Cx40、Cx43在失血性休克大鼠血管舒张反应调节中的作用

目的 研究Cx40、Cx43在失血性大鼠肠系膜上动脉内膜依赖的血管舒张反应性调节中的作用及其可能的调节机制.方法 以SD大鼠肠系膜上动脉(superior mesenteric artery,SMA)为研究对象,采用体外缺氧模型,以Cx40或Cx43的反义寡脱氧核苷酸(Cx40/43 antisense oligodeoxyribonucleotide,Cx40/43 AODN)阻断SMA的CxdO或Cx43表达,观察Cx40/43 AODN对缺氧处理SMA舒张反应性、MLCP和MLCK活性等的影响.结果 Cx40 AODN可以显著增加SMA内膜依赖的舒张反应性(P<0.01);Cx43 AODN可以显著降低SMA内膜依赖的舒张反应性(P<0.01).Cx40/43 AODN对SMA的MLCK、MLCP活性无明显作用.结论 Cx40和Cx43参与了失血性休克后内膜依赖的血管舒张反应性的调节,其机制与血管的MLCK和MLCP活性无明显关系.     

缺氧对膀胱平滑肌细胞缝隙连接蛋白40和缝隙连接蛋白43的影响

目的:探讨缺氧环境下缝隙连接蛋白(Cx40、Cx43)在mRNA水平上的变化,研究细胞缺氧和Cx40、Cx43表达变化在不稳定膀胱发病机理上的相关关系。方法:体外培养大鼠膀胱平滑肌细胞,建立细胞缺氧模型;在细胞缺氧1 h后收集细胞,运用逆转录-聚合酶链反应技术分析Cx40、Cx43。结果:缺氧1 h,Cx40、Cx43在mRNA水平上表达较正常氧对照组有明显升高(P<0.01)。结论:细胞缺氧会引起Cx40、Cx43在mRNA水平上表达的变化,这可能与不稳定膀胱的发生有密切联系。     

Cx43在缺氧缺血新生大鼠脑组织中的表达及意义

目的目的研究Cx43在新生大鼠HIBD的表达,探讨其在HIBD的作用及意义。方法7d龄健康SD大鼠128只,随机分为对照组和缺氧缺血组,每组64只。两组大鼠根据处死时相点每组再随机分为6h、24h、48h、72h四个小组,每组16只。每组大鼠取8只,采用HE染色、DNA原位末端标记法、免疫组化染色方法观察各组新生大鼠脑组织病理变化、细胞凋亡及Cx43表达、分布情况;每组另外8只应用Western-blot定量分析Cx43蛋白在皮层及海马的表达。结果对照组各时相点皮层、海马未见DNA原位末端标记法阳性细胞;缺氧缺血组24h组开始细胞凋亡细胞逐渐增多,缺氧缺血组24h、48h、72h组的凋亡阳性细胞分别为15.12±2.68、30.24±3.65、68.72±5.60,各组差异有显著性意义,P<0.01;对照组均有Cx43表达,6h、24h、48h、72h组Cx43染色阳性面积分别为(8.38±0.16)%、(8.38±0.19)%、(8.39±0.03)%、(8.35±0.15)%,各时相点组Cx43阳性表达差异无显著意义,P>0.05;缺氧缺血后6h、24h、48h、72h组Cx43染色阳性面积分别为(18.64±0.30)%、(29.65±0.26)%、(35.34±0.21)%、(42.05±0.31)%,随着缺氧缺血后时间的推移,Cx43阳性表达逐渐增加,各组对比,差异有显著意义,P<0.01;缺氧缺血组与对照组对比,缺氧缺血组各时相点Cx43阳性表达均高于对照组,P<0.01;Western-blot结果:各组电泳均可显示在43～46KD范围的条带,Cx43/GAPDH电泳条带密度比值对照组6h、24h、48h、72h分别为1.00±0.01、0.99±0.02、1.01±0.01、1.01±0.01;缺氧缺血组6h、24h、48h、72hCx43/GAPDH电泳条带比值分别为1.11±0.04、1.25±0.02、1.37±0.01、1.50±0.01;缺氧缺血组与对照组对比,同一时相点Cx43蛋白的表达均较对照组高,P<0.01;缺氧缺血6h组Cx43表达已开始增加,随着缺氧缺血后时间的推移逐渐增加,至72h组最明显,缺氧缺血各组间比较,差异有显著意义,P<0.01;对照组各时相点比较,Cx43蛋白的表达差异无显著意义,P>0.05。结论缺氧缺血后Cx43的表达逐渐增加,其变化规律与神经细胞凋亡严重程度及光镜观察到的脑损伤进展的时间框架相吻合,且发生时间早于细胞凋亡,提示Cx43表达的增加参与了新生大鼠HIBD的病理形成过程,推测其通过缝隙连接增强传播和放大细胞损伤,在HIBD早期发挥“姐妹杀伤效应”,导致和加重脑损害。     

