缺氧PC_(12)细胞中细胞因子和酪氨酸蛋白激酶活性的变化

目的 研究缺氧对PC12细胞中IL-1β、4、8、13(白介素-1β、4、8、13)和酪氨酸蛋白激酶(TPK)活性的影响.方法 采用放射免疫技术和ELISA法检测缺氧后PC12细胞的IL-1β、4、8、13和TPK活性.结果 缺氧后PC12细胞胞浆、胞核的TPK以及IL-1β、4、8、13活性在缺氧中毒2h升高,6h最高,12h活性降低,各时相点均明显高于正常对照组.结论 提示在缺氧所致的脑损伤发病机制中酪氨酸蛋白激酶、细胞因子及其相关的细胞内信号传递方面起了重要的作用.     

缺氧复合梭曼中毒对PC12细胞凋亡及IL-1β、IL-6水平的影响

目的观察缺氧复合梭曼中毒对PC12细胞的毒性效应及IL-1β、IL-6的变化规律.方法制备缺氧复合梭曼中毒细胞模型,以MTT比色、流式细胞仪、ELISA和放免法分别测定细胞存活率、凋亡率及培养液IL-1β和IL-6活性.结果梭曼中毒和缺氧致伤组细胞存活率明显下降,细胞凋亡率明显升高,复合致伤组细胞存活率和凋亡率变化更为明显,且与梭曼中毒组相比具有显著性差异(P＜0.05);梭曼中毒和缺氧致伤后IL-1β、IL-6活性均明显增加,梭曼中毒组在致伤后12 h达到高峰,缺氧致伤组在伤后6 h即达到高峰,而后逐渐下降,至伤后24h仍显著高于对照组;复合致伤组IL-1β和IL-6活性升高更为明显,在致伤后6 h达到高峰,显著高于正常对照组(P＜0.01)和同时相点梭曼中毒组(P＜0.05),较同时相点梭曼中毒组IL-1β和IL-6活性增加1.25和2.16倍.结论缺氧复合梭曼中毒导致PC12细胞凋亡增加,复合致伤所致的IL-1β和IL-6水平的升高在缺氧复合梭曼中毒的毒性效应中具有重要作用.     

缺氧复合梭曼中毒PC12细胞中［Ca2+］、cAMP、CaM和Ca2+/CaM-PK Ⅱ的变化

目的 观察缺氧复合梭曼中毒的大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞内游离钙的浓度［Ca∧2 ］、cAMP、钙调蛋白（CaM）和钙调蛋白Ⅱ（Ca∧2 /CaM-PK Ⅱ）的变化。方法 采用放免技术,从细胞水平进一步观察缺氧复合梭曼中毒对PC12细胞的毒性、细胞内［Ca∧2 ］变化、cAMP、CaM和Ca∧2 /CaM-PK Ⅱ的变化。结果 缺氧中毒组PC12细胞cAMP、CaM含量在中毒后24h明显高于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组;缺氧中毒组PC12细胞Ca∧2 /CaM-PK Ⅱ活性在中毒后24h明显低于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组。结论 ［Ca∧2 ］、cAMP、CaM和Ca∧2 /CaM-PK Ⅱ在缺氧复合梭曼中毒PC12细胞损伤机制中起了重要的作用。     

谷氨酸在模拟高原梭曼中毒性脑损伤的作用研究

目的 探讨谷氨酸（Chutamic acid.Glu)在缺氧复合梭曼中毒脑损伤的作用机制。方法 采用氨基酸分析和放免技术，研究高原缺氧，梭曼中毒单一与复合致伤后12、24、48h脑组织Glu和CaM含量的变化以及钙／钙调蛋白激酶Ⅱ（Ca^2 /CaM-PKⅡ）活性的影响及其机制。结果 缺氧复合梭曼中毒组脑组织Glu,CaM含量在中毒后24h明显高于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组；缺氧中毒组脑组织Ca^2 /CaM-PKⅡ活性在中毒后24h明显低于单纯中毒组、缺氧对照组和正常对照组；而N－甲基－D－天冬氨酸（NMDA）受体损坏抗剂地佐环平（MK－801）和钙通道拮抗剂尼莫地平（Nimodipine)可对抗这种改变。结论 高原缺氧复合梭曼中毒后Glu的兴奋毒引起脑损伤和Ca^2 /CaM-PKⅡ的活性下降，主要由NMDA受体介导和胞外Ca^2 内流增加有关。     

