.05)。②32周时环磷酰胺+脐带间充质干细胞组和脐带间充质干细胞组尿蛋白定量低于环磷酰胺组和对照组(P < 0.01)。③32周时环磷酰胺+脐带间充质干细胞组抗ds-DNA抗体水平与对照组相比明显降低。④脐带间充质干细胞组肾小球硬化及炎性细胞浸润程度均较对照组为轻。⑤32周时肾脏、肺脏、脾脏中间充质干细胞表面标志CD44、CD105表达为阴性。提示,应用脐带间充质干细胞移植治疗MRL/lpr狼疮鼠可以显著降低狼疮活动指标,对狼疮肾炎具有治疗作用,同时可以通过降低促炎因子的水平发挥免疫抑制作用。     

γ干扰素、白细胞介素4与CD25在角膜移植免疫排斥反应中的作用*☆

目的：角膜移植免疫排斥反应是一个多因素参与的调节过程，近年来研究表明细胞因子在角膜移植免疫中起重要作用。实验拟验证γ-干扰素、白细胞介素4及CD25在大鼠角膜移植免疫排斥反应中的作用。 方法：①实验于2006-10/2007-05在南方医科大学南方医院实验动物中心完成。选用Wistar大鼠24只，SD大鼠54只，实验方法符合动物伦理学要求。②将54只SD大鼠按随机数字表法分为3组，正常组6只，角膜移植组及地塞米松组均24只。后两组制备Wistar→SD角膜移植大鼠模型，受体选择右眼手术，供体提供双眼角膜。③用裂隙灯观察移植排斥情况；利用反转录-聚合酶链反应检测植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达；应用酶联免疫吸附实验检测房水和血清中γ-干扰素、白细胞介素4含量；应用流式细胞术检测移植前后不同时相外周血淋巴细胞CD25的表达；术后第11天，应用免疫组织化学方法检测角膜CD4+，CD8+和CD25+ T细胞的表达。 结果：54只SD大鼠全部进入结果分析。①地塞米松组大鼠发生角膜移植排斥反应的时间长于角膜移植组(P=0.000)。②正常角膜植片无CD25、γ-干扰素mRNA表达，角膜移植组术后第11天角膜植片内γ-干扰素、CD25 mRNA的表达较地塞米松组增强(P < 0.05)。③角膜移植组角膜移植术后6，11 d血清γ-干扰素含量高于正常组（P < 0.05）；术后11 d含量高于术后6，24 d（P < 0.01）；地塞米松组术后6，11 d低于同期角膜移植组（P < 0.05）。④角膜移植组角膜移植术后6，11，24 d房水γ-干扰素、白细胞介素4含量均高于正常组（P < 0.05）；地塞米松组术后6，11 d均低于同期角膜移植组（P < 0.05~0.01）。⑤地塞米松组术后6，11 d外周血CD3+CD25+T/CD3+T比值低于同期角膜移植组（P < 0.05）。⑥术后第11天角膜移植组植片内CD4，CD8及CD25明显表达，地塞米松组CD4，CD8及CD25表达明显减弱。 结论：CD25、γ-干扰素和白细胞介素4在角膜移植免疫排斥反应过程中发挥重要的作用；促进白细胞介素4表达，抑制γ-干扰素及CD25产生，对降低角膜移植免疫排斥反应具有积极的作用。术后动态检测外周血CD25和γ-干扰素的表达有助于临床了解局部免疫反应程度并预测角膜移植排斥反应的发生。     

人脐带源间充质干细胞体内外移植的免疫学特征

背景：部分体外实验证实人脐带源间充质干细胞具有同种异体的免疫耐受特性,然而对其体内研究尚处于异种异体之间,且结果及机制缺少统一性。 目的：培养人脐带源间充质干细胞,通过体内外试验分析其移植免疫学特性。 方法：应用组织块贴壁法提取人脐带源间充质干细胞,通过体外淋巴细胞混合反应检测其同种异体免疫耐受作用;应用流式细胞仪检测体内行人脐带源间充质干细胞移植前后患者血液中CD4、CD8浓度及比值变化,并通过ELISA方法对比体外淋巴细胞混合培养前后血液、培养上清及体内移植前后患者血液中白细胞介素2,10、γ-干扰素的浓度变化。 结果与结论：体内外实验中,混合淋巴细胞反应前后血浆及细胞上清中的细胞因子浓度变化呈相似趋势：白细胞介素10较反应前上升(P < 0.05),γ-干扰素较反应前下降(P < 0.05)。人脐带源间充质干细胞移植后患者T细胞亚群中CD4+/CD8+比值较移植前轻度下降。说明人脐带源间充质干细胞具有同种异体免疫耐受及免疫调节作用。     