心房颤动对风湿性心脏病心房肌细胞Cx40、Cx43表达的影响

目的　研究风湿性心脏病 (风心病 )伴与不伴心房颤动 (房颤 )患者左、右心房肌细胞Cx40、Cx43的表达 ,探讨房颤与Cx40、Cx43之间的关系。方法　 3 1例换瓣病人分为 3组 :①实验Ⅰ组 ( 11例 )为阵发性房颤或房颤持续时间≤ 6个月 ;②实验Ⅱ组 ( 12例 )为房颤持续时间均 >6个月 ;③对照组 ( 8例 )为窦性心律。手术中分别切取左、右心耳处心房肌组织。用免疫印迹法和免疫组化技术检测左、右心房肌Cx40、Cx43的表达与分布。结果　①每例患者左、右心房肌以及每组中左、右心房肌Cx40、Cx43表达量均值无显著性差异。②实验Ⅰ组与对照组比较 ,Cx40表达量明显降低 (P <0 0 5 ) ,而实验Ⅱ组与对照组比较其降低更加明显 (P <0 0 1)。③Cx43的表达量在 3组间均无显著差异 ;④实验组Cx40阳性染色较对照组明显减少 ,且分布紊乱 (除细胞头尾部外 ,细胞侧面染色增多 )。⑤ 3组间Cx43阳性染色的分布无明显差别。结论　①左、右心房肌Cx40、Cx43的表达与分布均无显著差异。②有房颤者心房肌Cx40表达量下调及分布不均可能与房颤的发生与维持有关。     

新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43表达的变化

目的探讨新生猪缺氧后心肌连接蛋白Cx43 mRNA和蛋白含量的变化。方法对照组(C组):新生猪6头,未吸入低氧;缺氧组(H组):新生猪6头,吸入低氧(FiO2=0.1)维持1 h。于缺氧结束后5 h,免疫荧光染色检测心肌组织细胞缝隙连接蛋白Cx43蛋白的表达,实时荧光定量逆转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测心肌组织Cx43 mRNA的表达。结果H组心肌组织Cx43蛋白的表达显著低于C组(P<0.01),但两组心肌组织Cx43 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论缺氧可导致心肌Cx43蛋白的表达或分布发生变化。     

EMs异位及在位内膜间质细胞Cx43的表达及GJIC功能的体外研究

目的:研究子宫内膜异位症(EMs)的异位与在位内膜间质细胞中Cx43的表达及间隙连接细胞间通讯(GJIC)功能,探讨间质细胞GJIC功能异常对EMs发病的影响.方法:取24例卵巢处子宫内膜异位灶、41例EMs在位内膜以及30例正常子宫内膜,分离出间质细胞,加入雌、孕激素培养,建立体外间质细胞培养模型.利用激光共聚焦显微镜(LSCM)分别检测三组间质细胞的Cx43表达及GJIC功能.结果:间质细胞成功培养率分别为:异位内膜组45.8%(11/24)、EMs在位内膜组92.7%(38/41)、对照组93.3%(28/30),异位内膜间质细胞纯度为95%,在位内膜间质细胞纯度达98%.EMs异位内膜间质细胞中Cx43表达水平及GJIC功能明显比其他两组低,正常对照组的Cx43表达水平及GJIC功能最高,且差异均有显著性(P＜0.01).结论:(1)同时建立EMs异位内膜、在位内膜及正常内膜间质细胞的体外模型,有助于研究EMs的发病机制;(2)间质细胞中Cx43蛋白表达下调及其GJIC功能异常与EMs发生有关,调节Cx43表达或GJIC功能可能是潜在的治疗策略.     

