白细胞介素3与白细胞介素6对人脐血单个核细胞体外扩增及黏附分子和趋化因子受体4表达的影响**★

背景：体外扩增脐血造血细胞对增加脐血造血细胞数量及植入能力至关重要，合适的细胞因子组合介导的体外扩增不仅能使造血细胞数量增加，而且能够上调和归巢有关的黏附分子和趋化因子受体4的表达。 目的：实验拟观察白细胞介素3和白细胞介素6在人脐血单个核细胞体外扩增中的作用及对扩增后黏附分子和趋化因子受体4表达的影响。 设计、时间及地点：随机区组开放性实验，于2007-03/12在广西壮族自治区人民医院及广州医学院附属广州市第一人民医院血液实验室完成。 材料：10份足月顺产健康新生儿脐血标本。 方法：将自新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d，根据不同细胞因子组合实验分组为: 对照组（无细胞因子组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子组(A组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组(B组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素3 (C组)、干细胞因子+FLT3配基+促巨核细胞生成因子+白细胞介素6组+白细胞介素3 (D组) 。 主要观察指标：在0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+，CD34+CD49d+的细胞数和集落形成单位数。 结果：与对照组相比, A，B，C，D组均可有效的扩增脐血造血细胞(P < 0.05), C，D两组扩增效果均优于A，B组,差异显著（P < 0.05），但A，B两组之间无明显区别（P > 0.05）, D组能有效的扩增脐血细胞，并优于C组（P < 0.05）。A，B，C，D组细胞因子组合均可提高脐血CD34+细胞上CD49d, CD62L和趋化因子受体4的表达， A，B两组之间差异不显著（P > 0.05）,但均优于C组（P < 0.05），D组CD34+CXCR4+，CD34+CD62L+和CD34+CD49d+的细胞数扩增倍数优于A，B，C组（P < 0.05）。 结论：白细胞介素6组+白细胞介素3可协同扩增脐血细胞，并能促进和归巢有关的CD49d，CD62L及趋化因子受体4表达。     

pcDNA3/NT-3真核表达载体的构建及其表达

目的构建大鼠神经营养因子3（NT-3）基因真核表达载体并观察其在真核细胞内的表达情况。方法采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术从大鼠脑组织总RNA中扩增NT-3基因cDNA序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以阳离子脂质体Li-pofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NT-3在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为822bp的特异片段,重组质粒pcDNA3/NT-3酶切后产生822bp和5.2kb的片段,DNA测序证实822bp片段的碱基序列与大鼠NT-3基因序列完全一致,成功构建了pcDNA3/NT-3重组质粒。将其转染真核细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NT-3能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒载体pcDNA3/NT-3,为后续的研究奠定基础。     