他克莫司处理供者树突状细胞在诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受中的作用

背景：诱导供者特异性免疫耐受被认为是最终克服器官移植后排斥反应的有效途径，近年来关于未成熟树突状细胞在诱导免疫耐受中的重要作用日益受到关注。 目的：观察他克莫司处理的供者未成熟树突状细胞对大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的影响，分析未成熟树突状细胞诱导免疫耐受的作用途径。 设计：随机对照动物实验。 材料：实验于2006-04/2006-12在青岛大学医学院附属医院动物实验中心完成。以45只Wistar大鼠为供体，45只SD大鼠为受体，行颈部心脏移植45例次。按随机数字表法分为3组，每组15例次，进行不同的预处理。 方法：对照组、未经他克莫司处理组及他克莫司处理组移植前7 d分别经尾静脉注射生理盐水、供者未成熟树突状细胞和他克莫司处理的未成熟树突状细胞。分别测定移植后SD大鼠与Wistar大鼠及第3品系Lewis大鼠的单向混合淋巴细胞反应。 主要观察指标：各组受体大鼠移植心脏存活时间、心肌病理及血清白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10、γ-干扰素含量变化。 结果：①未经他克莫司处理组大鼠的移植心脏存活时间较对照组明显延长（P < 0.01），他克莫司处理组大鼠的移植心脏存活时间进一步延长（P < 0.05）。②混合淋巴细胞培养结果显示为供者特异性。③各组大鼠血清白细胞介素2、γ-干扰素、白细胞介素4、白细胞介素10含量差异具有显著性意义（P < 0.01）。代表Th1的白细胞介素2、γ-干扰素水平明显降低，代表Th2的白细胞介素4、白细胞介素10水平明显增高。 结论：未成熟树突状细胞能够诱导同种异体大鼠心脏移植免疫耐受；他克莫司处理的未成熟树突状细胞能够加强这种免疫耐受，且这种耐受是供者特异性的。其可能主要通过调节T细胞免疫应答类型（Th1至Th2的免疫偏移）、诱导调节性T细胞和诱导T细胞失能等途径来参与免疫耐受的形成。     

胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的免疫调节*☆◆

背景：众多研究表明间充质干细胞能发挥免疫调节功能,抑制T细胞增殖。 目的：观察胚胎骨髓来源间充质干细胞对人Th17细胞的调节作用。 方法：将人胚胎骨髓间充质干细胞与正常人外周血单个核细胞或CD4+ T细胞以1∶10比例共培养4 d,以单个核细胞或CD4+T细胞单独培养为对照。应用实时定量PCR检测细胞白细胞介素17 mRNA表达,酶联免疫吸附试验检测细胞上清中白细胞介素17蛋白水平,流式细胞术检测Th17细胞数量。 结果与结论：胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞共培养组白细胞介素17 mRNA表达水平明显高于单个核细胞组(P < 0.01)。与此一致的是,胚胎骨髓来源间充质干细胞与单个核细胞或CD4+T细胞共培养组细胞上清中白细胞介素17蛋白水平明显高于单个核细胞组、CD4+ T细胞组(P < 0.05,P < 0.01)。胚胎骨髓来源间充质干细胞与CD4+ T细胞共培养组Th17细胞数量明显高于CD4+ T细胞组(P < 0.01),但胚胎骨髓来源间充质干细胞本身并不表达白细胞介素17。表明胚胎骨髓来源间充质干细胞可促进人Th17细胞增殖。     