Cx43对大鼠急性水中毒后脑水肿的影响

目的:探讨缝隙连接蛋白43(Cx43) 对大鼠急性水中毒后脑水肿的影响.方法:术前2 h于右脑室注射Cx43阻断剂反义寡核苷酸(ODNs)或生理盐水,大鼠脑水肿由急性水中毒后引起,用抗-胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组织化学标记法观察脑皮质星形胶质细胞形态、数量的变化;用比重梯度法测定脑组织比重.结果:急性水中毒后脑水肿生理盐水对照组脑皮质区GFAP阳性细胞较ODNs 预处理组多(P<0.05),细胞胞体较肥大;生理盐水对照组脑组织比重较ODNs处理组降低明显(P<0.05).结论:阻断Cx43可减轻大鼠急性水中毒后脑水肿的程度,Cx43可能参与了脑水肿的形成.     

正常成人窦房结形态学及Cx43、Cx40的表达

目的 观察正常成人心脏窦房结的细胞构筑及连接蛋白43、40(connexin43、40,Cx43、Cx40)的表达和分布情况. 方法 常规石蜡包埋,HE、Masson染色,选定目标部位行Cx43、Cx40免疫组织化学染色,并进行图像及统计分析. 结果 ①正常成人窦房结细胞组成、形态、排布区别于普通工作心肌.②由房肌、窦房结外周到动脉周围结组织,Cx43、Cx40表达逐渐减弱,胞质染色逐渐浅淡;而Cx40的分布范围在动脉周围窦房结组织中多于外周结组织. 结论 正常成人窦房结的细胞组成、排布及Cx43、Cx40的表达与其电生理起搏、传导特性相符.     

叶酸对胎鼠心肌细胞Cx43表达的影响

目的:观察叶酸对胚胎大鼠心肌细胞Cx43表达的影响,探讨叶酸预防先天性心脏畸形作用的可能机制。方法:受孕大鼠随机分为两组,实验组给予叶酸(2mg/kg/d)灌胃,对照组灌服等量生理盐水。选择ED13.5和ED16.5的胚胎大鼠作为研究对象,SP免疫组织化学染色法观察Cx43在心肌细胞的表达。结果:免疫组织化学染色显示各组胎鼠心肌细胞均可见Cx43阳性表达,阳性产物以颗粒形式散在分布于细胞质内,或呈短线状、链状排列在细胞侧-侧连接处。实验组胎鼠心肌Cx43阳性细胞数明显高于同胎龄对照组(P0.01)。结论:叶酸可增强胎鼠心肌细胞Cx43的阳性表达。     

卡维地洛对扩张型心肌病大鼠心肌Cx43表达的影响

目的:观察卡维地洛对阿霉素诱导的扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy,DCM)大鼠心室肌缝隙连接蛋白43(connexin 43,Cx43)表达的影响。方法:应用多柔比星腹腔注射建立DCM大鼠模型;模型组大鼠按照不同的给药方法随机分为卡维地洛组和模型对照组,卡维地洛组应用卡维地洛加双蒸馏水灌胃,模型对照组和正常对照组用定量的双蒸馏水灌胃,三组均1次/d,灌胃4周。12周末超声测量各组大鼠心脏左心室射血分数(LVEF),逆转录聚合酶链反应法检测Cx43 mRNA,采用免疫组化方法观察Cx43分布。结果:与模型对照组比较,卡维地洛组大鼠心肌Cx43mRNA、Cx43平均灰度值、LVEF及均明显增高,卡维地洛组较模型对照组心肌Cx43的分布紊乱有改善,差异均有统计学意义。结论:卡维地洛能改善DCM大鼠心肌Cx43表达和分布,并能改善其心功能。     