缺氧复合梭曼中毒大鼠脑损伤的药物保护研究

目的　研究抗胆碱能药物解磷复方和红景天对低压缺氧复合梭曼中毒大鼠脑损伤的作用效果。方法　 72只Wistar大鼠分为缺氧对照、缺氧复合梭曼中毒、解磷复方治疗和解磷复方与红景天复方治疗等共 4组。动物梭曼 ( 72 μg kg ,sc)中毒后置低压舱内 ( 62kPa)缺氧 48h ,于 12、2 4、48h等时间点处死动物取脑组织。用生化法测脑组织伊文思蓝(evansblue ,EB)含量和磷脂酶A2 (phospholipase ,PLA2 )活性 ,放射免疫法测钙调蛋白 (Calmodulin ,CaM)含量。结果　缺氧复合梭曼中毒明显升高大鼠脑组织EB含量、PLA2 活性和CaM含量。抗胆碱能药物解磷复方能明显降低缺氧复合梭曼中毒引起的大鼠脑组织EB含量、PLA2 活性和CaM含量变化 ,解磷复方和红景天组成的抗毒复方进一步加强上述作用。结论　解磷复方和解磷复方加红景天复方均可对抗缺氧复合梭曼中毒引起的脑损伤 ,后者作用比前者强     

M乙酰胆碱受体在缺氧复合梭曼中毒大鼠脑损伤中的作用研究

目的探讨毒蕈碱样乙酰胆碱受体(M受体)在缺氧复合梭曼中毒脑损伤中的作用。方法实验大鼠随机分为正常对照组、梭曼中毒组、缺氧组和缺氧复合梭曼中毒组。利用受体放射性配基结合法、Western blot、放射免疫和酶放射化学分析分别检测皮层、海马和纹状体M受体密度和亲和力、Gia蛋白含量、cAMP浓度及PKA活性。结果与平原中毒组相比,缺氧复合梭曼中毒组皮层和纹状体Bmax增加,海马和纹状体Kd值降低;复合致伤组皮层、海马和纹状体Gia蛋白含量分别比单纯梭曼中毒组降低了15．48％、8．56％和28．20％;各脑区cAMP浓度及PKA活性显著升高,分别较梭曼中毒组升高了79．51％、84．75％、52．92％和78．93％、44．32％、39．05％;M受体阻断剂阿托品可部分阻断梭曼中毒和／或缺氧所致的PKA活性的升高。结论复合致伤引起的M受体上调,cAMP-PKA信号系统的异常增强,在缺氧复合梭曼中毒脑损伤中可能是缺氧复合梭曼中毒毒性效应增强的重要原因之一。     

梭曼中毒诱导PC12细胞STATs表达

目的 研究梭曼中毒PC12细胞中STATs基因mRNA和蛋白表达的变化。方法 采用半定量RT-PCR技术和Western blot法检测梭曼中毒2、6、12及24h的PC12细胞的STAT1、3、5基因mRNA和蛋白质的表达水平，并对PCR产物进行测序。结果 梭曼中毒后2h组PC12细胞中STAT1、3、5mRNA和蛋白质表达水平升高，在中毒后12h组达最高，中毒后24h组的表达量低于12h组，与对照组比较均有明显差别。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片断与GenBank中相应序列相同。结论 梭曼中毒增强PC12细胞中STATs基因的表达，在梭曼中毒所致的脑损伤中可能发挥重要作用。     

梭曼中毒诱导PC12细胞JAKs表达

目的 研究梭曼中毒PC12细胞中JAK1、JAK2、JAK3基因mRNA和蛋白表达的变化。方法 采用半定量RT-PCR和Western blotting法检测梭曼中毒2、6、12、24h的PC12细胞的JAK1、JAK2、JAE3基因mRNA和蛋白质的表达水平，并对PCR产物进行测序。结果 梭曼中毒后2h组PC12细胞中JAK1、JAK2、JAK3 mRNA和蛋白质表达水平升高，在中毒后12h组达最高，中毒后24h组的表达量低于12h组，与对照组比较均有明显差别。RT-PCR产物直接测序证实扩增产物片断与GenBank中相应序列相同。结论 梭曼中毒增强PC12细胞中JAKs基因的表达，在梭曼中毒所致的脑损伤中可能发挥重要作用。     