钾通道阻滞剂对多发性硬化患者细胞因子分泌的影响

目的研究多发性硬化(multiple sclerosis,MS)患者髓鞘反应性CD4+T淋巴细胞分泌γ干扰素(INF-γ)和白细胞介素-4(IL-4)的水平,并探讨钾通道阻滞剂对其分泌的影响。方法采用酶联免疫斑点方法(ELISPOT)对12例急性期MS患者、12例缓解期MS患者(经INF--β1b治疗)和10名健康对照的CD4+T淋巴细胞在有无髓鞘抗原和钾通道阻滞剂作用下分泌细胞因子INF-γ和IL-4的变化进行比较。结果 MS急性期外周血CD4+T细胞以分泌IFN-γ为主;MS急性期及缓解期的CD4+T淋巴细胞经髓鞘碱性蛋白(MBP)刺激后分泌IFN-γ的水平较未加抗原组均增高(P<0.05),加入Kv1.3通道阻滞剂海葵毒素(Stichodactyla helianthustoxin,SHK)后,MS急性期和缓解期的MBP反应CD4+T淋巴细胞IFN-γ分泌明显减低(P<0.05),而对IL-4无明显影响。结论 Kv1.3钾通道阻滞剂SHK能减少MS患者MBP反应CD4+T细胞分泌IFN-γ,提示髓鞘反应性CD4+T细胞上Kv1.3通道有可能作为治疗MS的新靶点。     

外周血CD34+细胞形貌在系统性红斑狼疮患者与健康人的差异比较

背景：系统性红斑狼疮患者CD34+细胞是否存在异常目前仍有争议。 目的：以健康人为对照，应用原子力显微镜观察比较二者外周血CD34+细胞形貌特征。 设计：病例-对照分析。 对象：6例系统性红斑狼疮患者，男3例，女3例，平均年龄26.3岁，平均病程19.0个月，均符合1982年美国风湿病学会制定的诊断标准。3例健康志愿者为对照。两组对象基线资料具有可比性。 方法：系统性红斑狼疮患者均静脉注射环磷酰胺4 g/m2，白细胞<1.0×109 L-1时给予粒细胞集落刺激因子5 μg/kg，待白细胞> 5.58×109 L-1及CD34+>2%时采集外周血干细胞。3例健康志愿者采取单用粒细胞集落刺激因子为动员方案。向外周血干细胞中加入CD34 MicroBeads FcR和FcR Blocking Reagent制备细胞悬液，离心弃上清，重悬后过滤，应用免疫磁珠细胞分选技术纯化CD34+细胞。 主要观察指标：原子力显微镜观察细胞表面形貌，每例患者随机测20个细胞，每个细胞不同部位做2 μm×2 μm图像5幅，将5幅图像的直径、平均粗糙度、均方根粗糙度、平均高度的均值作为该细胞的参数。 结果：成像范围在12 μm×12 μm时，可将细胞整体模拟成像。成像范围在2 μm×2 μm时，两组细胞表面均可见大小、深浅不一的凹陷及椭圆形球状突起，粗糙不平。与健康志愿者比较，系统性红斑狼疮患者外周血CD34+细胞的直径、平均粗糙度、均方根粗糙度、平均高度等参数经单向方差分析差异无显著性意义（F=0.203~4.553，P均> 0.05）。 结论：应用原子力显微镜选择成像范围在2 μm×2 μm时可清晰观测外周血CD34+细胞的表面结构，且系统性红斑狼疮患者和健康人的外周血CD34+细胞形貌基本相似。     

自体造血干细胞移植治疗恶性淋巴瘤后大剂量白细胞介素2过继免疫对长期生存的影响

背景：过继免疫治疗是目前肿瘤免疫治疗的热点,白细胞介素2是一种具有多种生物学活性的细胞因子,在机体的抗肿瘤免疫中起到重要作用。 目的：评价比较淋巴瘤自体造血干细胞移植治疗后应用与不应用大剂量白介素2行免疫治疗的临床疗效。 方法：回顾分析30例恶性淋巴瘤患者(治疗组)自体造血干细胞移植后行大剂量白细胞介素2 治疗,与随机挑选30例患者(对照组)自体造血干细胞移植后未行白细胞介素2治疗进行对比,检测两组患者外周血T淋巴细胞亚群,观察两组免疫功能的变化,并对所有患者进行随访观察。 结果与结论：自体造血干细胞移植后白细胞介素2治疗组外周血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平明显提升。随访结束时统计复发率：治疗组13.3%,对照组26.7%;中位生存期：治疗组14~98 (42±2)个月,对照组8~78 (28±2)个月。提示恶性淋巴瘤自体造血干细胞移植后行大剂量白细胞介素2治疗能提高患者的免疫功能,减少移植后复发率,并有望延长生存期。     