Parathyroid hormone-mitogen-activated protein kinase axis exerts fibrogenic effect of connective tissue growth factor on human renal proximal tubular cells

Background Enhanced and prolonged expression of connective tissue growth factor （CTGF） is associated with kidney fibrosis. Parathyroid hormone （PTH） is involved in the genesis of disturbed calcium/phosphate metabolism and ostitis fibrosa in renal failure. PTH activated mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway is present in renal tubular cells. The aim of this study was to identify the mechanism how the signal is transduced to result in extracellular signal-regulated protein kinase （ERK） activation, leading to upregulation of CTGF.Methods The levels of CTGF mRNA and protein in human kidney proximal tubular cells （HK-2） treated with PTH in the presence or absence of the MAPK inhibitor PD98059 were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting assay. The activation of the CTGF promoter in HK-2 cells was determined by the dual-luciferase assay. The effects of the protein kinase A （PKA） activator 8-Br-cAMP and protein kinase C （PKC） activator phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA） on MAPK phosphorylation, and the effects of the PKA inhibitor H89 and PKC inhibitor calphostin C on MAPK phosphorylation and CTGF expression were detected by immunoblotting assay.Results PD98059 inhibited the PTH stimulated expression of CTGF, which strongly suggested that the MAPK signaling pathway plays an important role in the PTH-induced CTGF upregulation in renal tubular cells. A PKA activator as well as PKC activators induced MAPK phosphorylation, and both PKA and PKC inhibitors antagonized PTH-induced MAPK phosphorylation and CTGF expression.Conclusion CTGF expression is upregulated by PTH through a PKC/PKA-ERK-dependent pathway.     

黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞缝隙连接蛋白43表达的影响

目的 研究黄芩苷对高糖环境下肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cell,GMC）中缝隙连接蛋白43（connexin 43,Cx43）表达的影响.方法 将体外培养的大鼠GMC分为6组：低糖组,高糖组,黄芩苷低、中、高剂量组,蛋白激酶C（protein kinase C,PKC）抑制剂组.培养72 h后,收集细胞并提取细胞总蛋白,Western-blot法检测黄芩苷对高糖环境下GMC中PKC和Cx43表达的影响,用划痕标记染料示踪技术检测黄芩苷对GMC缝隙链接通讯功能（gap junction intercellular communication,GJIC）的影响.结果 Western-blot结果显示,与低糖组比较,高糖组中PKC蛋白表达量显著增加（P〈0.01）,Cx43蛋白表达量显著减少（P〈0.01）;黄芩苷呈剂量依赖性降低PKC蛋白表达水平,升高Cx43蛋白表达水平.划痕标记染料示踪实验结果显示：与低糖组比较,高糖组GMC的GJIC功能缺乏,未向邻近细胞传输;与高糖组比较,PKC抑制剂组罗氏黄荧光染料向划痕两侧邻近细胞传输的层数较黄芩苷各剂量组明显增多,黄芩苷各剂量组呈剂量依赖性地增加传递的层数.结论 黄芩苷可剂量依赖性地抑制高糖环境下GMC中PKC的异常活化,从而上调Cx43表达,恢复GJIC的功能.     

培养大鼠皮层神经元缺氧损伤与蛋白激酶活化关系的研究

目的检测神经元缺氧后膜性PKA(蛋白激酶A)和PKC(蛋白激酶C)活性变化,以及它们的特异性抑制剂对神经元凋亡率的影响.方法建立培养的神经元"缺血"模型,然后用不同浓度的特异性PKA抑制剂Rp-cAMP和特异性PKC抑制剂Calphostin C预孵育培养神经元再进行"缺血"实验,用放射酶分析法测定神经元缺氧后的膜性蛋白激酶活性,各组缺氧神经元的凋亡百分率由TUNEL荧光试剂盒测定.结果随着神经元缺氧时间的延长,神经元膜性PKA和PKC活性均增加;随着Calphostin C浓度的增加,细胞凋亡率显著增加;相反随着Rp-cAMP浓度的增加,细胞凋亡百分率显著减少.结论①PKA和PKC信号转导通路均参与了缺氧神经元损伤;②缺氧后培养神经元PKA和PKC对凋亡的调控功能相反,提示在培养的缺氧神经元中PKA和PKC信号转导属于单相控制系统,可能二者在细胞中的比例决定着缺氧神经元的存亡.     