缺氧条件下大鼠单核细胞NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表达变化规律的研究

目的研究缺氧培养的大鼠外周血单核细胞核转录因子κB(NF-κB)结合活性及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)表达的变化规律,探讨缺氧与全身炎症反应综合征的关系,为进一步研究老年多器官功能障碍综合征的肺启动机制奠定基础.方法采用明胶法分离大鼠外周血单核细胞,于低氧条件下(3%O2, 5%CO2, 92%N2)培养0、1、3、6、9、12、24 h后,收集细胞及培养液上清,分别采用电泳迁移分析法(EMSA)、逆转录PCR(RT-PCR)和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测其NF-κB活性及TNF-α、IL-1β表达量.结果缺氧1～12 h,NF-κB结合活性及TNF-α、IL-1β表达量均显著高于正常(P<0.01),其峰值见于缺氧6 h.缺氧24 h,上述指标与正常无显著差异(P＞0.05).NF-κB结合活性与TNF-α、IL-1β mRNA和蛋白表达水平显著相关(P<0.01,P<0.05).结论缺氧可显著增强大鼠外周血单核细胞的NF-κB结合活性,并可诱导其产生大量的促炎症因子TNF-α、IL-1β,这些变化可能与急性呼吸窘迫综合征时血浆中大量促炎症因子持续存在密切相关.     

IL-1β对HepG2细胞核受体RXRα蛋白表达的影响

目的研究白细胞介素1β（interleukin 1 beta,IL-1β）诱导人肝癌细胞HepG2维甲酸X受体α（retinoid Xreceptor alpha,RXRα）蛋白核-胞浆转移现象及其基因水平变化。方法 IL-1β处理HepG2细胞,收集不同时间点RXRα总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白及mRNA;同时用蛋白酶体抑制剂,MG132预处理HepG2细胞后IL-1β诱导细胞,收集细胞蛋白及mRNA,应用Western blot及实时荧光定量聚合酶链反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,real-time PCR）检测RXRα总蛋白、胞浆蛋白、核蛋白及mRNA水平的变化。结果总胞核RXRα蛋白表达量降低（P〈0.05）,胞浆RXRα蛋白表达量增高（P〈0.05）,RXRαmRNA水平在6、12 h升高（P〈0.05）。MG132可以抑制IL-1β对细胞核、胞浆RXRα蛋白表达水平的变化。结论 IL-1β可以诱导HepG2细胞RXRα核-胞浆转移,RXRα核-胞浆转移可能与泛素-蛋白酶体降解途径相关。     

低氧促进肌成纤维细胞表达和分泌结缔组织生长因子及纤维连接蛋白

目的:观察低氧对肾肌成纤维细胞合成和分泌结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和细胞外基质纤维连接蛋白(fibronectin,FN)的影响,以了解肌成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用.方法:(1)采用原代培养正常大鼠肾皮质肌成纤维细胞,以密闭的细胞培养罐造成低氧环境(1%O2 ,体积分数),应用Western blot方法检测低氧和正常氧(21%O2 ,体积分数)条件下低氧诱导因子-1α( hypoxia induced factor-1α,HIF-1α)蛋白的表达,验证所营造的低氧条件是可靠的.(2)用Western blot方法检测在低氧和正常氧条件下,各时间点上细胞及上清液中CTGF和FN蛋白水平.(3) 用RT-PCR方法检测低氧和正常氧条件下,各时间点FN mRNA表达的变化.(4)用明胶酶谱法检测细胞上清液中基质金属蛋白酶-2(matrix metalloprotei- nase-2,MMP-2)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP -9)的活性.结果:正常氧组HIF-1α蛋白表达微弱,低氧组有较高水平HIF-1α蛋白表达.低氧作用于原代培养的肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后细胞内的CTGF蛋白均比正常氧组增高,分别为175%±52%,347%±67%和143%±27%,以12 h最明显(P＜0.05);低氧刺激24 h时上清液中CTGF蛋白显著增加,是正常氧组的348%±99%(P＜0.05);低氧刺激肌成纤维细胞6 h,12 h和24 h后上清液中FN蛋白水平增加,分别是正常氧组的187%±42%,199%±51%和210%±29%,以24 h 最明显(P＜0.05),而对应时间点上清液中MMP-9和MMP-2活性无明显变化,但细胞内FN蛋白减少,低氧剌激6 h为正常氧组的64%±13%.低氧刺激肌成纤维细胞3 h,FN的mRNA水平开始上升,6 h达到正常氧组的135%±13%(P＜0.05),12 h 下降接近正常氧水平.结论 :低氧可通过促进肌成纤维细胞表达CTGF和FN参与肾间质纤维化的进展.     

