基于SSR标记与化学成分构建十堰地区天师栗核心种质库＊

目的 利用筛选出十堰的天师栗中高多态性SSR位点评价天师栗种质资源的遗传多样性，结合有效药用成分含量，构建十堰地区天师栗核心种质库。方法 收集十堰地区114份天师栗种质资源，以七叶树基因组为参考，采用荧光毛细管电泳筛选出高多态性SSR位点，对天师栗种质资源进行遗传多样性分析。利用HPLC测定不同种质干燥娑罗子中七叶皂苷的含量。采用最小距离逐步聚类取样策略（LDSS），根据遗传多样性保留程度初步筛选出核心种质，并对该核心种质与原始种质的遗传多样性参数进行T检验，选择与原种质差异不显著的核心种质为最佳核心种质。结果 筛选出13对高多态性SSR分子标记，遗传多样性评价结果表明十堰地区天师栗种质资源遗传多样性较高，遗传分化较小，存在着较大的基因流，114份种质资源未分为不同的亚群，周家坝和辽叶居群间具有较近的遗传亲缘关系，且周家坝居群娑罗子中的七叶皂苷A及七叶皂苷B含量普遍较高。最终筛选出的核心种质共23份，占总种质资源的20.17%，其中周家坝12份样本、辽叶6份样本、普龄5份样本。结论 将SSR分子标记与主要有效药用成分结合，采用LDSS取样策略构建十堰地区天师栗种质资源核心种质库的方法具有可行性，能够有效的保存与管理天师栗种质资源，也为当地天师栗品种改良、新品种选育研究等提供了研究基础。     

16个产地地乌药材的系统鉴定及质量评价

目的:构建地乌药材基原物种系统鉴定体系,并对全国16个产地的地乌药材进行综合品质评价,为地乌药材产地选择及临床用药安全奠定基础。方法:使用传统鉴别方法结合DNA条形码核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列分子鉴定技术快速鉴别地乌药材真伪,并基于HPLC-UV对地乌药材中5个有效成分进行含量测定,采用Welch Ultimate XB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相乙腈-0.01%三氟乙酸溶液(30∶70),检测波长210 nm,柱温30℃,流速1.0 mL·min-1。结果:传统鉴别及DNA条形码快速鉴别技术均能准确鉴别地乌药材真伪。BLAST比对分析发现,16个产地地乌药材均与林荫银莲花Anemone flaccida具有最大相似度;基于多指标成分含量测定表明湖北恩施板桥镇的地乌药材中5个三萜皂苷类成分含量之和最高(10.59%),其次为贵州毕节赫章(6.28%)和湖北长阳都镇湾(5.64%)。结论:DNA条形码技术可作为地乌药材传统鉴定技术的有效补充,该鉴别体系可保障地乌药材基原准确及临床用药安全。HPLC多指标成分综合评价及聚类分析结果表明在本研究所涉及的产地中,湖北恩施、长阳、五峰,贵州毕节和重庆金佛山的地乌药材质量较优,可作为地乌药材的重要产地。     

微小RNA-489调控脑源性神经营养因子在甲状腺乳头状癌中的作用机制研究

目的　分析微小RNA（microRNA，miR）-489在甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）发生发展过程的影响，并探讨其在甲状腺乳头状癌临床诊断的价值。方法　采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测甲状腺乳头状癌组织中脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及miR-489的表达变化；TargetScan和双荧光素酶报告基因实验预测并验证miR-489可靶调控BDNF；CCK-8、Transwell迁移侵袭实验等探究miR-489和BDNF对甲状腺乳头状癌细胞TPC-1的影响；构建裸鼠植瘤模型探究miR-489在体内实验中对甲状腺乳头状癌的影响。结果　miR-489在甲状腺乳头状癌组织及转移的肿瘤组织中的表达降低（P＜0.01）；BDNF是miR-489的靶基因；过表达BDNF能逆转miR-489对TPC-1细胞增殖、迁移、侵袭的抑制作用（P＜0.05)；miR-489可抑制裸鼠肿瘤的生长（P＜0.01）。结论　miR-489通过抑制靶基因BDNF的表达在甲状腺乳头状癌中扮演抑癌基因的角色。     

