体外条件下人骨髓间充质干细胞与NZBW F1鼠T淋巴细胞的免疫调节

背景：近年研究发现系统性红斑狼疮患者的间充质干细胞存在异常,自体造血干细胞移植治疗系统性红斑狼疮复发率高,有学者提出系统性红斑狼疮不仅是造血干细胞病,也是间质干细胞病。 目的：探讨人骨髓间充质干细胞在体外对NZBW F1鼠脾脏T淋巴细胞的免疫调节作用。 设计、时间及地点：细胞共培养体外实验,于2008-03/09在江苏大学附属医院中心实验室完成。 材料：健康人骨髓由江苏大学附属医院研究生自愿捐献。SPF级20周龄NZBW F1雌鼠9只,购自南京大学动物模式研究所。 方法：Percoll密度梯度离心法分离培养人骨髓间充质干细胞,取P3代细胞用于实验。20周龄NZBW F1小鼠适应性饲养至24周龄时,无菌分离脾淋巴细胞,在刀豆球蛋白A刺激下,将T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞分别以不同比例(1∶0.01,1∶0.02,1∶0.1)共培养72 h,并设立对照组。 主要观察指标：MTT法检测T淋巴细胞增殖,流式细胞仪检测T淋巴细胞凋亡和CD69,CD28表达,实时荧光定量PCR检测T淋巴细胞白细胞介素10、干扰素γ mRNA水平。 结果：与对照组比较,在体外人骨髓间充质干细胞能抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖,且呈剂量依赖性(P < 0.05)。与对照组比较,T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.02和1∶0.1时,骨髓间充质干细胞可抑制T淋巴细胞的凋亡,并促进T淋巴细胞干扰素γ mRNA表达,抑制白细胞介素10 mRNA表达;T淋巴细胞与骨髓间充质干细胞比例为1∶0.01时,T淋巴细胞凋亡情况和干扰素γ、白细胞介素10 mRNA表达无明显差异(P > 0.05)。 结论：人骨髓间充质干细胞体外在一定比例下可能通过抑制NZBW F1鼠T淋巴细胞的增殖和凋亡、干预Th1/Th2细胞因子mRNA表达,继而下调T淋巴细胞的免疫功能。     

人脐带源间充质干细胞体内外移植的免疫学特征

背景：部分体外实验证实人脐带源间充质干细胞具有同种异体的免疫耐受特性,然而对其体内研究尚处于异种异体之间,且结果及机制缺少统一性。 目的：培养人脐带源间充质干细胞,通过体内外试验分析其移植免疫学特性。 方法：应用组织块贴壁法提取人脐带源间充质干细胞,通过体外淋巴细胞混合反应检测其同种异体免疫耐受作用;应用流式细胞仪检测体内行人脐带源间充质干细胞移植前后患者血液中CD4、CD8浓度及比值变化,并通过ELISA方法对比体外淋巴细胞混合培养前后血液、培养上清及体内移植前后患者血液中白细胞介素2,10、γ-干扰素的浓度变化。 结果与结论：体内外实验中,混合淋巴细胞反应前后血浆及细胞上清中的细胞因子浓度变化呈相似趋势：白细胞介素10较反应前上升(P < 0.05),γ-干扰素较反应前下降(P < 0.05)。人脐带源间充质干细胞移植后患者T细胞亚群中CD4+/CD8+比值较移植前轻度下降。说明人脐带源间充质干细胞具有同种异体免疫耐受及免疫调节作用。     

人脐血间充质干细胞对T淋巴细胞旁分泌的免疫调节作用**☆

背景：相关研究表明脐血间充质干细胞具有一定的免疫调节作用,但具体机制不详。 目的：观察脐血源间充质干细胞通过旁分泌机制对T淋巴细胞增殖的影响。 方法：分离正常分娩产妇脐血间充质干细胞和健康志愿者外周血T淋巴细胞,按不同比例建立脐血间充质干细胞与T淋巴细胞非接触共培养体系,以单独培养T淋巴细胞作为对照组。 结果与结论：脐血间充质干细胞形态学呈现成纤维梭型细胞样,呈旋涡状团集生长。流式细胞仪检测脐血间充质干细胞表面标记物：CD29(+),CD44(+),CD34(-),CD45(-),HLA-DR(-);与对照组相比,共培养组可明显抑制植物血凝素刺激T淋巴细胞的增殖作用(P < 0.05),且呈剂量依赖性;ElISA法检测共培养组分泌的白细胞介素10水平较对照组明显升高(P < 0.05);中和试验后脐血间充质干细胞对T淋巴细胞增殖的抑制作用明显减弱。结果说明脐血间充质干细胞可明显抑制异体外周血T淋巴细胞的增殖,可能是通过旁分泌白细胞介素10达到负向免疫调节作用。     