沙眼衣原体感染诱导Hela细胞分泌IL-8和IL-10

目的 :探讨沙眼衣原体 (CT)感染对上皮细胞系Hela细胞产生IL 8和IL 10能力的影响。方法 :采用细胞培养法和ELISA法 ,对感染CT的Hela细胞上清进行IL 8和IL 10检测。结果 :CT感染的Hela细胞IL 8和IL 10分泌量随感染剂量增加而增高 ;感染 2 4h后 ,IL 8和IL 10开始显著增加 ,72h达高峰 ,以后开始下降 ,虽然热灭活CT(HI CT)也能诱导IL 8和IL 10表达 ,但诱导水平显著低于感染组。结论 :CT感染能诱导Hela细胞大量分泌IL 8和IL 10 ,并且呈时间和剂量依赖性 ,此种作用可能与CT入侵、细胞内复制有关。     

低氧对复合培养的平滑肌细胞中白细胞介素-6表达的影响

目的：研究低氧对复合培养的平滑肌细胞中白细胞介素6（IL－6）表达的影响。方法：低氧处理与肺微血管内皮细胞复合培养的鼠肺动脉平滑肌细胞，采用RT－PCR方法检测常氧组、低氧2、6、12h组IL－6基因的表达水平，并测定细胞培养上清中IL－6的活性。结果：低氧复合培养2h组肺动脉平滑肌细胞中IL－6　mRNA表达水平升高，在低氧6h组达最高，低氧12h组有所降低，但与常氧组比较有明显差别。低氧复合培养2h组肺动脉平滑肌细胞上清中IL－6的活性明显升高，6h组细胞上清中IL－6的活性水平最高，12h组的活性降低，24h组的水平低于2h组。IL－6活性水平与其基因表达的水平一致。结论：低氧可以增强复合培养的肺动脉平滑肌细胞中IL－6基因的表达，使细胞培养上清中IL－6活性升高，进有可能激活其它一些信号转导相关基因调节细胞的低氧反应。     

沙眼衣原体感染诱导Hela细胞分泌IL—8和IL—l0

目的：探讨沙眼衣原体(CT)感染对上皮细胞系Hela细胞产生IL—8和IL—10能力的影响。方法：采用细胞培养法和ELISA法，对感染CT的Hela细胞上清进行IL—8和IL—10检测。结果：CT感染的Hela细胞IL-8和IL—10分泌量随感染剂量增加而增高；感染24h后，IL—8和IL—10开始显著增加，72h达高峰，以后开始下降，虽然热灭活CT(HI-CT)也能诱导IL—8和IL-l0表达，但诱导水平显著低于感染组。结论：CT感染能诱导Hela细胞大量分泌IL—8和IL-l0，并且呈时间和剂量依赖性，此种作用可能与CT入侵、细胞内复制有关。     

同型半胱氨酸对神经小胶质细胞IL-1β、IL-6表达的影响

目的：研究同型半胱氨酸（HCY）对神经小胶质细胞（bv-2细胞）白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）表达的影响。方法：在细胞培养液中加入HCY、半胱氨酸（DL-CY）、空白对照组及溶剂对照组干预后,用细胞计数试剂盒（CCK8法）观察各组细胞增殖活性,并用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定细胞培养上清液IL-1β、IL-6浓度,用实时荧光定量核酸扩增检测系统（QPCR）的方法评价IL-1β、IL-6 mRNA表达改变。结果：实验各组中细胞增殖活性差异均无统计学意义（P＞0.01）,而HCY组IL-1β、IL-6的mRNA表达及上清液中蛋白表达与其他各组相比均有显著增加（P＜0.01）。结论：HCY上调神经小胶质细胞IL-1β、IL-6的表达。     

Toll样受体-2对角质形成细胞分泌IL-8的影响

目的:观察白念珠菌刺激人角质形成细胞后IL-8的变化以及Toll样受体2(Toll-like receptor2,TLR-2)对IL-8分泌的影响,探讨角质形成细胞在皮肤免疫系统中的作用。方法:白念珠菌分别与抗TLR-2抗体预处理前后的角质形成细胞孵育,ELISA方法检测不同时间培养上清液IL-8的水平。结果:白念珠菌可引起IL-8明显升高(P<0.01),3h开始,至24h达到高峰;中和TLR-2受体后,虽然引起IL-8升高,但无统计学意义(P>0.05)。结论:白念珠菌可以刺激角质形成细胞分泌IL-8,TLR-2在角质形成细胞IL-8表达中的作用尚难确定。     