全冠牙预备体表面涂布极固宁TM后对其固位力的影响

目的探讨涂布极固宁TM后对全冠固位力的影响。方法制作面聚合度(TOC)为10°和20°的全冠牙预备体各10个,随机分为实验组和对照组。每组TOC10°和20°的全冠牙预备体各5个。制作铸造全冠20个。实验组涂布极固宁TM后玻璃离子黏固剂黏固全冠,对照组直接玻璃离子黏固剂黏固全冠。材料实验机上测两组全冠拉脱时的最大拉力值。扫描电镜观察表面并能谱仪分析。结果TOC为10°的实验组全冠和对照组全冠拉脱时的最大拉力值分别为(443.59±74.20)N和(509.07±69.05)N,两组间的差异无统计学意义(P=0.056);TOC为20°时实验组和对照组全冠拉脱时最大拉力值分别为(291.57±49.27)N和(390.82±91.44)N,两组间的差异有统计学意义(P=0.009)。结论TOC为10°的牙预备体表面经极固宁TM处理后对玻璃离子黏固剂黏固的全冠的固位力没有影响;而TOC为20°时牙预备体表面经极固宁TM处理后的固位力显著下降。     

脱敏剂对牙本质粘接剂剪切粘接强度的影响

目的 研究脱敏剂对牙本质粘接剂剪切粘接强度的影响,以期为临床操作提供参考.方法 将20个牙试件均分为实验组和对照组,每组10个;实验组牙本质表面涂布脱敏剂(极固宁TM);对照组不做任何处理.用牙本质粘接剂(Variolink Ⅱ)将铸瓷(IPS Empress)粘接于两组试件牙本质粘接面上,测试剪切粘接强度,扫描电镜(SEM)观察试件断面.结果 实验组和对照组的剪切粘接强度分别为(5.53±0.96)MPa和(7.32±1.34)MPa,差异有统计学意义(P=0.003).SEM见实验组试件发生黏附破坏,对照组试件发生内聚破坏.结论 牙本质表面涂布脱敏剂后可显著降低粘接剂的剪切粘接强度.     

时间分辨免疫荧光定量检测乙型肝炎病毒前S1抗原的研究

目的 建立时间分辨免疫荧光定量分析乙型肝炎病毒PreS1抗原的方法.方法 以基因重组的带有PreS1抗原的乙型肝炎表面抗原作标准品,应用双抗体夹心免疫荧光分析方法,用抗PreS1单克隆抗体和抗-HBs分别作为固相抗体和铕标记抗体,若样本中含有PreS1抗原,则形成抗体-抗原-铕标记抗体复合物,加增强液解离铕离子,采用时间分辨荧光测量技术,对乙型肝炎病毒PreS1抗原进行检测.结果 自制TRFIA试剂检测PreS1抗原,单侧95%参考范围为0～0.26 ng/ml;自制TRFIA试剂与ELISA试剂对乙型肝炎患者血清标本中PreS1抗原的检测,TRFIA方法灵敏度高于ELISA方法,250份乙型肝炎患者血清标本中有3例标本ELISA方法结果为阴性,而用TRFIA方法可检测到PreS1抗原;对于弱阳性标本用ELISA方法检测不到时,TRFIA方法仍可检出.ELISA方法在一阳性标本1：4 096倍稀释时结果为阴性,而TRFIA方法在1：16 384倍稀释时仍为阳性;高、中、低三个浓度,批内和批间精密度测试变异系数（CV,%）均小于10%,平均回收率为103.3%;TRFIA方法检测PreS1抗原与HBsAg及HBeAg无交叉反应;50份我院正常体检者血清标本进行PreS1抗原的检测,结果均正常,特异性100%.结论 TRFIA方法定量检测PreS1抗原,灵敏度高,特异性强,能够准确及时敏感地反映患者体内乙型肝炎病毒的复制情况.     

广州市致倦库蚊幼虫对常用杀虫剂的抗药性研究

目的了解广州市致倦库蚊对常用杀虫剂的抗药性水平,为控制蚊虫合理用药提供依据。方法选择4种常用杀虫剂,采用幼虫浸渍法对广州市3个中心城区(越秀、荔湾、天河)致倦库蚊幼虫进行抗药性测定。结果广州市越秀、荔湾、天河区致倦库蚊除对高效氯氰菊酯敏感外(R/S<2),对倍硫磷、氯菊酯、溴氰菊酯均产生了不同程度的抗性。3个城区的致倦库蚊对倍硫磷的抗性系数分别为2.77、1.84、1.16;对氯菊酯的抗性系数分别为8.25、10.80、8.35;对溴氰菊酯的抗性系数分别为45.87、12.29、4.65。结论在广州市蚊虫防治中,应落实媒介综合治理策略,以防抗药性的产生。     