靶基因调控的脐血干/祖细胞体外长期扩增与调控**★

背景：脐血干细胞是基因治疗最理想的靶细胞之一，但基因转移率低下是目前面临的主要障碍。酪氨酸激酶JAK2在造血干/祖细胞自我更新中扮演着重要的作用，为了克服脐血基因转移率低下的障碍，根据基因调控表达技术原理，是否可开发一个可以靶向扩增JAK2基因修饰的脐血CD34+细胞体系。 目的：探讨转基因JAK2介导的脐血干祖细胞长期扩增调控的可行性和安全性。 单位：卫生部北京医院血液科。 材料：实验于2003-06/2006-04在卫生部北京医院血液科实验室完成。脐血取自健康、足月、自然分娩后立即断脐的脐血。脐血由北京医院妇产科提供，产妇及家属均知情同意，实验经医学伦理委员会批准。MiniMACS磁性分离仪、免疫磁珠吸附CD34单抗购自德国Miltenyi Biotec公司， 流式细胞仪购自美国FACScalibur，人重组干细胞因子、Flt3配体、人白介素-6、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、血小板生成素为PeproTec产品，SPF级裸鼠购自北京医科大学动物中心。 方法：构建逆转录病毒载体MGI-F2JAK2，内含有JAK2基因的功能催化区和两个与小分子靶向基因合成药物(AP20187)结合的位点蛋白(2xF36v，F2)组成。AP20187可与F36v特异结合引起JAK2二聚化而激活细胞内信号传导。该载体同时含有绿色荧光蛋白报告基因，用作检测细胞增殖的标记。应用MiniMACS免疫磁珠分选系统纯化分离脐血CD34+ 细胞，用含JAK2的逆转录病毒上清转染脐血CD34+细胞。转导后的CD34+ 细胞在集落刺激因子、Flt3配体、血小板生成素、白介素-6细胞因子的联合培养条件下，以不加或加入AP20187分别作为对照组和实验组。 主要观察指标：①应用流式细胞仪测定两组CD34+细胞中所含绿色荧光蛋白细胞的百分率，确定基因转移率。②扩增后的脐血祖细胞集落培养结果。③取培养10周的脐血CD34+细胞于裸鼠的胁部皮下注射，30 d后观察成瘤情况。 结果：①实验组与对照组均可获得CD34+ 细胞大量扩增。随着培养时间的延长，实验组扩增的CD34+细胞GFP阳性率由基线水平逐渐上升于第11周时达到95%以上，而对照组绿色荧光蛋白报告基因阳性率逐渐下降到基线水平以下并逐渐消失。②实验组转基因CD34+ 细胞于12周后仍可产生造血祖细胞集落红系祖细胞、粒单系祖细胞、脐血多向造血祖细胞，所形成的造血祖细胞集落以粒单系祖细胞为主。③裸鼠实验无致瘤特性。 结论：转染JAK2 基因的人脐血CD34+ 细胞协同其他细胞因子可以体外长期扩增脐血干祖细胞，对今后开展干细胞治疗某些遗传性血液病有潜在的应用价值。     

细胞因子介导的人脐血单个核细胞体外扩增并重建NOD/SCID小鼠造血及免疫功能

背景：细胞因子介导的脐血造血细胞体外扩增有望能解决脐血移植数量不足的问题。 目的：实验拟确立在无基质培养条件下体外扩增脐血单个核细胞最合适的细胞因子组合及干细胞因子、FLT3配基协同促聚核细胞生成因子对造血及免疫重建功能的影响。 方法：将新鲜脐血标本分离的单个核细胞接种于含有不同细胞因子组合的无血清无基质培养体系中培养7 d,根据不同细胞因子组合分组,将3因子干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子组合在无血清无基质条件下扩增培养7 d前后的脐血单个核细胞移植给经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠。在扩增培养0,7 d检测脐血CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。脐血移植6周后通过流式细胞仪,PCR法检测存活小鼠体内的人源性细胞。 结果与结论：移植6周后,存活小鼠体内均可检测到人源性CD45+细胞,扩增脐血移植组的NOD/SCID小鼠存活率和人特异性基因捡出率均高于新鲜脐血移植组和高于生理盐水移植组 (P < 0.05)。扩增脐血组存活NOD/SCID小鼠骨髓中可检测到人髓系细胞(CD33+),T淋巴细胞(CD4+),B淋巴细胞(CD19+)和人造血干细胞成分(CD34+)细胞的表达。结果提示干细胞因子+FLT3配基+促聚核细胞生成因子3因子组合脐血造血细胞体外扩增是最合适的细胞因子组合,其扩增的脐血单个核细胞能够植入并重建NOD/SCID小鼠的造血及免疫功能。     

GDNF基因真核表达载体的构建及其在脐血CD34+干细胞的表达

目的构建人胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因的新型真核表达载体,为进行GDNF基因修饰的脐血干细胞移植治疗脑梗死奠定基础。方法将GDNF基因克隆到增强型绿色荧光蛋白(EGFP)真核表达载体中,进行酶切鉴定及DNA测序分析,并将携带有GDNF基因的该真核表达载体,通过脂质体介导,转染人脐血CD34 细胞,荧光显微镜、ELISA检测转基因脐血干细胞GDNF的表达与释放。结果经双酶切鉴定和测序证实已将GDNF基因DNA片段正确插入到真核表达载体中,并能在脐血CD34 干细胞中表达、分泌有活性的GDNF。结论成功构建pEGFP/GDNF基因新型真核表达载体。     