腹部手术影响小肠平滑肌细胞收缩的细胞内信号转导机制研究

目的:探讨腹部手术操作对小肠平滑肌细胞收缩功能的影响及细胞内信号转导途径。方法:采用Wistar大鼠制作腹部手术动物模型,酶解法获取小肠游离环行平滑肌细胞,检测平滑肌细胞在乙酰胆碱作用下的收缩反应和胞浆游离钙离子浓度([Ca2 ]i)的变化,然后将细胞分别与一氧化氮合酶抑制剂L-NNA、钙活化的K 通道阻滞剂A-pamin、蛋白激酶A抑制剂H89和蛋白激酶G抑制剂KT5823等一同孵育,重复以上实验过程。测定小肠环行平滑肌细胞培养24 h后培养基中一氧化氮(NO)的含量。结果:培养24 h后,实验组小肠环行平滑肌细胞产生的NO量明显高于对照组(P<0.05),L-NNA可明显降低实验组NO的产量,而对照组NO产量没有明显影响;L-NNA和KT5823可明显提高实验组小肠环行平滑肌细胞的收缩能力及乙酰胆碱刺激的[Ca2 ]i升高的水平(P<0.05),而Apamin和H89没有明显的影响。结论:腹部手术操作导致小肠肌层大量生成NO,激活鸟苷酸环化酶产生cGMP,通过PKG途径降低细胞内[Ca2 ]i的水平,抑制小肠平滑肌细胞的收缩能力。     

抗心律失常肽对乳鼠心肌细胞急性缺氧时细胞间传导的影响

目的 研究抗心律失常肽(AAP10)对乳鼠心肌细胞急性缺氧时细胞间传导的影响.方法 原代培养的乳鼠心肌细胞,随机分为正常组、缺氧2 h组和100 nmol/L AAP10干预组,每组n=9.采用划痕标记染料示踪技术测定细胞间通讯,Western blot技术检测缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)磷酸化水平的改变.结果 划痕标记染料示踪技术结果显示缺氧组细胞间传导下降,而AAP10干预后能促进荧光黄的扩散.Western blot结果显示缺氧组总Cx43蛋白表达下降,与正常组比较P＜0.01,而去磷酸化的Cx43(NP-Cx43)蛋白表达不变;AAP10干预组能提高总Cx43蛋白表达,与缺氧组比较P＜0.01,但对NP-Cx43蛋白表达无影响.结论 急性缺氧时磷酸化的Cx43(p-Cx43)蛋白表达下降,而AAP10改善传导主要通过促进Cx43磷酸化.     

Changes in Phosphorylation of Connexin43 in Rats during Acute Myocardial Hypoxia and Effects of Antiarrhythmic Peptide on the Phosphorylation

In order to confirm the hypothesis that during acute hypoxia, the antiarrhythmic peptide (AAP10) could improve conductance by changing the phosphorylation state of connexin43 (Cx43), isolated perfused rat hearts were randomly divided into three groups: control, hypoxia and AAP10 (n=9 in each group). The change in Cx43 phosphorylation was tested by Western-blot; the distribu- tion of Cx43 was observed by confocal immunofluorescence microscopy. Western-blot analysis re- vealed that the expression of total Cx43 protein was significantly decreased during acute hypoxia, while nonphosphorylated Cx43 (NP-Cx43) was unchanged. AAP10 could increase the expression of total Cx43 protein, but had no effects on the NP-Cx43 protein. Immunofluorescence study showed that during acute hypoxia, both total Cx43 and NP-Cx43 proteins were greatly decreased, while AAP10 only increased the expression of total Cx43 protein, but had no effect of the NP-Cx43 protein expression. These findings suggested that the decrease of intercellular communication may be associ- ated with the reduction of phosphorylated Cx43 (p-Cx43) and translocation of NP-Cx43 from the surface of gap junction into intracellular pools during acute hypoxia. AAP10 can improve intercelluar communication by enhancing phosphorylation of Cx43.     

