系统性红斑狼疮患者血清IFN-α和IL-6的共同作用对造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响

背景：系统性红斑狼疮与树突状细胞的功能活化密切相关。在体内,树突状细胞来源于造血干细胞,其分化成熟的过程受多种因素的影响。系统性红斑狼疮患者血清中存在细胞因子网络失调,以往研究多关注于单一因子的参与作用。 目的：课题创新性提出和观察系统性红斑狼疮患者血清α干扰素和白细胞介素6共同作用下对CD34+造血干细胞定向分化为树突状细胞的影响。 设计、时间及地点：分组对比观察,完全随机细胞学体外实验,于2006-05/2008-10在南京医科大学微生物与免疫学实验室完成。 材料：外周血标本取自50例就诊于南京医科大学第一附属医院风湿免疫科的系统性红斑狼疮患者,以及30例南京医科大学的健康志愿献血者。15份脐血标本取自南京医科大学附属南京妇幼保健院健康足月顺产的新生儿,产妇及其家属均对实验知情同意。 方法：无菌采集系统性红斑狼疮患者和正常对照者的外周静脉血,根据正常人血清中α干扰素、白细胞介素6的浓度,采用百分位数法求得血清α干扰素、白细胞介素6浓度的95%参考值范围,并以浓度超过此范围为异常升高。取新生儿脐血,Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离脐血单个核细胞,免疫磁珠法纯化CD34+造血干细胞,并诱导其定向分化为树突状细胞。在培养过程中设立6组,分别加入：正常对照血清、α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和白细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合α干扰素及白细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清,各组血清体积分数均为10%,培养14 d。 主要观察指标：流式细胞仪检测树突状细胞的表型,ELISA法检测树突状细胞分泌细胞因子的水平,混合淋巴细胞反应检测树突状细胞刺激同种异体T细胞增殖的能力,及其对T细胞亚群分化率影响。 结果：①与正常血清对照比较,α干扰素、白细胞介素6及二者同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清诱导培养的树突状细胞其HLA-DR,CD80,CD86的表达均明显升高(P < 0.05),分泌白细胞介素12 的水平均明显降低(P < 0.05),刺激T细胞增殖能力均明显增强(P < 0.05)。混合α干扰素及白细胞介素6中和抗体的系统性红斑狼疮血清诱导培养的树突状细胞上述各项指标均恢复至正常血清对照水平。②与正常血清对照比较,白细胞介素6升高的系统性红斑狼疮血清其CD3+CD8−IFN-γ+、CD3+CD8+IFN-γ+细胞亚群百分率明显下降(P < 0.05);α干扰素升高的系统性红斑狼疮血清、α干扰素和白细胞介素6同时升高的系统性红斑狼疮血清、混合外源性α干扰素和白细胞介素6的正常对照者血清其CD3+CD8−IFN-γ+和CD3+CD8+IFN-γ+细胞亚群百分率均明显升高(P < 0.05)。 结论：系统性红斑狼疮血清α干扰素和白细胞介素6的共同作用对CD34+造血干细胞定向分化为树突状细胞产生了异常影响,可促进树突状细胞的表型成熟和功能活化,并间接影响T细胞亚群的分化,可能参与系统性红斑狼疮的发病。     

骨髓间充质干细胞分泌的蛋白及其功能

摘要：骨髓间充质干细胞的主要功能是支持和营养造血细胞,其提供的微环境由其分泌的可溶性物质、细胞表面分子以及细胞外基质组成,这三者中研究较多并且更有现实意义的是骨髓间充质干细胞分泌的可溶性物质。骨髓间充质干细胞除了可以分泌一些造血功能必须的细胞因子,如白细胞介素6、白细胞介素7、白细胞介素8、白细胞介素11、白细胞介素12、白细胞介素14、白细胞介素15、白血病抑制因子、粒细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子和干细胞因子,长期支持造血干细胞的造血功能。还可以分泌许多神经营养因子,如脑源性神经营养因子、胶质源性神经营养因子、神经生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经营养因子、肝细胞生长因子和血小板衍生的生长因子等,这些因子可以参与中枢神经系统的神经再生,促进损伤脑组织的生存与重塑。     