冬凌草IrCYP71基因的克隆和功能

目的:克隆冬凌草二萜类化合物生物合成途径下游关键酶基因Ir CYP71,进行序列特征分析,对此基因编码的蛋白进行原核表达分析以及亚细胞定位,并对蛋白在宿主细胞表达的条件进行了优化。方法:根据转录组测序所得的Ir CYP71基因片段,克隆出全长c DNA序列;构建p ET28a(+)-Ir CYP71重组质粒,转化到Rosetta感受态细胞,小量表达和大量表达蛋白并鉴定,进行包涵体蛋白的纯化与复性,再对复性蛋白纯化鉴定分析。基于gateway克隆技术构建出PCR8/GW/TOPO-Ir CYP71载体之后与改造Pearleygate104载体重组,之后与农杆菌GV3101重组,转入烟草中瞬时表达,从而进行蛋白亚细胞定位。结果:克隆得到的Ir CYP71基因全长c DNA为1 593 bp,编码530个氨基酸,并在Gen Bank注册(登录号MG800628)。经大肠埃希菌表达系统表达的重组蛋白相对分子质量正确,在62 k Da左右,纯化后的重组蛋白总量有1 mg,蛋白纯度为85%。此蛋白亚细胞定位在细胞核。结论:对冬凌草Ir CYP71基因进行了初步验证,并对基因表达的蛋白进行原核表达和亚细胞定位,使该基因在冬凌草二萜成分的生物合成过程中的作用得到了进一步的阐述。     

黄连NRAMP3基因的克隆与生物信息学分析＊

目的 克隆黄连（Coptis chinensis Franch.）中自然抗性相关巨噬细胞蛋白（Natural Resistance-Associated Macrophage Protein，NRAMP）的编码基因，并进行生物信息学分析。方法 从黄连基因组中比对NRAMP3基因，并根据比对的基因序列设计特异性引物，经PCR扩增得到的黄连NRAMP3编码序列，进行克隆、测序和生物信息学分析，并利用qPCR技术对黄连NRAMP3基因进行时空表达分析。结果 得到黄连NRAMP3基因cDNA序列，全长1617 bp，编码538个氨基酸，通过与GenBank上的其他蛋白序列比对，将其命名为CcNRAMP3；序列分析显示，黄连NRAMP3基因编码的氨基酸序列包含一个典型的NRAMP结构域（PF01566），有12个跨膜结构域，亚细胞定位于液泡膜上，具有疏水性强的特点。二级结构中肽链构象主要包括α-螺旋与无规则卷曲两部分；三级结构模型具有葡萄球菌锰转运突变体（MntH）的晶体结构。利用系统进化关系分析推测它可能具有转运重金属元素Cd功能。对黄连NRAMP3基因的组织表达分析表明，CcNRAMP3基因在黄连叶片中表达量最高。在遭受镉胁迫时，在须根中表达量先升高后降低，该基因很可能主要在根部对镉进行响应并发挥作用。结论 本研究首次通过克隆得到黄连NRAMP3基因，并运用生物信息学方法对其理化性质、结构特征等进行了分析预测，这些结果将为黄连NRAMP3基因的功能研究以及其对镉转运的调控机制提供理论依据和基因资源。     

类风湿因子分型检测的临床应用

目的探讨类风湿因子（RF）分型定量检测对类风湿性关节炎（RA）诊断、治疗及预后的意义。方法采用ELISA方法定量检测RA患者组和其他风湿病组患者血清中IgG-RF、IgM-RF、IgA-RF含量，同时用散射比浊法检测RA患者组患者血清中RF含量。结果散射比浊法检测RF阳性率为58．56％，ELISA分型方法检测RF阳性率为81．77％，ELISA方法分型检测RF阳性率高于散射比浊法（P〈0．01）。RA患者组与其他风湿病患者组血清中各型RF含量两两比较，RA患者组RF IgM、IgA及IgG均显著高于其他风湿病组（P〈0．05）。结论ELISA方法分型定量检测RF阳性率高，特异性强，对RA患者的诊断、活动度及疗效观察有较大临床意义。