哮喘气道重塑中钙调神经磷酸酶与蛋白激酶活性的相互调节

目的:研究钙调神经磷酸酶(CaN)信号途径与蛋白激酶C(PKC)、丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)和蛋白激酶A(PKA)的相互调节在哮喘气道重塑发病中的作用.方法:建立卵蛋白诱导的哮喘豚鼠模型,实验分为:哮喘组、CaN抑制剂环孢霉素A(CsA)组和对照组,采用磷酸化和去磷酸化方法测定肺组织CaN活性、MAPK活性、PKC活性、PKA活性.在离体培养的大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)中,以尾加压素Ⅱ(UⅡ)为刺激因素,测定CaN,PKC和MAPK活性以及它们之间的相互调节.结果:(1)哮喘组CaN活性、MAPK活性和PKC活性分别较对照组高19%(P<0.01)、28%(P<0.01)和35%(P<0.05),PKA活性较对照组低53%(P<0.01).CsA组CaN活性、MAPK活性和PKC活性分别较哮喘组低52%(P<0.01)、18%(P<0.05)和52%(P<0.01),PKA活性较哮喘组高2.65倍(P<0.01).(2)UⅡ 10-7 mol/L孵育20 min引起ASMC PKC和MAPK活性分别较对照组增加44%和24%(P<0.01),并呈时间依赖性引起ASMC中CaN活性增加,24 h为对照组的1.67倍(P<0.01).(3)与单用UⅡ 10-7 mol/L组比,CaN抑制剂CsA 10-6 mol/L使CaN活性降低了45%(P<0.01),MAPK抑制剂PD98059 50 μmol/L对CaN活性无明显影响(P>0.05),PKC抑制剂H7 50 μmol/L使CaN活性下降21%(P<0.05).(4)CsA 10-6 mol/L 作用使UⅡ 10-7 mol/L刺激的ASMC PKC活性下降了14%(P<0.05),对MAPK活性无明显影响(P>0.05).结论:在哮喘气道重塑的发生过程中,CaN与MAPK、PKC和PKA之间存在相互调节.     

缺氧预处理对人心肌细胞缺氧复氧损伤的影响及其机制

探讨缺氧预处理（PC）对于人类心肌细胞缺氧复氧（H／R）损伤的影响及其机制。方法：在体外分离的人心房和心室肌细胞的H／R模型上观察缺氧PC的作用，及蛋白激酶C（PKC）抑制剂与蛋白磷酸酶激动剂和抑制剂对PC现象的影响。结果：缺氧PC明显减轻H／R造成的心肌细胞损伤，PKC抑制剂H_7和蛋白磷酸酶激动剂BDM分别完全消除PC的细胞保护，而蛋白磷酸酶抑制剂OA则能模拟PC的上述保护效应。结论：人类心肌细胞存在缺氧PC现象，其保护机制可能涉及PKC激活和蛋白磷酸化过程。     

EFFECT OF PHORBOL ESTER ON cAMP-DEPENDENT PROTEIN KINASE ACTIVITY IN CARDIOMYOCYTES

Cardiomyocytes isolated from neonatal rats were treated with phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) ranging from 10^-11 to 10^-7mol/L for 20 min,causing cytosol protein kinase A (PKA) activity to decrease while particulate PKA activity increase in a concentration-dependent manner.The change of PKA activity induced by PMA was abolished completely by pretreatment of polymyxin B or depletion of protein kinase C (PKC).Type Ⅱ PKA activity in particulate fraction was enhanced remarkably,while that of type I PKA was not altered when the cells were treated with 100 nmol/L PMA.The results suggested that subcellular distribution and activity of PKA in cardiomyocytes may be regulated by PKC.