系统性红斑狼疮患者血清及骨髓基质细胞分泌转化生长因子β1水平

背景：转化生长因子β1是重要的免疫调节因子已被证实，但有关其与系统性红斑狼疮之间的关系还不很清楚。 目的：检测转化生长因子β1在系统性红斑狼疮患者血清及骨髓基质细胞培养液中的水平。 设计：病例-对照分析。 对象：选择2006-02/2007-02中山大学附属第五医院门诊及住院的系统性红斑狼疮患者55例，其中5例同意行骨髓像检查的重度系统性红斑狼疮患者合并中度贫血，经实验室检查符合慢性病贫血；应用SLEDAI评分标准对患者活动度进行评估，轻度13例、中度22例、重度20例。以同期自愿献血的健康者24例作为对照组，其中4例经临床表现及实验室诊断为缺铁性贫血。 方法：所有受试者晨起空腹抽取静脉血2 mL，离心后取上清液，-20℃保存待测。采用密度梯度离心和贴壁筛选法对5例贫血系统性红斑狼疮患者和4例缺铁性贫血患者骨髓基质细胞进行分离培养，制备骨髓基质细胞培养上清液待测。 主要观察指标：采用双抗体酶联免疫吸附法检测各组血清标本、骨髓基质细胞培养上清液标本中的转化生长因子β1水平，及其与SLEDAI积分、血沉、补体C3的相关性。 结果：与对照组比较，系统性红斑狼疮组血清转化生长因子β1水平明显降低（P < 0.01）；且轻、中、重度系统性红斑狼疮患者血清转化生长因子β1水平逐渐降低（P < 0.05）。与对照组比较，系统性红斑狼疮组骨髓基质细胞培养上清液中转化生长因子β1水平明显降低（P < 0.01）。系统性红斑狼疮患者血清转化生长因子β1水平与SLEDAI积分呈负相关（r=-0.862，P < 0.01），与疾病同期活动指标血沉呈负相关（r = -0.56，P < 0.05），与补体C3呈正相关（r=0.78，P < 0.05）。 结论：系统性红斑狼疮骨髓基质细胞分泌转化生长因子β1存在异常，并且转化生长因子β1可能参与了系统性红斑狼疮的发病及转归，对判断其病情活动度及研究系统性红斑狼疮的发病机制有一定临床意义。     

当归补血汤载药血清干预后骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌

背景：实验表明,当归补血汤的有效成分多糖对造血干细胞和造血祖细胞的增殖分化存在显著的促进作用,对造血微环境具有重要的调控作用。 目的：观察当归补血汤载药血清干预后小鼠骨髓基质细胞中粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的分泌状况。 方法：分离骨髓基质细胞,于96孔板培养,在相差显微镜下观察细胞形态和生长状况;将细胞分4组,加含有不同剂量的当归补血汤载药血清进行干预,采用MTT法检测各组细胞的增殖活性,ELISA法检测粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3的表达情况。 结果与结论：当归补血汤载药血清可明显促进骨髓基质细胞的增殖,促进骨髓基质细胞分泌粒细胞集落刺激因子和白细胞介素3,呈剂量依赖性,含等效剂量载药血清组促增殖作用和促分泌作用优于其他各组,浓度过高可减弱细胞的增殖分泌效应。     

体外条件下人骨髓间充质干细胞与NZBW F1鼠T淋巴细胞的免疫调节

背景：近年研究发现系统性红斑狼疮患者的间充质干细胞存在异常,自体造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮复发率高,有学者提出系统性红斑狼疮不仅是造血干细胞病,也是间质干细胞病。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞在体外对NZBW F1鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用。 设计、时间及地点：细胞共培养体外实验,于2008-03/09在江苏大学附属医院中心实验室完成。 材料：健康人骨髓由江苏大学附属医院研究生自愿捐献。SPF级20周龄NZBW F1雌鼠9只,购自南京大学动物模式研究所。 方法：Percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,取P3代细胞用于实验。20周龄NZBW F1小鼠适应性饲养至24周龄时,无菌分离脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A刺激下,将T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞分别以不同比例(1∶0.01,1∶0.02,1∶0.1)共培养72 h,并设立对照组。 主要观察指标：MTT法检测T淋巴细胞增殖,流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡和CD69,CD28表达,实时荧光定量PCR检测T淋巴细胞白细胞介素10、干扰素γ mRNA水平。 结果：与对照组比较,在体外人骨髓间充质干细胞能抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P < 0.05)。与对照组比较,T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.02和1∶0.1时,骨髓间充质干细胞可抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进T淋巴细胞干扰素γ mRNA表达,抑制白细胞介素10 mRNA表达;T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.01时,T淋巴细胞凋亡情况和干扰素γ、白细胞介素10 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：人骨髓间充质干细胞体外在一定比例下可能通过抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖和凋亡、干预Th1/Th2细胞因子mRNA表达,继而下调T淋巴细胞的免疫功能。     