AG490对人淋巴细胞增殖过程中白细胞介素2，6及γ-干扰素分泌的影响：与环孢素A和他克莫司作用等同吗？

背景：AG490是新近发现的一种JAK激酶抑制剂,可以和受体酪氨酸激酶竞争结合位点,从而通过阻断JAK/STAT通路达到抑制γ-干扰素等器官移植排斥反应相关细胞因子活化,进而抑制器官抑制排斥反应。 目的：验证AG490作为免疫抑制剂的可能性及其基本作用途径,并与环孢素A及他克莫司相比较。 设计、时间及地点：对照观察,于2007-10/2008-04在福建省协和医院泌尿外科研究所完成。 材料：AG490购自美国SIGMA公司。 方法：取8位健康成年人外周静脉血,密度梯度法分离淋巴细胞,分别应用植物血凝素、白细胞介素2、淋巴细胞混合培养诱导人淋巴细胞产生增殖。 主要观察指标：分别采用酶联免疫吸附法检测在AG490、环孢素A、他克莫司作用下人淋巴细胞(T,B混合存在)增殖过程中细胞因子白细胞介素2、白细胞介素6、γ-干扰素的质量浓度。 结果：在体外实验中,AG490对于植物血凝素、白细胞介素2刺激及淋巴细胞混合培养引起的人淋巴细胞增殖反应中白细胞介素2、γ-干扰素的分泌可以起到抑制作用(P < 0.05),但对于白细胞介素6分泌无抑制作用(P < 0.05),此作用与临床常用免疫抑制剂环孢素A、他克莫司相类似。 结论：AG490有可能是一种潜在的免疫抑制剂。     

成骨诱导或干扰素γ预处理对胎儿骨髓源Flk-1+间充质干细胞免疫活性的调节

背景：骨髓间充质干细胞在修复异基因组织最终分化为特定细胞后，理论上会因MHC及共刺激分子上调而引起组织排斥，但实际上并没有发生排斥反应。推测骨髓间充质干细胞在异基因组织分化诱导及炎性因子微环境作用下，有可能分化成一种仍具有免疫调节活性的终末细胞，不被机体的免疫识别系统清除掉。 目的：在体外运用成骨诱导及干扰素γ预处理来模拟体内组织分化及炎性因子微环境，观察在此作用下胎儿骨髓源Flk-1+间充质干细胞是否能够保持其在自然条件下所呈现的免疫学活性。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2007-09/2008-05在北京协和医学院基础学院完成。 材料：2例骨髓样品取自流产胎儿，由北京回龙冠妇产医院提供。外周血样品取自15~35岁健康志愿者，由北京三○七医院提供。地塞米松等诱导因子和干扰素γ为美国Sigma公司产品。 方法：Ficoll法分离胎儿骨髓单个核细胞，取白环层以上细胞，以1×106/cm2密度接种，贴壁法纯化，采用阴性分选法去除CD45+、GlyA+和CD34+细胞，分离扩增得到Flk-1+骨髓间充质干细胞。以淋巴细胞分离液梯度离心分离外周血单个核细胞，用于混合淋巴细胞培养实验及有丝分裂原刺激的淋巴细胞增殖实验。 主要观察指标：流式细胞仪鉴定细胞表型，用成骨、成脂、成软骨和成内皮诱导液检测其分化潜能，成骨诱导或干扰素γ预处理后细胞表面抗原表达、对淋巴细胞增殖及活化抗原CD69、CD25表达的影响，对白细胞介素10和转化生长因子β分泌水平的影响。 结果：光镜下骨髓来源的间充质干细胞为成纤维细胞样贴壁生长，均高表达Flk-1，同时高表达黏附分子CD29、CD44、CD105，造血细胞标志CD34、CD45呈阴性；可向成骨、成脂肪、成软骨和成内皮方向分化；低表达MHC-Ⅰ类分子，不表达　　　　MHC-Ⅱ类分子，成骨诱导能上调MHC-Ⅰ表达，干扰素γ预处理可上调MHC-Ⅱ表达。骨髓源Flk-1+间充质干细胞经成骨诱导7 d或干扰素γ预处理48 h后，仍呈低免疫原性，不激发异基因淋巴细胞增殖，抑制植物血凝素刺激的淋巴细胞增殖效果明显增强（t=2.57，P < 0.05），可进一步抑制CD69和CD25的表达，ELISA检测显示其培养上清分泌白细胞介素10水平增强（t=2.66，P < 0.05），但分泌转化生长因子β水平经成骨诱导后无明显变化，干扰素γ预处理后则明显升高。 结论：经成骨诱导或干扰素γ预处理后，骨髓源Flk-1+间充质干细胞仍能保持低免疫原性，且免疫调节活性进一步提高。     

