ox-LDL通过NAD依赖性脱乙酰酶SIRT1抑制MHC Ⅱ反式激活蛋白的转录活性

目的:探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)对NAD依赖性脱乙酰酶(NAD-dependent deacetylase)SIRT1表达的影响,及SIRT1调节人体适应性免疫应答过程中的机制?方法:体外培养人的原代外周血单核细胞,经集落刺激因子(GM-CSF)刺激分化7 d形成巨噬细胞,将分化良好的巨噬细胞分别用不同浓度ox-LDL(0~120 μg/ml)培养48 h?应用Western blot方法检测细胞内SIRT1的蛋白表达变化,Real-time PCR检测SIRT1?HLA-DRα的mRNA水平?结果:SIRT1蛋白表达随ox-LDL浓度的升高而降低;ox-LDL处理后,SIRT1的mRNA水平与对照组比较显著降低(P < 0.05);SIRT1激动剂白藜芦醇能够逆转ox-LDL诱导的HLA-DRα启动子的活性下调?结论:ox-LDL通过调节巨噬细胞中SIRT1的蛋白表达和mRNA水平,使依赖MHC Ⅱ反式激活蛋白(class II trans-activator,CIITA)的HLA-DRα启动子活性下降,提示脱乙酰酶SIRT1可能是临床上干预动脉粥样硬化的潜在靶位点?     

RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞糖酵解相关基因表达的影响

目的:探讨常氧及缺氧培养对RNA干扰的缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及糖酵解相关基因表达的影响?方法:选择3组细胞分别为食管鳞癌Eca-109细胞稳定转染HIF-1α siRNA及空质粒的Eca-109细胞,予以常氧和缺氧培养,缺氧培养时间分别为6?12?24?48 h,采用Western blot检测HIF-1α蛋白表达,Western blot和RT-PCR检测3组细胞常氧和缺氧条件下糖酵解相关基因(Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ)的表达,分光光度法分别测定3组细胞常氧和缺氧培养下胞液中乳酸脱氢酶(LDH)?己糖激酶(HK)酶活性?结果:Eca-109细胞缺氧条件下培养,HIF-1α蛋白表达较常氧时增高,干扰细胞常氧下HIF-1α几乎无表达,缺氧后亦无增强?常氧和缺氧条件下,干扰细胞Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ mRNA和蛋白表达较未干扰细胞明显减弱(P < 0.05),干扰细胞胞液LDH?HK活性较未干扰细胞明显减少(P < 0.05)?结论:RNA干扰能抑制Eca-109细胞的HIF-1α基因表达,进而不同程度减少Glut-1?LDH-A?HK-Ⅱ糖酵解相关基因的表达?     