人角膜基质成纤维细胞分泌作用与脂多糖的影响

背景：体外培养的角膜基质成纤维细胞,可以识别革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖,并释放多种细胞因子和趋化因子,从而促进角膜溃疡的形成。 目的：观察细菌脂多糖对角膜基质成纤维细胞分泌作用的影响。 方法：体外培养人角膜基质细胞,取第3~5代细胞鉴定后用于实验。采用ELISA法检测角膜基质细胞脂多糖作用前后培养上清中分泌白细胞介素1,肿瘤坏死因子α,白细胞介素6,白细胞介素8水平。 结果与结论：脂多糖在一定质量浓度范围及作用时间内,对人角膜基质细胞增殖存活率没有影响。培养的人角膜基质成纤维细胞不表达白细胞介素1,肿瘤坏死因子α,未给予脂多糖的角膜基质细胞微量表达白细胞介素6,白细胞介素8,脂多糖(100 μg/L)作用24 h后,白细胞介素6,白细胞介素8水平明显增高。     

骨髓基质细胞对多细胞因子介导人脐血单个核细胞体外扩增的影响*

背景：体外扩增脐血造血细胞的目的是促进脐血造血细胞的植入能力,细胞因子介导的脐血造血细胞能使细胞数有效扩增,但同时也耗竭了具有分化潜能的造血干细胞。 目的：观察骨髓基质细胞对多细胞因子组合介导人脐血单个核细胞体外扩增及扩增后黏附分子和CXCR4表达的影响。 方法：将分离的人脐血单个核细胞接种在预先建立的人骨髓基质细胞层上,分组培养：对照组仅含有脐血单个核细胞;多种细胞因子+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+脐血单个核细胞组;骨髓基质细胞+多种细胞因子+脐血单个核细胞组。培养0,7 d检测有核细胞数, CD34+细胞数及CD34+CXCR4+,CD34+CD62L+,CD34+CD49d+的细胞数。 结果与结论：单纯骨髓基质细胞和单用细胞因子组均可有效地扩增脐血造血细胞,并提高造血细胞上CD49d,CD62L及 CXCR4表达。而单用细胞因子组促进脐血造血细胞扩增能力较单纯骨髓基质细胞强,提高造血细胞CD49d,CD62L及 CXCR4表达能力较单纯骨髓基质细胞差。提示骨髓基质细胞虽可支持脐血造血细胞扩增,但难以实现造血细胞的大量扩增,但在骨髓基质细胞层的支持下,多细胞因子可有效地促进脐血造血细胞的扩增,并优于单用细胞因子及骨髓基质细胞,证实骨髓基质细胞可协同多细胞因子有效地促进脐血单个核细胞的扩增,促进造血干细胞的黏附和趋化能力。     

儿童骨髓增生异常综合征造血前体细胞增殖与白细胞介素15的影响

白细胞介素15是一种重要的骨髓生长调节因子,可能具有刺激骨髓增生异常综征 CD34+细胞增殖的作用。 目的：观察白细胞介素15对儿童骨髓增生异常综合征造血细胞增殖的影响。 方法：采用细胞计数、MTT抑制实验检测0,10,20,50,100,200 µg/L白细胞介素15对18例1~14岁儿童骨髓增生异常综合征患者 CD34+细胞增殖的影响,找出白细胞介素15作用的峰浓度。以白细胞介素15达到峰值的浓度为实验组,不加白细胞介素15的为对照组,培养12 d以了解细胞最佳增殖时间。 结果与结论：体外培养的骨髓CD34+细胞在培养第8天生长状况最好,并且随着白细胞介素15 质量浓度的增加,其活细胞数也随着增加,当白细胞介素15为100 µg/L时,其增殖状况最好;当白细胞介素15为200 µg/L时,其增殖状况反而欠佳。在培养的第8天,白细胞介素15对骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+细胞抑制率最低,当其浓度在0~100 µg/L范围内,随质量浓度增加,其抑制作用递减,而当其质量浓度>100 µg/L其抑制作用有所增强。说明白细胞介素15呈时间和剂量依赖性地促进骨髓增生异常综合征患者骨髓CD34+造血干/祖细胞增殖。     