人CD80基因转染U251瘤株细胞的实验研究

目的 构建编码人CD80基因的真核表达载体，转染神经胶质瘤细胞株U251，并检测CD80基因在U251中的表达。方法 PCR法扩增人类CD80基因的开放阅读框（ORF）全长，酶切法连接入真核表达载体pcDNA3．1。构建为重组质粒pcDNA3．1／CD80，双酶切及测序鉴定。利用脂质体法将pcDNA3．1／CD80转染U251细胞株，应用RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学法、Western blotting等技术从细胞及分子水平检测人CD80分子在U251细胞表面的表达情况。结果 重组质粒pcDNA3．1／CD80双酶切可切出约900bp目的片段。测序结果和NCBI检索CD80序列吻合；RT-PCR检测到pcDNA3．1／CD80转染后的U251细胞中CD80mRNA表达；荧光显微镜下观察可见大量免疫荧光标记的绿色荧光细胞，检测转染效率约31．8％；Western blotting可检测到约60kD蛋白条带。结论 本实验成功构建了pcDNA3．1／CD80真核表达载体，并实现了在神经胶质瘤细胞株U251中的表达，为后续研究CD80的表达对肿瘤细胞免疫原性的影响以及制备神经胶质瘤肿瘤疫苗提供了重要的实验材料。     

不同刺激因子对脐血干/祖细胞体外增殖影响的比较

背景：目前细胞因子支持的脐血体外扩增是安全性较高、最有可能运用于临床的方法之一。 目的：比较白血病抑制因子、白细胞介素6及脂多糖对脐血干/祖细胞体外增殖的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外对照实验,于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：10例正常脐血标本取自广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科,白血病抑制因子为达科为试剂公司产品,白细胞介素6为晶美试剂公司产品,脂多糖由广东医学院附属医院李延平教授自制。 方法：密度梯度法体外分离培养脐血单个核细胞,应用磁分选器和单克隆抗体免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞。建立液体培养体系,为含体积分数为40%的胎牛血清、20 g/L牛血清白蛋白、20 μg/L粒巨集落刺激因子、20 μg/L干细胞因子、20 μg/L白细胞介素3的RPMI 1640培养液。取2×108 L-1脐血CD34+细胞,加入配制的液体培养体系50 μL,设立8组：第1组仅加入RPMI 1640作为对照,第2~4组分别单独加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6,第5~7组分别加入脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的两两混合液,第8组加入3种刺激因子的混合液,上述各组脂多糖、白血病抑制因子、白细胞介素6的终浓度分别为10 U/mL,10 μg/L,10 mg/L。 主要观察指标：MTT法测定不同刺激因子在液体培养体系中对脐血CD34+细胞增殖的影响。 结果：培养3 d后与对照组比较,单用白血病抑制因子对脐血CD34+细胞具有促增殖作用(F=3.33,P < 0.01),单用脂多糖或白细胞介素6的效果均不显著(F=2.14,1.83,P > 0.05);刺激因子两两联用及3种刺激因子联用时,对脐血CD34+细胞均具有促增殖作用(F=3.54~4.06,P均< 0.01),且3种刺激因子联用时的促增殖效果尤为显著。 结论：在特定的液体培养体系中,单独使用白血病抑制因子可明显促进脐血干/祖细胞体外增殖,联合情况下白细胞介素6、脂多糖与白血病抑制因子具有促增殖协同作用。     

pcDNA3-hNGFb真核表达载体的构建及其表达

目的构建人神经生长因子β（NGF-β）基因真核表达载体并观察其在L929细胞内的表达。方法以RT-PCR从人脑组织总RNA中扩增NGF-βcDNA,将其克隆到真核表达载体pcD-NA3中,经酶切鉴定和序列分析后,以Lipofectamine2000介导转染L929细胞,应用免疫细胞化学和western blot鉴定NGF-β在细胞内的表达。结果RT-PCR产物为750bp的特异片段,重组质粒pcDNA3-hNGFb酶切后产生750bp和5.2kb的片段,DNA测序证实750bp片段的碱基序列与人NGF-βcDNA完全一致。将其转染L929细胞后,免疫细胞化学、western blot结果表明NGF-β及其前体proNGF-β能在真核细胞中正确表达。结论成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3-hNGFb,为后续的研究奠定基础。     