脓毒症患者血清NAMPT、SIRT1表达与急性肺损伤的相关性研究

目的：检测脓毒症患者血清烟酰胺磷酸核糖转移酶（NAMPT）、沉默信息调节因子1（SIRT1）水平，并探讨其与脓毒症患者急性肺损伤的关系。方法：选取2017年3月-2021年2月台州市立医院收治的脓毒症患者238例为研究对象，根据是否并发急性肺损伤，分为无急性肺损伤组120例和急性肺损伤组118例。收集患者临床资料，并在患者入院24 h内进行急性生理学与慢性健康状况评分系统Ⅱ（APACHE Ⅱ）评分；肺功能测定仪检测患者肺功能指标第1秒用力呼气容积占预计值百分比（FEV1%）、第1秒用力呼气容积占用力肺活量百分比（FEV1/FVC）、计算呼吸指数（RI）、氧合指数（OI），血气分析仪检测动脉血氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）水平；采用酶联免疫吸附法测定患者血清NAMPT、SIRT1水平；采用Pearson相关性分析血清NAMPT、SIRT1水平与APACHE Ⅱ评分、RI、OI、PaCO2、PaO2的相关性；采用二元Logistic回归分析脓毒症患者发生急性肺损伤的影响因素；采用受试者工作特征（ROC）曲线分析血清NAMPT、SIRT1对脓毒症患者发生急性肺损伤诊断价值。结果：与无急性肺损伤组比较，急性肺损伤组患者APACHE Ⅱ评分、PaCO2、RI、血清NAMPT水平显著升高，PaO2、OI、血清SIRT1水平显著降低（P＜0.05）；血清NAMPT水平与APACHE Ⅱ评分、RI、PaCO2水平均呈正相关（P<0.05），与OI、PaO2呈负相关（P<0.05）；血清SIRT1水平与APACHE Ⅱ评分、RI、PaCO2水平均呈负相关（P<0.05），与OI、PaO2呈正相关（P<0.05）；血清NAMPT、SIRT1、APACHE Ⅱ评分是脓毒症患者发生急性肺损伤的独立危险因素（P＜0.05）；血清NAMPT、SIRT1、二者联合检测对脓毒症患者发生急性肺损伤诊断的曲线下面积（AUC）分别为0.771（95%CI：0.710~0.831）、0.835（95%CI：0.779~0.890）、0.908（95%CI：0.869~0.947）。结论：脓毒症急性肺损伤患者血清NAMPT异常高表达、SIRT1异常低表达，二者联合检测可为脓毒症患者临床评估急性肺损伤提供一定参考。     

缺氧条件下体外培养血管内皮细胞AQP1表达的变化

目的研究缺氧对体外培养血管内皮细胞AQP1表达的影响。方法采用脐静脉内皮细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,细胞贴壁后分组:常氧对照组(5%CO2 95%空气),缺氧(1%O2 5%CO2 94%N2)3 h,6 h,12 h,24 h组,应用免疫细胞化学半定量检测AQP1蛋白水平的表达以及实时荧光定量-PCR法检测AQP1 mRNA的表达。结果AQP1蛋白和AQP1 mRNA的表达在缺氧后呈先升高后降低的趋势。结论缺氧在蛋白和转录水平对脐静脉内皮细胞AQP1的表达有调节作用。     

NAD对AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的 探讨烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的大鼠心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达的作用.方法 提取新生Wistar大乳鼠原代心肌成纤维细胞,传代培养,采用2～4代细胞.实验分为空白对照组,AngⅡ(0.01、0.1、1μmol/L)组,NAD(250 μmol/L)组,AngⅡ(1 μmol/L)+NAD (250 μmol/L)组,FAM组,Sirt1-siRNA+AngⅡ(1μmol/L)组,Sirt1-siRNA组,Sirt1-siRNA+NAD(250 μmol/L)组,Sirt1-siRNA十Ang Ⅱ(1 mol/L)+ NAD(250 μmol/L)组.刺激24h后,提取总RNA,Real time RT-PCR法分别检测SIRT1和Ⅰ型胶原mRNA的表达.结果 心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达随着AngⅡ浓度升高明显增加(P＜0.05),呈浓度依赖性.与空白对照组比较,NAD(250 μmol/L)组SIRT1 mRNA表达增高(P＜0.05).与AngⅡ(1μmol/L)组比较,AngⅡ(1μmol/L)+NAD(250μmol/L)组Ⅰ型胶原mRNA的表达明显减少(P＜0.01).相对于FAM组,Sirt1-siRNA转染后各组SIRT1 mRNA的表达减少(P＜0.05),而心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA表达增多(P＜0.05).结论 NAD可以抑制心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原mRNA的表达,SIRT1影响Ⅰ型胶原mRNA的表达,它们对Ang Ⅱ诱导的心肌纤维化有保护作用.     