银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平

背景：课题组在前期研究中发现银屑病患者骨髓造血细胞活性存在异常。 目的：观察银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。 设计、时间及地点：病例-对照观察,于2007-10/2008-08在太原市中心医院皮肤科实验室完成。 对象：选择太原市中心医院皮肤科临床及病理确诊为寻常型银屑病的门诊患者24例,男16例,女8例;年龄16~59岁;另取血液科骨穿后经筛选的正常骨髓20例作为对照组,性别、年龄与银屑病患者匹配。 方法：采用密度梯度离心法分离银屑病患者与对照组骨髓单一核细胞,通过贴壁法培养骨髓基质细胞,收集传了3代后又培养72 h的骨髓基质细胞及培养上清。 主要观察指标：流式细胞仪检测细胞表面标志并用ELISA法检测上清液中干细胞因子和粒细胞集落刺激因子的水平。 结果：流式细胞仪检测结果显示,90%以上细胞表面抗原高表达CD29,而CD34、CD45及HLA-DR表达阴性,即骨髓基质细胞纯度在90%以上。银屑病组骨髓基质细胞培养上清液的干细胞因子和粒细胞集落刺激因子表达均显著高于对照组 (P < 0.01)。 结论：银屑病患者骨髓基质细胞分泌干细胞因子和粒细胞集落刺激因子存在异常,提示银屑病患者骨髓造血微环境发生了改变。     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对骨髓基质细胞的毒性作用

背景：已证实肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）能选择性诱导白血病细胞凋亡，并且不影响正常造血干/祖细胞的功能。但TRAIL对作为造血微环境核心的骨髓基质细胞的毒性作用如何，据作者查新检索目前尚未见系统报道。 目的：通过观察TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导效应及其造血支持功能的影响，继而评价TRAIL对骨髓基质细胞的毒性作用。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2006-03/10在解放军沈阳军区总医院中心实验室完成。 材料：血常规、骨髓涂片细胞检查正常的骨髓标本11份，取自解放军沈阳军区总医院血液科。化疗药物柔红霉素为浙江海正药业股份有限公司产品，国药准字H33020925。 方法：Percoll+贴壁法体外分离培养骨髓基质细胞，达80%融合时胰蛋白酶消化扩增，取处于对数生长期的细胞，分为4组，空白对照组不进行任何干预，柔红霉素组加入0.5 μmol/L柔红霉素作用24 h，TRAIL组加入200 μg/L TRAIL作用18 h，联合组加入0.5 μmoL/L柔红霉素作用6 h后再以200 μg/L TRAIL作用18 h。取第2代骨髓基质细胞，60Co射线照射消除内源性造血集落，接种后去除悬浮细胞，TRAIL组以200 μg/L TRAIL作用基质细胞层18 h，按1×105/孔将骨髓单个核细胞接种于基质细胞层，扩增5 d后加入甲基纤维素培养体系，于37 ℃、体积分数为0.05的CO2饱和湿度条件下培养10 d。 主要观察指标：荧光显微镜观察诱骗受体在骨髓基质细胞的表达及定位，流式细胞仪检测柔红霉素对骨髓基质细胞诱骗受体表达的影响，AnnexinⅤ/PI标记TRAIL对骨髓基质细胞的凋亡诱导作用及对其造血支持功能的影响。 结果：诱骗受体DcR1和DcR2在骨髓基质细胞中均有表达，主要定位于胞膜及胞浆。0.5 μmol/L柔红霉素作用24 h后，基本不影响诱骗受体DcR1和DcR2的表达水平。与空白对照组细胞凋亡率比较，TRAIL组无明显变化（t=0.973，P > 0.05）；柔红霉素组、联合组均显著升高（t=5.141，P=0.001；t=4.187，P=0.002），此两组间比较差异无显著性意义（t=1.222，P > 0.05）。与空白对照组比较，TRAIL组骨髓单个核细胞数、粒-巨噬集落形成单位均无明显变化（t=1.313，P > 0.05；t=1.172，P > 0.05） 结论：TRAIL的诱骗受体DcR1及DcR2在骨髓基质细胞均有表达，使骨髓基质细胞免于TRAIL的凋亡诱导效应，且TRAIL不增强柔红霉素对骨髓基质细胞的细胞毒性作用。     

胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞的归巢机制

背景：间充质干细胞移植后是否成功,依赖于经静脉输注后能否定居于靶器官并长期存活,这个过程被称为归巢。然而,调节和控制间充质干细胞归巢的分子机制目前尚不十分清楚。 目的：探讨胎儿骨髓源Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢的机制,观察基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4对干细胞归巢效率的影响,摸索提高其归巢和长期植入效率的方法。 设计、时间及地点：细胞学体内实验,于2005-09/2006-07在中国医学科学院、中国协和医科大学组织工程中心完成。 材料：Flk1+骨髓间充质干细胞来源于流产胎儿,由天津医科大学第二附属医院妇产科提供。6~8周龄NOD/SCID小鼠购自中国医学科学院实验动物研究所。 方法：采用流式细胞仪、实时定量PCR等方法检测特定细胞因子刺激前后Flk1+间充质干细胞CXCR4表达和体外迁移能力的变化。NOD/SCID小鼠预先经全身亚致死量照射后,从尾静脉输入经或未经细胞因子刺激的Flk1+间充质干细胞,对照组注射等体积生理盐水。移植后24 h,应用流式细胞仪分析骨髓中供体细胞的含量,或在移植后定期从小鼠的尾静脉取血,分析外周血中白细胞、红细胞及血小板的数量变化。移植后6个月,实时定量PCR法检测小鼠骨髓中的人特异性DNA含量,了解人源细胞的植入情况。 结果：Flk1+间充质干细胞的胞浆中有CXCR4表达,在适当细胞因子刺激下,能够在短时间内被诱导至细胞表面表达。通过24 h短时间细胞因子刺激,不仅能够上调细胞表面及内部的CXCR4,而且可以增加细胞在体外沿基质细胞衍生生长因子1浓度梯度迁移的活性,促进细胞植入经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠体内后向骨髓的归巢及长期存活,同时也加快了受体小鼠的造血恢复;用CXCR4中和抗体处理的Flk1+间充质干细胞,则明显减少其移植后在受体小鼠中的归巢和植入。 结论：基质细胞衍生生长因子1及其受体CXCR4在Flk1+间充质干细胞迁移和归巢中发挥着重要作用,增加细胞表面CXCR4的表达,有助于促进Flk1+间充质干细胞向骨髓归巢和加快受体造血恢复。     

miR-124 and miR-128 differential expression in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells

BACKGROUND: MicroRNA (miRNA) expression in stem cells provides important clues for the molecular mechanisms of stem cell proliferation and differentiation. Bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells exhibit potential for neural regeneration. However, miRNA expression in these cells has been rarely reported. OBJECTIVE: To explore differential expression of two nervous system-specific miRNAs, miR-124 and miR-128, in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells.DESIGN, TIME AND SETTING: An In vitro, cell biology experiment was performed at the Department of Biotechnology, Shanxi Medical University from June 2008 to June 2009.MATERIALS: TaqMan miRNA assays were purchased from Applied Biosystems. METHODS: Rat bone marrow stromal cells were isolated and cultured using the whole-bone marrow method, and rat spinal cord-derived neural stem cells were obtained through neurosphere formation. TaqMan miRNA assays were used to measure miR-124 and miR-128 expression in bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells.MAIN OUTCOME MEASURES: Morphology of bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells were observed by inverted microscopy. Expression of the neural stem cell-specific marker, nestin, the bone marrow stromal cell surface marker, CD71, and expression of miR-124 and miR-128, were detected by real-time polymerase chain reaction. RESULTS: Cultured bone marrow stromal cells displayed a short fusiform shape. Flow cytometry revealed a large number of CD71-positive cells (> 95%). Cultured spinal cord-derived neural stem cells formed nestin-positive neurospheres, and quantitative detection of miRNA demonstrated that less miR-124 and miR-128 was expressed in bone marrow stromal cells compared to spinal cord-derived neural stem cells (P < 0.05). CONCLUSION: Bone marrow stromal cells and spinal cord-derived neural stem cells exhibited differential expression of miR-124 and miR-128, which suggested different characteristics in miRNA expression.     