益肺活血方对香烟提取物诱导巨噬细胞炎症反应的影响

目的探讨益肺活血方对香烟提取物诱导巨噬细胞炎症反应的影响。方法用12-豆蔻酸-13-乙酸佛波醇将U937细胞诱导为巨噬细胞,用1.2、2.4、4.8、9.6 g/L的益肺活血方及5、10、20、50、100 mL/L的香烟提取物处理巨噬细胞,于12、24、48 h用细胞增殖和毒性检测(CCK-8)法测定细胞活性。巨噬细胞分5组:正常细胞组、香烟提取物组、香烟提取物+益肺活血方低、中、高浓度组,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测培养上清白细胞介素-8(IL-8)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,RT-PCR法检测胞内IL-8和TNF-αmRNA水平。机制实验分4组:正常细胞组、香烟提取物组、香烟提取物+益肺活血方(2.4 g/L)组及香烟提取物+NF-κB抑制剂组,蛋白印迹法(Western blot)检测胞内核转录因子-κB(NF-κB)p50、p65及p-IκB表达;免疫荧光法观察胞核内NF-κB p65及胞浆内p-IκB表达。结果益肺活血方(9.6 g/L)作用细胞24、48 h后及香烟提取物(100 mL/L)于各时间点均有细胞毒性(P0.05)。与正常细胞组相比,香烟提取物组IL-8及TNF-α表达上调,胞内NF-κB p50、p65及p-IκB表达亦升高(P0.05),NF-κB核转位增加(P0.05);益肺活血方可抑制诱导后的IL-8和TNF-α的表达以及NF-κB活性(P0.05)。结论益肺活血方可减少香烟提取物诱导的巨噬细胞表达IL-8、TNF-α,抑制NF-κB活化可能是其机制之一。     

化学中毒与急性缺氧的双因素联合效应的实验研究

目的 研究化学中毒与急性缺氧两因素的联合效应。方法 建立常压常氧、常压缺氧和低压缺氧3种模型，以梭曼(Soman)、氰化钠(NaCN)和4-DMAP(4-dimethylaminophenol)为代表，测定大鼠、小鼠、家猫、PC12细胞、兔血红细胞等在3种模型条件下对毒物药物的行为、生化和生理指标变化。结果梭曼单独作用可导致动物协调运动下降、脑等组织含水率增加、脑组织AChE活性降低、MR下调、NE和cAMP含量增加。急性缺氧单独作用也可引起动物协调运动及自主活动的降低、脑等组织含水率的增加、外周血和脑组织AChE活性升高、MR受体上调、NE和cAMP含量增加、4-DMAP药效升高。化学中毒与急性缺氧同时作用，上述变化更加复杂。结论 化学中毒与急性缺氧两种因素同时作用于机体，对机体产生广泛而复杂的损伤作用。此种作用为两因素的联合效应。缺氧引起的机体功能下降对联合效应的增加部分贡献较大。急性缺氧既可使重要的组织成分发生质或量的变化，也会影响某些抗毒剂的作用强度。     

N-乙酰半胱氨酸对脂多糖刺激人子宫平滑肌细胞白细胞介素8表达的影响

目的探讨N-乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)刺激离体培养的人晚期妊娠子宫平滑肌细胞IL-8表达和核转录因子(NF-κB)活性的影响。方法原代培养足月未临产的子宫平滑肌细胞,10μg/mL LPS与经浓度分别为0(生理盐水对照,NS)、5、10、15 mmol/L的NAC预处理的子宫平滑肌细胞作用8 h,以及10 mmol/L的NAC或NS预处理的子宫平滑肌细胞经LPS干预0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h,收集细胞免疫印迹检测NF-κB P65合成情况、RT-PCR检测IL-8 mRNA表达及上清液ELISA检测IL-8浓度。结果1NAC在5~15 mmol/L呈剂量依赖性抑制LPS刺激IL-8蛋白合成和mRNA表达。2随着NAC浓度由低至高,NF-κB P65合成由强到弱,差异有统计学意义(P<0.01),其变化趋势与IL-8 mRNA一致。结论NAC能抑制LPS刺激晚期妊娠子宫平滑肌细胞IL-8蛋白合成和基因表达,可能与其抑制NF-κB激活有关。