白细胞介素3基因cDNA克隆与转导及其在脐血CD34+细胞中的表达

背景：单份脐血难以满足成人造血干细胞移植的要求,需对其进行体外扩增,这不仅需要较长的时间和较高的培养条件,而且容易导致干细胞自身分化,从而影响移植效果。 目的：克隆人白细胞介素3基因cDNA,构建其真核表达载体并转导脐血CD34+细胞,观察白细胞介素3的表达情况。 设计、时间及地点：细胞-基因组学体外实验,于2008年在承德医学院完成。 材料：健康成人外周血由承德市中心血站提供,脐血由承德市妇幼保健院提供,提供者对实验均知情同意。 方法：采集健康成人外周血,应用Ficoll密度梯度法分离单个核细胞,免疫磁珠法分离脐血CD34+细胞。提取白细胞介素3 mRNA,应用RT-PCT扩增白细胞介素3 cDNA,构建真核表达载体pcDNA3/IL-3。设立2组：实验组利用基因枪技术将pcDNA3/IL-3导入脐血CD34+细胞中,对照组未行转染。 主要观察指标：采用人白细胞介素3 ELISA试剂盒检测脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平。 结果：扩增的白细胞介素3基因cDNA理论上应为616 bp,实际PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后,紫外线下可见预期大小的条带,反转录合成的cDNA完整。BamHⅠ和XbaⅠ双酶切后,电泳可见616 bp的插入片段,与白细胞介素3基因序列相同。转染第1~7天,实验组脐血CD34+细胞上清液中白细胞介素3水平明显高于未转染对照组(t=3.46,P < 0.05)。 结论：白细胞介素3基因cDNA克隆成功,并成功构建了真核表达质粒pcDNA3/IL-3,pcDNA3/IL-3能在脐血CD34+细胞中短期有效表达。     

Th1/Th2免疫应答系统在冠状动脉支架内再狭窄患者中的表达*☆

背景：支架再狭窄的机制尚未阐明,炎症失衡在多种疾病中起重要做用,可能与支架再狭窄有关。 目的：观察冠状动脉支架置入后支架内再狭窄患者辅助T细胞亚型Th1样细胞因子γ-干扰素、白细胞介素2和Th2样细胞因子白细胞介素4、白细胞介素10在血清中的分布特点。 方法：应用酶联免疫吸附法测定32例冠状动脉内支架置入后合并支架内再狭窄患者血清标本中γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10的浓度(实验2组),并与未行支架置入但排除冠心病患者30例(对照1组)、未行支架置入的冠心病患者30例(对照2组)及行支架置入但是无支架内狭窄患者30例(实验1组)进行比较。 结果与结论：对照2组血清中γ-干扰素、白细胞介素2、白细胞介素4、白细胞介素10的水平与对照1组相比,差异无显著性意义(P > 0.05);实验1组各指标与对照1组相比,差异亦无显著性意义(P > 0.05);实验2组患者血清中γ-干扰素、白细胞介素2水平高于其他3组(P < 0.01);白细胞介素4、白细胞介素10水平则低于对照1组和实验1组(P < 0.01)。结果表明支架内再狭窄患者存在Th1、Th2炎症水平的失衡,Th1型细胞因子上调,Th2型细胞因子下调,提示Th1/Th2失衡可能是冠状动脉支架内再狭窄的重要原因。 关键词：支架;冠心病;T淋巴细胞;辅助诱导;干扰素Ⅱ型;白细胞介素     