Serum cytokine levels in Bell's palsy

OBJECTIVE: To assess the significance of the serum levels of the cytokines (interleukine (IL-6, IL-8, IL-1b, IL-2r, and tumor necrosis factor alpha (TNF - alpha)) in the patients with Bell's palsy. STUDY DESIGN: A clinical and laboratory study in which serum cytokine levels were compared between the patients who had Bell's palsy and healthy controls. METHODS: Twenty-three patients with Bell's palsy and 30 healthy volunteers were included in the study. The blood samples of the patients and controls were obtained, and serum IL-1b, IL-2r, IL-6, IL-8, and TNF- alpha levels determined with chemiluminescence enzyme immunometric assay on an Immulite Immunoassay. The serum of the patients was taken between 2 days and 1 month after the disease. The assay was not in vitro lymphocyte stimulation. RESULTS: The IL-6, IL-8 and TNF- alpha levels were significantly higher in Bell's palsy than in controls (p < 0.05). The IL-1b and IL-2r levels were similar in both groups (p > 0.05). The levels of cytokine IL-6, IL-8, TNF- alpha, IL-1b, IL-2r did not correlate with the degree of recovery (p > 0.05). CONCLUSION: An alteration in the concentration of the cytokines is expected not only in many inflammatory and infectious diseases but also in Bell's palsy. Cytokines are not stored or preformed within cells. Therefore, high cytokine levels (IL-6 and IL-8, and TNF- alpha) should represent their production in response to underlying pathology in Bell's palsy, or these cytokines may be pathogenetic factors in Bell's palsy. However, serum levels of these cytokines do not help determine the prognosis in Bell's palsy as far as the results of this study are concerned.     

改良Dexter法与IMDM培养基培养骨髓基质细胞的比较*★

背景：体外分离培养骨髓基质细胞，并于骨髓移植后将其注入严重联合免疫缺陷鼠体内，对于促进造血及免疫重建尤为必要。 目的：比较骨髓基质细胞在不同培养条件下的生长状况，寻找一种体外分离培养扩增骨髓基质细胞简单而实用的方法。 设计、时间及地点：体外对比观察实验，于2006-07/2007-01在太原市中心医院皮肤科实验室完成。 材料：人骨髓取自太原市中心医院血液科经筛选的正常骨髓(取材均经患者同意)。 方法：分离人骨髓单个核细胞，对照组采用改良Dexter法培养：将骨髓单个核细胞用5×10-7mol/L氢化可的松的RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×109 L-1，以每孔1 mL接种于24孔培养板，培养2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每3 d半量换液1次。细胞生长至半融合状态时传代，传两三代后用胰酶消化，收集细胞，液氮冷冻保存。实验组用IMDM培养基培养：用不含氢化可的松的IMDM培养基培养，其余成分及培养条件均与对照组相同。2 d后全量换液，去除非贴壁细胞，之后每4天半量换液1次。传代及收集方法同对照组。 主要观察指标：通过倒置显微镜观察细胞贴壁情况、形态变化及增殖状态，MTT比色法检测细胞增殖活性。 结果：倒置显微镜下，两组培养细胞在接种24 h后细胞大量贴壁并伸展开，随着培养时间延长，贴壁细胞数量增多，14 d左右细胞铺满板底达融合状态。传代细胞经消化后变形，24 h后恢复原来形态，并贴壁增殖，形态和原代细胞相似，4.0~ 5.0 d后呈融合状态。两种方法培养的骨髓基质细胞增殖活性差异无显著性意义（P > 0.05）。 结论：改良Dexter法及IMDM培养基培养均可使骨髓基质细胞在短期内贴壁及增殖。IMDM培养基由于不需加氢化可的松，故比改良Dexter法更易于操作。     

Intracellular cytokine profile in T-cell subsets of multiple sclerosis patients: different features in primary progressive disease

OBJECTIVE: To evaluate the expression of cytokines in both CD4+ and CD8+ T cells derived from peripheral blood of untreated multiple sclerosis (MS) patients with either relapsing-remitting (RR), secondary progressive (SP) or primary progressive (PP) MS and healthy controls (HC). BACKGROUND: MS is an immune-mediated disease and cytokines hove been hypothesized to contribute significantly to disease progression. Compared to the relapse-onset (RR, SP) form of the disease, PPMS patients have different clinical, immunological and pathological features. Surprisingly, the ability of their circulating T cells to produce immunoregulatory cytokines has not been extensively studied so far. METHODS: Seventy-two MS patients (24 RR, 26 SP, 22 PP) and 34 HC were studied. Stimulated peripheral blood derived CD4+ and CD8+ T MS patients express significantly more CD4+ and CD8+ T cells were analyzed for IFN-gamma, IL-2, TNF-alpha, IL-4, IL-10 and IL-13 production. RESULTS: cells producing IFN-gamma compared to HC. Compared to the other forms of the disease, PPMS patients display a significant decrease in CD4+ T cells producing IL-2, IL-13 and TNF-alpha and a significant increase in CD8+ T cells producing IL-4 and IL-10. CONCLUSIONS: The data presented here demonstrate that patients with PPMS express less pro- and more anti-inflammatory cytokine producing T cells compared to the relapse-onset form of the disease, confirming the view on PPMS as a distinct disease entity.     