缺氧条件下体外培养血管内皮细胞AQPl表达的变化

目的 研究缺氧对体外培养血管内皮细胞AQP1表达的影响.方法 采用脐静脉内皮细胞株,复苏传代后计数稀释,接种于6孔培养板中,细胞贴壁后分组:常氧对照组(5%CO2 95%空气),缺氧(1%O2 5%CO2 94%N2)3 h,6 h,12 h,24 h组,应用免疫细胞化学半定量检测AQP1蛋白水平的表达以及实时荧光定量-PCR法检测AQPl mRNA的表达.结果 AQPl蛋白和AQPl mRNA的表达在缺氧后呈先升高后降低的趋势.结论 缺氧在蛋白和转录水平对脐静脉内皮细胞AQP1的表达有调节作用.     

Rac1?HIF-1α在缺氧的人食管鳞癌Eca109细胞株中的表达及其对细胞增殖水平的影响

目的:探讨Rac1、HIF-1α mRNA和蛋白在缺氧的人食管鳞癌Eca109细胞株中的表达及其对细胞增殖水平的影响.方法:应用半定量RT-PCR、Western blot法检测缺氧条件下Eca109细胞株Rac1、HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平;应用半定量RT-PCR和MTT法检测常氧和缺氧下Rac1特异性抑制剂NSC23766处理后人食管鳞癌Eca109细胞株HIF-1α的mRNA表达水平和细胞增殖水平.结果:缺氧条件下,人食管鳞癌Eca109细胞株中Rac1、HIF-1α的mRNA和蛋白表达水平均明显增高,约24 h到达高峰.用NSC23766处理人食管鳞癌Eca109细胞株后,HIF-1α mRNA表达水平降低,细胞增殖明显受到抑制.结论:Rac1和HIF-1α在缺氧状态下被激活,且可能均与缺氧诱导的肿瘤增殖相关.     

缺氧诱导大鼠肝星状细胞激活及表达内脂素的实验研究

目的 通过观察常氧及缺氧状态下大鼠肝星状细胞(HSCs)表达α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和内脂素水平的变化,探讨缺氧对HSCs激活及表达内脂素的影响。方法 对原代大鼠HSCs进行缺氧(37 ℃、5% CO2+1% O2 + 94% N2)处理,检测不同缺氧时间(3、6、12及24 h)和常氧条件（5%CO2+21%O2+74%N2）下HSCs中HIF-1α、α-SMA和内脂素的mRNA表达水平及蛋白表达水平。基因表达用RT-PCR检测,蛋白表达用蛋白质印迹法(Western blot) 检测。结果 缺氧3 h即能诱导大鼠HSCs表达HIF-1α mRNA(P<0.05);HSCs缺氧6 h后α-SMA mRNA及蛋白表达水平的表达上调(P<0.05);HSCs缺氧12 h上调内脂素mRNA的表达(P<0.05),6 h上调内脂素蛋白表达(P<0.05);缺氧诱导α-SMA和内脂素表达呈正相关(基因r=0.991,蛋白r=0.968,P<0.05)。结论 缺氧可上调HSCs表达α-SMA和内脂素,且二者具有相关性,提示缺氧微环境可能通过内脂素介导HSCs的激活,促进肝纤维化的发生。     

缺氧诱导肺泡巨噬细胞HMGB1的释放及其可能机制

目的:研究缺氧对肺泡巨噬细胞高迁移率族蛋白B1(high mobility group box1,HMGB1)释放的作用及其信号通路?方法:采用大鼠肺泡巨噬细胞NR8383,观察不同时间缺氧培养对细胞HMGB1 mRNA表达和培养上清液中HMGB1含量的影响,及不同浓度JAK2抑制剂tyrphostin AG 490和STAT1抑制剂氟达拉滨对HMGB1释放的抑制作用?HMGB1含量采用酶联免疫吸附试验检测?结果:培养上清液中HMGB1含量和mRNA表达水平分别于缺氧培养6?12 h后明显升高(P < 0.01),并随缺氧培养时间延长而进一步升高和增强;tyrphostin AG 490和氟达拉滨对缺氧培养肺泡巨噬细胞释放HMGB1有不完全的抑制作用,并呈剂量依赖性?结论:缺氧诱导肺泡巨噬细胞释放HMGB1,JAK/STAT信号通路可能参与其释放过程?     