白细胞介素-18与C6细胞裂解物修饰的树突状细胞疫苗对脑胶质瘤的免疫治疗作用

目的观察经白细胞介素-18(IL-18)和C6细胞裂解物修饰的树突状细胞(DC)疫苗对大鼠脑胶质瘤的免疫治疗作用.方法用立体定向方法制作大鼠脑胶质瘤模型.通过白细胞介素-18和大鼠脑胶质瘤细胞(C6)裂解物修饰大鼠树突状细胞,制成DC疫苗.在大鼠皮下接种DC疫苗,检测大鼠体内特异性杀伤T细胞(CTL)活性,检测各组血清中细胞因子IL-18、干扰素(IFN-γ)的浓度,并研究了其对大鼠脑胶质瘤的免疫治疗作用.结果DC-IL18-C6组中IL-18与IFN-γ的浓度与其余各组比较有统计学意义(P＜0 01),与注射DC组比较有统计学意义(P＜0 01).DC-IL18-C6组接种C6细胞后56 d均未见移植肿瘤形成,与其余各组比较有统计学意义(P＜0.01).对C6胶质瘤细胞的细胞毒作用以DC-IL18-C6组最强,DC-C6裂解物组次之,DC-Ⅱ-18组较弱,其余两组则缺乏(P＜0.01).DC-IL18-C6组的荷瘤鼠生存期比其他各组明显延长,且肿瘤的大小比其他各组明显缩小.结论白细胞介素-18与C6细胞裂解物修饰的树突状细胞疫苗对大鼠脑胶质瘤有明显的免疫治疗作用.     

混合淋巴细胞反应体系中胎盘间充质干细胞的免疫抑制效应◆

背景：胎盘由滋养细胞及大量起源于胚外中胚层的间充质和血管共同组成,提示胎盘中存在间充质干细胞成分。 目的：探索胎盘间充质干细胞对混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞增殖和细胞因子分泌的影响,评价其免疫学特性。 方法：分离培养胎盘间充质干细胞,采用人以及兔双向混合淋巴细胞反应体系,根据胎盘间充质干细胞∶外周血单个核细胞的不同比例(1∶5,1∶10,1∶20,1∶50,1∶100,1∶500)加入丝裂霉素处理胎盘间充质干细胞。3H掺入法测定淋巴细胞增殖率并用ELISA法测定混合培养上清液中白细胞介素2和γ-干扰素的含量。 结果与结论：胎盘间充质干细胞抑制人或兔混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖,抑制率与加入的胎盘间充质干细胞数量成正比,同时胎盘间充质干细胞减少混合淋巴细胞反应中细胞因子白细胞介素2、γ-干扰素的分泌。提示胎盘间充质干细胞具有免疫调节作用,可以抑制同种异体或异种混合淋巴细胞反应体系中淋巴细胞的增殖。     

耐受性树突状细胞体外培养的基本特征

背景：树突状细胞是体内最重要的抗原提呈细胞,在免疫调节中扮演着免疫应答和免疫耐受的双重角色,对维持机体的免疫平衡起重要作用。 目的：探讨耐受性树突状细胞的体外培养方法,观察不同培养条件下耐受性树突状细胞的基本特征。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象,随机分组设计,于2006-09/2008-02在南昌大学第一附属医院中心实验室完成。 材料：8周龄的Balb/c纯系雄性小鼠,体质量20~25 g,用于分离和制备骨髓单个核细胞。 方法：将小鼠骨髓单个核细胞分为5组在不同的培养体系中进行体外诱导培养：空白对照组(不加任何因子)、树突状细胞组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素4)、血管活性肠肽组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽)、地塞米松组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+地塞米松)、血管活性肠肽+地塞米松组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽+地塞米松)。 主要观察指标：光镜下动态观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c表达,四甲基偶氮唑盐法检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的活性,特异性夹心酶联免疫分析测定树突状细胞上清液中白细胞介素10、白细胞介素12的水平。 结果：①利用粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素4、血管活性肠肽、地塞米松、脂多糖等因子体外培养能生成具有典型树枝状突起的树突状细胞。②树突状细胞组、血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组CD11c的表达高于空白对照组(P < 0.05)。血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组CD40、CD80和CD86表达,淋巴细胞增殖活性及培养上清液白细胞介素12水平均低于树突状细胞组(P < 0.05),血管活性肠肽组以质量浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L减低明显,其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最低,差异具有显著性意义(P < 0.05)。③血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组细胞培养上清液中白细胞介素10水平均高于树突状细胞组(P < 0.05),血管活性肠肽组以质量浓度为40 μg/L,地塞米松组以10 μg/L升高明显,其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最高,差异具有显著性意义(P < 0.05)。 结论：①小鼠骨髓单个核细胞体外经粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管活性肠肽或/和地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成致耐受性树突状细胞。②与常规诱导培养树突状细胞方法比较,耐受性树突状细胞具有CD40、CD80、CD86表达低,刺激淋巴细胞增殖弱的特点;耐受性树突状细胞培养体系上清液白细胞介素10水平高而白细胞介素12水平低。③粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管活性肠肽+地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成耐受性树突状细胞效果较佳,其中以血管活性肠肽40 μg/L、地塞米松10 μg/L的培养条件为最好。     