Tc1/Tc2 and Th1/Th2 balance in Asian and Western types of multiple sclerosis, HTLV-I-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis and hyperIgEaemic myelitis

CD8+ T cells, like CD4+ T cells, can differentiate into at least two subsets with distinct cytokine patterns: Tc1 cells produce Th1-like cytokines and Tc2 cells produce Th2-like cytokines. To clarify the immunopathological roles of Tc1 and Tc2 cells in central nervous system (CNS) inflammation, we examined intracellular cytokines in CD8+ and CD4+ T cells by flow cytometry and analyzed the Tc1/Tc2 balance as well as the Th1/Th2 balance in 80 patients with various CNS inflammatory diseases, including 20 with optico-spinal multiple sclerosis (OS-MS), 21 with conventional MS (C-MS), 22 with human T-lymphotropic virus type I (HTLV-I)-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP) and 17 with hyperIgEaemic myelitis. Twenty-two healthy subjects were also examined as controls. Patients with OS-MS showed a significantly higher percentage of INF-gamma+IL-4- CD8+ T cells as well as CD4+ T cells and a significantly higher intracellular interferon-gamma (IFN-gamma)/interleukin-4 (IL-4) ratio both in CD8+ and CD4+ T cells throughout the relapse and remission phases than the healthy controls. Furthermore, the patients with OS-MS showed a significantly lower percentage of INF-gamma-IL-4+ CD4+ T cells as well as CD8+ T cells during the relapse phase than the healthy controls. On the other hand, the patients with C-MS showed a significantly higher percentage of IFN-gamma-IL-4+ CD8+ T cells in addition to more IFN-gamma+IL-4- CD4+ T cells during the relapse phase than the healthy controls. The HAM/TSP patients showed a significantly higher percentage of INF-gamma+IL-4- CD8+ T cells and a significantly higher intracellular IFN-gamma/IL-4 ratio in CD8+ T cells than the healthy controls. In contrast, in hyperIgEaemic myelitis, in addition to a significantly lower intracellular IFN-gamma/IL-4 ratio in CD4+ T cells, a tendency toward a lower intracellular IFN-gamma/IL-4 ratio in CD8+ T cells in comparison to the healthy controls was observed. These results clarified for the first time the distinct Tc1/Tc2 balance in each disease condition as follows: Tc1 cell response is predominant in OS-MS and HAM/TSP, while Tc2 cell response is predominant in hyperIgEaemic myelitis and at relapse phase of C-MS. Furthermore, our results suggest that CD8+ T cells play an adjunctive role in disease induction and the clinical course of MS.     

重症肌无力患者血清Th1/Th2/Th17细胞因子的变化及意义

目的：分析重症肌无力（MG）患者血清CD4^＋ T细胞主要细胞因子的水平,探讨不同亚型CD4^＋ T细胞分泌的细胞因子在MG发病机制中的作用。方法：用ELISA测定93例MG患者和34名健康对照者血清中各项细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10、IL-13和IL-17）的水平,分组行统计学分析。结果：与健康对照组相比,MG患者Th1细胞相关各细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ及TNF-α）均明显升高,差异有统计学意义（P〈0.05）;Th2细胞相关的细胞因子IL-4、IL-10差异无统计学意义（P〉0.05）,仅IL-13水平升高;Th17细胞的细胞因子IL-17水平差异无统计学意义（P〉0.05）。MG眼肌型与全身型患者血清中各细胞因子水平的差异无统计学意义（P〉0.05）,在不同病程的MG患者中差异也无统计学意义（P〉0.05）。结论：Th1细胞因子在MG发病机制中发挥重要作用,而Th2细胞及其细胞因子在MG机制中的角色各异。