烟酰胺磷酸核糖转移酶信号通路在心血管疾病中的作用

【摘要】 有关烟酰胺磷酸核糖转移酶（Nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT）的研究是近年的热点之一。NAMPT在体内有两种存在形式，细胞内NAMPT和细胞外NAMPT。细胞内NAMPT主要作为一种合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）补救途径的限速酶，而细胞外NAMPT同时具有多种细胞因子的功能。大量研究表明，NAMPT控制了NAD的生物合成及下游分子NAD依赖的组蛋白去乙酰化酶沉默信息调节因子1（Sirtuin 1，SIRT1）的活性，在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤、衰老和代谢中均有重要作用。本文对NAMPT的基因结构、蛋白特征以及在心血管疾病中的作用进行了综述，重点阐述了NAMPT与心肌缺血、动脉粥样硬化、心力衰竭三方面的关系。     

高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NADH脱氢酶亚单位4、5表达的影响

目的 探讨高氧对胎鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AEC Ⅱ）还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脱氢酶亚单位4、5表达的影响.方法 原代培养Sprague-Dawley（SD）胎鼠AEC Ⅱ,待其生长至接近汇合状态时随机分为高氧组和正常对照组,高氧组持续暴露于常压高浓度氧中（氧浓度〉90%.CO2浓度5%）,正常对照组仍置于5%CO2培养箱中,两组均继续分别培养6、12、24h;采用免疫细胞化学染色SP法检测NADH脱氢酶亚单位4（DN4）蛋白的表达.采取半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定ND4、NADH脱氢酶亚单位5（ND5）mRNA的表达.结果 （1）SP法结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达增强,12h AEC Ⅱ ND4蛋白的表达减弱,但差异均无统计学意义（均P〉0.05）,24hAEC Ⅱ ND4蛋白的表达显著减弱（P〈0.05）;（2）RT-PCR检测结果显示,与正常对照组比较,高氧组6h AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA表达增强,差异均无统计学意义（均P〉0.05）.12、24h AECⅡ ND4、ND5 mRNA表达显著减弱（P〈0.05）.结论 持续高氧下调胎鼠AEC Ⅱ ND4、ND5 mRNA和AEC Ⅱ ND4蛋白的表达,这种改变可能参与高氧肺损伤的发病过程.     

胡黄连苷Ⅱ对大鼠肾小管上皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:研究胡黄连提取物对缺氧/复氧后肾小管上皮细胞氧化应激的保护作用和机制。方法:采用小鼠肾小管上皮细胞建立缺氧/复氧损伤模型,分别用不同梯度浓度胡黄连苷Ⅱ(1,10,100,1 000μg/ml)进行药物干预。MTT法检测细胞活性,BCA蛋白质分析试剂盒检测细胞培养液中丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性,免疫组化检测Bax蛋白的表达,Western Blot法检测高迁移率族蛋白(HMGB1)的表达,Realtime PCR检测Bax和Bcl-2mRNA表达。结果:与正常组相比,各缺氧/复氧组细胞内氧化应激水平增高,凋亡细胞或死亡细胞数量明显增加。与单纯缺氧/复氧组比较,不同浓度梯度的胡黄连苷Ⅱ可抑制细胞内的氧化损伤。胡黄连苷Ⅱ使肾小管上皮细胞增殖活性增强,细胞凋亡数量减少,培养液中MDA含量下降、SOD活性增强,Bax蛋白和HMGB1蛋白表达下调,Bax mRNA水平下调,Bcl-2mRNA水平上调。结论:缺氧/复氧导致肾小管上皮细胞内氧化应激增强,胡黄连苷Ⅱ能通过抑制肾小管细胞内氧化应激来改善缺氧/复氧后的细胞凋亡和坏死。     