人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血T细胞的调节作用

背景：间充质干细胞具有免疫调节作用,能降低移植后移植物抗宿主病的发生率,治疗自身免疫性疾病。 目的：观察人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者骨髓T淋巴细胞的免疫调节作用。 设计、时间及地点：随机分组设计,体外细胞学对比观察,病例来自2007-09/2008-11南昌大学第一附属医院、南昌大学第二附属医院血液科。实验于2007-09/2008-11在南昌大学第二附属医院血液研究所完成。 对象/材料：选择南昌大学第一附属医院、南昌大学第二附属医院血液科收治的初诊再生障碍性贫血患者22例,其中重型再障6例,男3例,女3例,中位年龄38(16~68)岁;慢性再障16例,男9例,女7例,中位年龄41(25~59)岁。另获取临床正常剖宫产之足月健康胎儿脐带,用于人脐带间充质干细胞的分离、培养和鉴定。 方法：从人脐带中提取并培养间充质干细胞;用密度梯度离心法从再生障碍性贫血患者骨髓中分离T淋巴细胞;将两者共培养,实验分为3组,对照组：单独培养T淋巴细胞,细胞密度1×105/孔;人脐带间充质干细胞组：按1×105/孔,0.5×105/孔﹑0.1×105/孔、0.05×105/孔不同密度接种人脐带间充质干细胞;实验组：T淋巴细胞与人脐带间充质干细胞按不同比例1∶1﹑1∶0.5、 1∶0.1﹑1∶0.05接种于培养基内。 主要观察指标：四甲基偶氮唑盐法检测不同细胞浓度人脐带间充质干细胞对再生障碍性贫血患者淋巴细胞的抑制率;利用流式细胞仪检测T细胞亚群CD4+/CD8+的变化;采用ELISA法测定上清液中造血负调控因子细胞介素2、γ-干扰素的水平。 结果：①用贴壁法培养至第2代的间充质干细胞具有长梭形的典型改变,表面分子检测显示高表达CD166、CD29、CD54,低表达CD13、CD34、CD45,经体外诱导可分化为脂肪细胞。②实验组中人脐带间充质干细胞∶淋巴细胞比例分别为 1∶1、0.5∶1、0.1∶1时间充质干细胞能够抑制再生障碍性贫血患者淋巴细胞的增殖,抑制率分别为(56.2±12.1)%、(43.7± 10.4)%、(28.6±8.9)%,1∶1组抑制作用最强。③人脐带间充质干细胞能够调整再生障碍性贫血患者倒置的CD4+/CD8+比例,抑制再生障碍性贫血患者造血负调控因子白细胞介素2、γ-干扰素分泌水平。 结论：人脐带间充质干细胞在体外对再生障碍性贫血患者T淋巴细胞具有免疫调节作用,这种作用依赖于间充质干细胞数量。     

引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的比较*

背景：骨髓间充质干细胞是多能干细胞,同时可参与免疫调节反应,而成人及引产胎儿骨髓均是间充质干细胞的重要来源。 目的：通过引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞的细胞形态、免疫表型、增殖活性及分泌细胞因子的比较,揭示二者生物学特点的差异。 方法：采用密度梯度离心法分离引产儿与正常成人骨髓单个核细胞,通过贴壁法培养骨髓间充质干细胞,收集传3代后的骨髓间充质干细胞,流式细胞术鉴定其免疫表型、MTT比色法检测其增殖活性以及用ELISA法检测细胞培养上清液中白细胞介素6、血小板源性生长因子和表皮生长因子的水平。 结果与结论：引产儿组和正常成人组骨髓间充质干细胞形态相似、表型相同,分泌细胞因子水平无显著差异,但引产儿细胞增殖活性显著高于正常成人。提示引产儿与正常成人骨髓间充质干细胞除增殖活性有差异外,其余生物学特点相似,引产儿可以为间充质干细胞研究提供新的骨髓来源。     