不同细胞饲养层支持脐血CD34+细胞体外扩增的效果比较

背景：成纤维细胞饲养层与基质细胞饲养层一样能分泌多种细胞因子，其中包括起正性作用和负性作用的细胞因子，它们对共培养体系内的干/祖细胞起双向调节作用，但何时表现为抑制性或促进性作用目前尚无定论。 目的：分析比较骨髓基质细胞及皮肤成纤维细胞饲养层对脐血CD34+细胞体外扩增的影响，以了解共培养体系对脐血CD34+细胞体外扩增的支持作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2003-08/2004-05在广东医学院附属医院中心实验室完成。 材料：原代成纤维细胞、骨髓标本由广东医学院附属医院提供，脐血标本由广东医学院附属医院妇产科及湛江市妇幼保健院妇产科提供。 方法：体外分离培养人脐血单个核细胞，应用免疫磁珠(阳性)分选法提取脐血CD34+细胞。设立3组：液体培养对照组为脐血CD34+细胞(3×108 L-1)+ RPMI 1640培养液(含体积分数为10%牛血清白蛋白、10 μg/L粒-巨噬细胞集落刺激因子、10 μg/L干细胞因子、10 μg/L白细胞介素3)，接种于24孔培养板；骨髓基质细胞饲养层组、成纤维细胞饲养层组分别将体外分离培养的第4代人骨髓基质细胞/皮肤成纤维细胞接种于24孔培养板，70%融合时加入等量脐血CD34+细胞及相同成分的RPMI 1640培养液。 主要观察指标：脐血CD34+细胞增殖情况与集落形成能力。 结果：与骨髓基质细胞饲养层组比较，液体培养对照组、成纤维细胞饲养层组脐血CD34+细胞增殖率及集落形成能力均显著降低(P均< 0.01)；后2组间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。 结论：骨髓基质细胞饲养层培养体系能促进脐血CD34+细胞体外扩增，并可以较好地保持脐血CD34+细胞的干细胞特性，效果显著优于成纤维细胞饲养层及液体培养体系。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响*

背景：体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞。 目的：观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响。 方法：将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养：对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组。培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。 结果与结论：单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达。而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差。提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力。     

Physical and Sexual Abuse and Neglect and Eating Disorder Symptoms

Abstract

For eating-disordered patients with a history of post-traumatic stress, childhood abuse and neglect, and dissociative disorder, eating behavior symptoms may function as a rational response to unmetabolized traumatic experiences. This paper will review trauma-based theory, dissociation, abreactive, and ego-states therapy as they apply to eating disorder patients.     

Presence and severity of anorexia and bulimia among male and female Omani and non-Omani adolescents

OBJECTIVE: The population of Oman is a heterogeneous mix of nationalities providing a natural setting for studying the cross-cultural differences in the presence and severity of eating disorders as well as an opportunity for evaluating the performance of measurement instruments for these disorders. METHOD: Disordered eating screening instruments (the Eating Attitude Test and the Bulimic Investigatory Test) were administered to Omani teenagers, non-Omani teenagers, and Omani adults. RESULTS: On the Eating Attitude Test, 33% of Omani teenagers (29.4% females and 36.4% males) and 9% of non-Omani teenagers (7.5% of males and 10.6% females) showed a propensity for anorexic-like behavior. On the Bulimic Investigatory Test, 12.3% of Omani teenagers showed a propensity for binge eating or bulimia (13.7% females and 10.9% males). Among the non-Omani teenagers, 18.4% showed a tendency toward bulimia, with females showing a slightly greater tendency than males. In contrast, barely 2% of Omani adults showed either a presence of or a severity of disorderly behavior with food. CONCLUSION: Omani teenagers scored significantly higher than other ethnic groups and Omani adults. This finding is discussed in the light of emerging evidence from many parts of the world suggesting that cultural transition, compounded by demographic constraints, plays a significant role in abnormal eating attitudes.     