SIRT1在NAD保护神经轴突作用中的表达变化

 目的探讨沉默信号调控因子（SIRT1)在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）保护神经轴突中的作用。方法应用长春新碱毁损法制备背根神经节轴突变性细胞模型,应用透射电镜、RT PCR、Western blot方法,观察正常背根神经节培养组、长春新碱毁损组、NAD保护组神经轴突的生长变化、超微结构变化和SIRT1 mRNA及SIRT1蛋白的表达变化。结果NAD保护组毁损8?h后轴突远端始发生轻微肿胀,断离。透射电镜结果显示,长春新碱毁损组轴突肿胀,大量髓样小体出现,微丝微管排列紊乱,聚集,溶解,被絮状沉淀物和膜性结构所代替。NAD保护组可见较多平行排列的微丝微管,轴突肿胀较轻。RT PCR结果显示,NAD保护组的SIRT1基因表达较毁损组上调。Western blot结果显示,损伤组可见其蛋白表达量明显降低,NAD保护组中SIRT1蛋白表达较毁损组上调。结论SIRT1参与NAD对轴突变性的保护作用。     

缺氧对大鼠血管平滑肌细胞表达巨噬细胞游走抑制因子的影响

目的 观察缺氧对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)表达巨噬细胞游走抑制因子(MIF)的影响,探讨缺氧在动脉粥样硬化等血管增生性疾病中引起动脉壁损伤的可能机制. 方法 将大鼠 VSMCs细胞株A7r5细胞分别在缺氧(37 ℃、5% CO2、1% O2)及常氧(37 ℃、5% CO2、20% O2)条件下培养不同的时间(2 h、4 h、12 h、24 h、48 h),在相应时间点收集细胞总RNA及培养上清液.用半定量RT-PCR及ELISA方法 分别检测MIF mRNA的表达及VSMCs MIF的蛋白水平变化. 结果 与常氧培养的对照组相比,缺氧不同时间的大鼠VSMCs的MIF mRNA表达均显著增加(P<0.05),并且合成MIF蛋白的水平也明显增加(P<0.05).结论 缺氧能诱导VSMCs MIF的表达,MIF的表达增加可能是缺氧参与动脉粥样硬化等血管增生性疾病发生的机制之一.     

低氧诱导人乳腺癌细胞VEGF的表达及机制

目的:研究低氧对体外培养乳腺癌细胞株MD-MBA-435S血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor VEGF)表达的影响.方法:建立MD-MBA-435S细胞体外低氧培养模型.在缺氧处理后(4h、8h、12h、16h和20h),RT-PCR和Western blot分别检测VEGF基因和HIF-1α蛋白、VEGF蛋白的表达变化,台盘兰排斥法检测20h以内细胞的存活率.结果:缺氧20h以内对细胞生存率影响较小;缺氧4h后,VEGFmRNA的两个亚型VEGF121及VEGF165的表达相对常氧条件下有显著增加,且随着缺氧时间的增加呈时间效应关系.免疫细胞化学及Western blot证实VEGF蛋白的表达与VEGFmRNA的表达同步;HIF-1α蛋白在常氧条件下很少表达,缺氧4h即有显著表达,且表达量随缺氧时间而升高,Pearson级差相关分析显示HIF-1α蛋白水平和VEGF165mRNA及蛋白表达显著正相关.结论:缺氧可以显著增加乳腺癌细胞VEGF的表达,且HIF-1α蛋白在其中发挥重要作用,这可能是乳腺癌恶性增殖和转化的一个重要机制.     