人脐带沃顿胶间充质干细胞对人外周血T淋巴细胞的免疫调节作用****

背景：骨髓源性间充质干细胞具有低免疫原性和免疫调节作用,但有关人脐带沃顿胶间充质干细胞的免疫调节作用及其机制研究较少。 目的：观察脐带沃顿胶间充质干细胞对异体外周血T淋巴细胞的免疫调节作用及机制。 方法：从人脐带沃顿胶组织块培养中分离出间充质干细胞。将脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清分别与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养,多功能酶标仪测量脐带沃顿胶间充质干细胞及脐带沃顿胶间充质干细胞培养上清与植物凝集素刺激下的人外周血T淋巴细胞共培养72 h后A值;ELISA试剂盒检测培养上清中转化生长因子β1、γ-干扰素的表达。 结果与结论：沃顿胶间充质干细胞对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖有抑制作用,增殖抑制率为56%(P < 0.01),沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖也具有抑制作用,且这种抑制呈剂量依赖性。含50%沃顿胶间充质干细胞培养上清组和100%培养上清组的增殖抑制率分别为8.3%、27%(P < 0.05);沃顿胶间充质干细胞能显著降低T淋巴细胞分泌的γ-干扰素(P < 0.05);可分泌转化生长因子β1,沃顿胶间充质干细胞与T淋巴细胞共培养组的转化生长因子β1分泌量低于沃顿胶间充质干细胞单独培养组(P < 0.05)。提示沃顿胶间充质干细胞及沃顿胶间充质干细胞培养上清对植物凝集素刺激下的T淋巴细胞增殖均有抑制作用,其作用机制可能与细胞间的接触及抑制T淋巴细胞分泌的γ-干扰素有关。     

人胎盘间充质干细胞生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌

背景：由于骨髓源性间充质干细胞的提取造成患者的二次损伤,也存在病毒、细菌污染的可能,扩增、分化能力不高,为此,实验从胎盘中提取间充质干细胞进行研究,了解其分泌抗凋亡细胞因子的情况,探讨其代替骨髓间充质干细胞的可能性。 目的：体外分离培养、扩增人胎盘源性间充质干细胞,研究其基本生物学特性和抗凋亡细胞因子的分泌水平。 方法：提取人胎盘间充质干细胞,显微镜下观察细胞形态;采用流式细胞仪测定细胞周期、凋亡情况及表面标记的表达,研究其增殖和生长特性。ELISA检测血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子的分泌水平。 结果与结论：在体外培养条件下,人胎盘间充质干细胞为贴壁生长,为成纤维细胞样,核浆比大,细胞增殖活跃,凋亡率低,可分泌能抑制细胞凋亡的细胞因子如血管内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子1、肝细胞生长因子。     

脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的作用*★

目的：骨髓间充质干细胞抑制混合淋巴细胞反应及丝裂原刺激的T细胞增殖，是通过自分泌转化生长因子发挥其免疫调节作用,而关于脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖作用的影响及其机制尚不清楚。实验拟观察验证脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖的影响。 方法：实验于2005-07/2006-03在南昌大学第二附属医院血液病研究所、江西省医学分子重点实验室完成。①实验材料：健康产妇分娩后的脐带血及正常志愿者外周血各9份，由南昌大学第二附属医院妇产科提供，产妇及家属对实验知情同意，并经医院伦理委员会批准。②实验方法：采脐血进行间充质干细胞的培养扩增,并经形态学、细胞表面分子测定及定向分化功能加以鉴定。将1.0×105，0.75×105，0.5×105，0.25×105，0.1×105，0.05×105，0.02×105，0.01×105的间充质干细胞加入到经植物血凝素诱导的外周血淋巴细胞增殖体系中,应用MTT法测定细胞增殖率，观察脐血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的影响。应用ELISA法测定脐血间充质干细胞培养上清液中转化生长因子β1水平。 结果：①不同数量脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖均有抑制作用，抑制作用在一定范围内呈细胞剂量依赖性，以淋巴细胞：间充质干细胞为1∶0.75时抑制作用最强。②转化生长因子β1水平与脐血间充质干细胞数量有关，随着间充质干细胞数量增多，转化生长因子β1水平渐增高。③将脐带血间充质干细胞对淋巴细胞增殖的抑制率与转化生长因子β1水平进行相关性分析,两者间存在明显相关性（r =0.85）。 结论：①脐血间充质干细胞对植物血凝素诱导的淋巴细胞增殖有抑制作用，在一定范围内呈细胞剂量依赖性。②脐血间充质干细胞所分泌的转化生长因子β1含量与脐带血间充质干细胞数量呈正相关性。