Physical and Sexual Abuse and Neglect and Eating Disorder Symptoms

For eating-disordered patients with a history of post-traumatic stress, childhood abuse and neglect, and dissociative disorder, eating behavior symptoms may function as a rational response to unmetabolized traumatic experiences. This paper will review trauma-based theory, dissociation, abreactive, and ego-states therapy as they apply to eating disorder patients.     

Efficacy and Effectiveness of Child and Adolescent Psychotherapy and Pharmacotherapy

Decades of intervention research have produced a rich body of evidence on the effects of psychotherapies and pharmacotherapies with children and adolescents. Here we summarize and critique that evidence. We review findings bearing on the efficacy of psychosocial treatments and medications under controlled experimental conditions. We also report evidence, where available, on the effectiveness of both classes of treatment with clinically referred youth treated in real-world clinical contexts. In general, the large body of evidence on efficacy contrasts sharply with the small base of evidence on effectiveness. Addressing this gap through an enriched research agenda could contribute importantly to linking scientific inquiry and clinical practice—to the benefit of both ventures. This is one element of a multifaceted agenda for future research and for synthesis of research, which will require the interplay of multiple disciplines related to child and adolescent mental health.     

Spatial attention and conscious perception: interactions and dissociations between and within endogenous and exogenous processes

A current controversy exists about the relationship between spatial attention and conscious perception. While some authors propose that these phenomena are intimately related (Bartolomeo, 2008, Chun and Marois, 2002, O’Regan and Noë, 2001, Posner, 1994), others report dissociations between them (Kentridge et al., 1999, Koch and Tsuchiya, 2007, Wyart and Tallon-Baudry, 2008). However, spatial attention is not a unitary mechanism, and it is possible that not all forms of attention dissociate from conscious perception. In the present study we used a paradigm in which endogenous and exogenous forms of attention are orthogonally manipulated in order to investigate their relation with conscious perception within the same design. By analyzing two different cue-related components, our results demonstrated that while endogenous attention was electrophysiologically dissociated from conscious perception, exogenous attention was not, consistent with the hypothesis that exogenous attention is an important antecedent of our conscious experience. Our results support previous claims of dissociations between some forms of spatial attention and conscious perception, but also highlight the importance of exogenous orienting on the selection of information for conscious access.     

Serious emotional and behavioral problems and mental health contacts in American and British children and adolescents

OBJECTIVE: To compare prevalence of serious emotional and behavioral problems and mental health contacts for these problems among American and British children and adolescents. METHOD: Data on children and adolescents ages 5 to 16 years were drawn from the 2004 U.S. National Health Interview Survey (response rate = 79.4%) and the 2004 survey of Mental Health of Children and Young People in Great Britain (response rate = 76.0%). Emotional problems, hyperactivity/inattention, and conduct problems were assessed using the parent version of the Strengths and Difficulties Questionnaire (SDQ). Psychometric properties of SDQ scales were compared across countries. RESULTS: The SDQ has similar psychometric properties across countries. More British than American children met the criteria for emotional and conduct problems, but not hyperactivity/inattention. Prevalence was higher for all problems in 5- to 8-year-old British boys and for emotional problems in 13- to 16-year-old British girls. American children with serious emotional and behavioral problems had a higher prevalence of mental health contacts overall and with mental health providers but not with general medical providers. CONCLUSIONS: British children have a higher prevalence of parent-reported serious emotional and behavioral problems than American children. However, British children with these problems are less likely than American children to receive mental health care.