γ-干扰素诱导人外周血CD4~+CD25~-T细胞转化为CD4~+CD25~+调节性T细胞的可行性研究

目的研究γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)将人外周血CD4~+CD25~- T细胞诱导为CD4~+CD25~+调节性T细胞(CD4~+CD25~+Tregs)的可行性。方法采用免疫磁珠法分离19名健康志愿者外周血单个核细胞中的CD4~+CD25~- T细胞,在抗CD3和抗CD28抗体存在条件下给予不同水平IFN-γ刺激72 h,以流式细胞仪检测CD4~+CD25~+T细胞比例并以real time-PCR法检测其特异性表型标志FoxP3表达水平。将诱导生成的CD4~+CD25~+T细胞与自体CD4~+CD25~-T细胞共培养检测诱导生成的CD4~+CD25~+T细胞抑制CD4~+CD25~-T细胞增殖的能力。结果IFN-γ刺激后CD4~+CD25~+T细胞比例上调且其FoxP3表达较诱导前明显增高,当IFN-γ水平为20、40 ng/mL时,CD4~+CD25~+T细胞上调比例最高;40 ng/mL IFN-γ诱导的CD4~+CD25~+T细胞FoxP3表达最高,但不及CD4~+CD25~+Tregs。IFN-γ诱导所得CD4~+CD25~+T细胞可抑制自体CD4~+CD25~-T细胞增殖,40 ng/mL IFN-γ诱导的CD4~+CD25~+T细胞抑制能力与CD4~+CD25~+Tregs相当。结论 IFN-γ可诱导CD4~+CD25~-T细胞转化为CD4~+CD25~+T细胞,当IFN-γ水平为40 ng/mL时诱导率最高且诱导生成的CD4~+CD25~+T细胞表型和功能与CD4~+CD25~+Tregs相当。     

当归补血汤载药血清干预后骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌

背景：实验表明,当归补血汤的有效成分多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,对造血微环境具有重要的调控作用。 目的：观察当归补血汤载药血清干预后小鼠骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌状况。 方法：分离骨髓基质细胞,于96孔板培养,在相差显微镜下观察细胞形态和生长状况;将细胞分4组,加含有不同剂量的当归补血汤载药血清进行干预,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性,ELISA法检测粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的表达情况。 结果与结论：当归补血汤载药血清可明显促进骨髓基质细胞的增殖,促进骨髓基质细胞分泌粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3,呈剂量依赖性,含等效剂量载药血清组促增殖作用和促分泌作用优于其他各组,浓度过高可减弱细胞的增殖分泌效应。     

恶性胶质瘤细胞在不同培养液和不同时期中CD133阳性细胞比率的变化

目的:观察不同培养液及不同培养时期等因素对体外培养人脑胶质瘤细胞CD133阳性(CD133+)细胞比率的影响.方法:用干细胞培养液(含EGF、FGF-2、B27)培养6例原代胶质瘤细胞和3例对照细胞株,用流式细胞仪检测培养第0、3、7,28、60、90和120天时不同细胞的CD133+细胞比率;免疫组化观察胶质瘤干细胞的多向分化能力;用血清、无血清和干细胞3种培养液分别培养2例长期培养的胶质瘤SHG62、SH066细胞系以及对照的U87和U251细胞株,观察胶质瘤中CD133+细胞在不同培养液中的相互转换.结果:胶质瘤CD133+细胞比率随培养时间推移明显下降(P＜0.05),1周左右均降至＜1%的低水平,而细胞株则比较稳定;干细胞培养液培养的细胞中CD133+细胞比率明显高于血清和无血清培养液培养(P＜0.01);此外,胶质瘤细胞中的干细胞具有多向分化的能力,并且可以在干细胞和血清培养液中互相转换.结论:原代胶质瘤体外培养过程中CD133+细胞比率逐渐下降,而干细胞培养液能明显提高CD133+细胞比率,并且CD133+细胞可以在不同培养液中相互转换.说明生长环境对于细胞比率影响较大,提示可能存在尚未明了的影响干细胞生长分化的相关因子.