缺氧/复氧通过激活程序性坏死RIP1/RIP3信号诱导心肌细胞坏死

目的:研究缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)刺激是否可通过激活程序性坏死信号通路诱导心肌细胞坏死?方法:体外培养新生大鼠原代心肌细胞,采用缺氧2 h复氧4 h的方法复制心肌细胞损伤模型,碘化丙腚(propidium iodide,PI)染色检测心肌细胞坏死情况,Western blot和免疫共沉淀方法检测程序性坏死信号通路中受体相互作用蛋白1 (receptor interacting protein-1,RIP1)?受体相互作用蛋白3(receptor interacting protein-3,RIP3)的蛋白表达水平和RIP1/RIP3复合物Ⅱ形成情况,以及RIP1?RIP3的泛素化水平?结果:与对照组相比,缺氧/复氧组心肌细胞坏死数量明显增多,RIP1?RIP3蛋白表达水平显著升高,RIP1/RIP3复合物Ⅱ的形成增多,且RIP1与RIP3的泛素化水平也有所增加?结论:缺氧复氧可诱导心肌细胞坏死,其机制可能与激活程序性坏死RIP1/RIP3信号通路有关?     

HIF-1α对间充质干细胞SDF-1/CXCR4的调控作用研究

[目的]探讨缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）对间充质干细胞基质细胞衍生因子-1（stromal cell-derived factor-1,SDF-1）/CXC趋化因子受体4（chemokine receptor 4,CXCR4）的调控作用。[方法]贴壁法培养ICR小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）;采用RNA干扰技术用SuperFectinTMⅡ转染HIF-1αsiRNA于MSCs;实验分为五组：常氧组、缺氧组、转染Control siRNA组、转染HIF-1αsiRNA常氧培养组、转染HIF-1αsiRNA缺氧培养组;RT-PCR检测HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA表达水平;Western blotting检测HIF-1α、SDF-1α、CXCR4蛋白表达水平。[结果]同常氧组比较,缺氧组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平提高（P〈0.05）;同转染Control siRNA组比较,转染HIF-1αsiRNA常氧培养组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平降低（P〈0.05）;同缺氧组比较,转染HIF-1αsiRNA缺氧培养组HIF-1α、SDF-1α、CXCR4 mRNA及蛋白表达水平降低（P〈0.05）。[结论]缺氧可使MSCs的HIF-1α、SDF-1α、CXCR4的表达提高,常氧与缺氧条件下抑制HIF-1α的表达可使SDF-1α、CXCR4的表达降低,HIF-1α在间充质干细胞中对SDF-1/CXCR4有调控作用。     

缺氧复氧诱导大鼠心肌细胞内质网应激反应

目的:观察大鼠心肌细胞缺氧复氧时内质网应激蛋白表达的改变及其意义,以探讨心肌缺血再灌注损伤与内质网应激的关系.方法:原代培养乳鼠心肌细胞,缺氧5.5 h后复氧2～24 h制备缺氧复氧损伤模型,用Western blot和RT-PCR方法测定内质网应激蛋白GRP78表达水平.2-脱氧葡萄糖作为本实验的阳性对照,2-脱氧葡萄糖孵育心肌细胞10 h,用Western blot和RT-PCR检测GRP78表达水平.结果:缺氧复氧处理的心肌细胞活力减低,胞内乳酸脱氢酶漏出.与对照组比较,缺氧复氧组心肌细胞内质网应激蛋白GRP78在蛋白及mRNA水平表达均于复氧后2 h开始增加,4 h达峰值,蛋白水平为对照组的142%,mRNA水平为对照组的200%,表达的增加可持续到复氧24 h.结论:缺氧复氧可以诱导心肌细胞内质网应激.     

NAMPT基因对肾癌细胞增殖和凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT) 在肾癌中的表达情况及对肾癌细胞增殖和凋亡的影响。方法:通过TCGA在线数据库ualcan分析NAMPT在肾癌组织和正常肾组织中的表达,通过Kaplan-Meier plotter数据库分析NAMPT对肾癌预后的影响。qPCR检测NAMPT基因在肾癌细胞769P、A704、786-O及正常化肾小管上皮细胞HK2中的表达。分别设计NAMPT特异性shRNA（shNAMPT组）和对照序列（scramble组）转染肾癌细胞786-O,用NAMPT抑制剂FK866及对照试剂DMSO处理肾癌细胞786-O,分别采用CCK-8法、平板克隆实验及流式细胞术检测NAMPT对肾癌细胞786-O增殖、克隆形成及凋亡的影响,NAD+/NADH检测试剂盒检测细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的含量,Western印迹检测NAMPT的表达及干扰NAMPT对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）通路的影响。结果:生物信息学分析显示NAMPT在肾癌中的表达高于正常肾组织（P＜0.05）,NAMPT高表达组总生存率较低表达组明显降低（P<0.01）;肾癌细胞769P、A704、786-ONAMPT的表达均高于肾小管上皮细胞HK2（t=6.680,P=0.0026,t=14.12,P=0.001,t=13.43,P=0.002）;细胞学实验结果显示,与DMSO组相比,FK866组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱（t=2.625,P<0.05）,克隆形成能力明显受抑制（t=5.687,P<0.01）,凋亡细胞比例增高（t=6.325,P＜0.01）,NAD+生成明显下降（t=17.62,P<0.001）。与scramble组相比,shNAMPT组肾癌细胞786-O的增殖能力减弱（t=3.959,P<0.05）,克隆形成能力明显受抑制（t=8.684,P<0.05）,凋亡细胞比例增高（t=14.05,P＜0.01）,NAD+生成明显下降（t=10.93,P<0.001）,Akt通路关键蛋白p-PI3K及p-Akt的表达明显下调（t=7.721,P＜0.01,t=14.78,P＜0.001）。结论:NAMPT在肾癌中高表达,且与患者预后差相关,干扰NAMPT的表达,可以通过减少NAD+的生成,抑制PI3K/Akt通路的激活,从而降低肾癌细胞的增殖,促进其凋亡。     

Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶对骨肉瘤MG-63细胞凋亡的抑制作用及其机制

目的：研究骨肉瘤MG-63细胞中Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶（TG2）的抗凋亡作用,探讨其抑制肿瘤细胞凋亡的机制。方法：设计针对TG2的siRNA,建立骨肉瘤MG-63细胞体外缺氧培养模型,分为常氧组（细胞在常氧下培养）、单纯缺氧组（细胞在缺氧培养箱里培养）、对照siRNA缺氧组（转染对照siRNA后在缺氧培养箱里培养）和TG2 siRNA缺氧组（转染TG2 siRNA后在缺氧培养箱里培养）。观察各组骨肉瘤MG-63细胞在缺氧培养不同时间(6、12、24、48和72 h) 后Bax和Cyt C的表达及细胞凋亡率。微量滴定法检测TG2活性,RT-PCR法检测TG2和Bax mRNA表达水平,免疫组织化学法检测TG2和Bax蛋白在细胞内的分布,Western blotting法检测TG2、Bax和Cyt C蛋白表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：与常氧组比较,单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组细胞TG2活性、TG2 mRNA和蛋白表达水平明显增强(P<0.01),并随缺氧时间延长逐渐升高（P<0.01）;Bax mRNA表达水平变化不明显(P>0.05),但Bax蛋白表达水平明显下降(P<0.01),细胞胞浆和线粒体内Cyt C蛋白水平及细胞凋亡率无明显变化（P>0.05）。与单纯缺氧组和对照siRNA缺氧组比较,TG2 siRNA缺氧组细胞各时间点TG2 mRNA和蛋白表达水平明显降低(P<0.01),Bax mRNA表达水平无明显变化（P>0.05）,Bax蛋白表达明显增加(P<0.01),胞浆内Cyt C蛋白水平明显增加(P<0.01),线粒体内Cyt C蛋白水平明显降低（P<0.01）,细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论： TG2通过与Bax形成混合物而消耗Bax,阻止Cyt C释放至胞浆,从而抑制肿瘤细胞凋亡。