人骨髓间充质干细胞分离培养及多向分化的实验研究

目的:探索体外分离子与培养人骨髓间充质干细胞的方法,同时研究其细胞生物学特性,分析其作为骨组织工程种子细胞的可行性。方法:分离人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stemcells,hBMSCs),通过常规培养,在体外观察其生长特性、抗原表达等特征;然后通过条件培养基定向诱导,观察其分化潜能。结果:人骨髓间充质干细胞在体外可以大量增殖,常规培养条件下,原代培养需要2～3周,转代后生长速度加快;应用流式细胞仪检测MSCs的表面抗原,CD44、CD29、CD105阳性,CD45、CD06、CD34以及HLA-DR阴性;在相应条件培养基的诱导作用下,MSCs可以分化为成骨细胞、软骨细胞以及神经细胞。结论:人骨髓间充质干细胞可以从骨髓中分离并在体外培养增殖,同时在体外具有多向分化潜能,可以分化成为骨细胞,符合骨组织工程种子细胞的要求。     

骨髓间质干细胞对B细胞免疫调节作用的影响

目的研究骨髓间质干细胞(MSCs)对B淋巴细胞免疫调节的影响。方法体外分离培养骨髓MSCs,流式细胞仪分选出B细胞,共培养,CpG+CD40L刺激48 h后,收集B细胞,再与分选的CD4+CD25-T细胞共培养,流式细胞术检测B细胞对T细胞炎性因子分泌功能的影响;B淋巴细胞与MSCs共培养,CpG+CD40L刺激72 h后,检测B细胞胞内抑炎因子IL-10的表达;分别加入不同调控通路的抑制剂,观察其对MSCs诱导B细胞产生IL-10的影响。结果与MSCs共培养后,B细胞对T细胞炎性因子IFN-γ分泌的抑制作用增强,IL-10表达水平显著增高;加入COX/PGE2信号通路的抑制剂Indomethacin预处理MSCs后,与其共培养的B细胞表达IL-10显著减少。结论 MSCs能诱导高表达IL-10的调节性B淋巴细胞的产生,该机制可能与COX/PGE2信号通路有关。     

腺病毒介导人uPA感染大鼠间充质干细胞的体外研究

目的 体外分选与鉴定大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),并用腺病毒介导的人尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)体外感染原代MSCs,观察病毒的转导效率及对MSCs增殖的影响. 方法 通过黏附培养分离纯化MSCs,并采用免疫组化DAB显色法鉴定;荧光显微镜检测uPA的转染效率;Western blotting检测uPA在MSCs中的表达;MTT法检测病毒对MSCs增殖的影响. 结果 分选培养的MSCs呈典型的间充质干细胞生长形态,细胞表面标记物CD29和CD90阳性,CD34和CD45阴性;随着病毒感染滴度增高,绿色荧光蛋白(GFP) 的表达率亦呈增高趋势.当感染复数(MOI)＝80且病毒转导72 h后,GFP阳性细胞数占细胞总数的比例达(94.0±1.5)%,可稳定表达7 d以上,且对MSCs的增殖无明显影响.结论 MSCs是一种理想的基因过表达载体,稳定分泌uPA蛋白,可用于肝纤维化的研究.     

大鼠骨髓间质干细胞体外培养扩增及生物学特性研究

[目的]建立从大鼠骨髓中分离大鼠骨髓间质干细胞(rat mesenchymal stemcells,r MSCs)和体外传代培养技术,并对r M-SCs的生物学特性进行研究。[方法]采用贴壁筛选法分离r MSCs,并通过不断传代进行纯化和扩增培养,绘制1、3、5代细胞生长曲线,用流式细胞仪检测其表面抗原,并比较在含不同浓度胎牛血清培养液培养后r MSCs的生长、增殖情况。[结果]r MSCs在体外培养扩增,原代可获得(5~6)×105、第5代可获得(2~3)×108个细胞。r MSCs形态呈长梭形,细胞生长曲线呈S形,流式细胞仪检测结果显示,r MSCs表面抗原CD90表达阳性,而CD45表达阴性。[结论]所建立的分离和培养方法获取的是r M-SCs,具有r MSCs生物学特性,是组织工程研究中良好的细胞来源。     

成人骨髓间充质干细胞的体外培养和表型鉴定

目的 建立成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的分离培养方法,并对其表面标志进行检测,研究骨髓间质干细胞(MSC)基本生物学特性。方法 采用Percoll(1.073 g/mL)梯度离心分离hMSCs,体外扩增,流式细胞仪检测hMSCs表面抗原表达。结果成人骨髓间质干细胞在体外扩增原代及传代培养显示,hMSCs具有活跃增殖的能力,每10 mL骨髓可获得(1.25±0.56)×106个原代细胞,7代可获得(5.32±1.15)×1010个细胞(n=5),随着传代次数的增加,细胞的增殖能力下降。流式细胞仪检测生长良好的第3代hMSC显示CD29、CD44、CD106、CD105、CD166、HLA-A/B/C表达阳性,CD34、CD45、CD14、CD31、CD49d、CD54、HLA-DR/DP/DQ表达为阴性。细胞周期分析显示,hMSCs中,S+G2+M期的细胞约占(16.25±3.18)％,其中s期为(4.12±2.35)％;而处于G0+G1期的细胞总数占(76.35±5.28)％,说明大部分细胞仍然处于静止期。流式细胞仪检测表明分离的hMSCs具有间充质干细胞的特征。结论 hMSCs有很强的自我更新能力,在体外传代培养可维持良好的干细胞生物学特性,为进一步深入研究hMSCs作为组织工程种子细胞的应用提供参数。     

体外培养的婴幼儿MSCs生物学特性研究

目的探讨体外分离和培养的婴幼儿骨髓间充质干细胞(MSCs)的基本生物学特性. 方法无菌条件下抽取先心病婴幼儿骨髓,经密度梯度离心、接种获得MSCs,观察其形态、贴壁率、克隆形成能力、超微结构和生长曲线,流式细胞仪检测细胞表面标记物.结果体外培养的MSCs 3 ～ 4 h后开始贴壁,贴壁率为65% ～ 80%;2 ～ 3 d可见集落形成,10 d左右融合90%以上,随着传代次数增加, 克隆形成率逐渐降低.透射电镜观察显示体外培养的MSCs具有MSCs典型的超微结构,其表面标记物CD29、CD44、CD71、CD90表达阳性.结论体外分离培养的先心病婴幼儿MSCs生长稳定且增殖较快,可作为体外构建工程化先心病修复材料的种子细胞来源.     

骨质颗粒分离培养间充质细胞的实验研究

目的:为探索间充质干细胞更广泛的来源。方法:选择了正常人骨髓,急性粒细胞性白血病缓解期患者骨髓、再生障碍性贫血患者骨髓、脐带血和骨质颗粒等5种标本来源。采用贴壁法和特殊的干细胞培养基/间充质干细胞刺激因子分离、纯化MSCs,观察比较不同来源MSCs的体外生长特性,流式细胞术检测培养细胞的CD105。结果:正常人骨髓、急性粒细胞性白血病缓解期患者骨髓和骨质颗粒标本均能培养出MSCs,从骨质颗粒得到的MSCs数量较多。脐带血和再生障碍性贫血患者骨髓标本没有培养出MSCs。培养的MSCs均一地表达CD105。结论:在体外培养人类正常骨髓和急性粒细胞性白血病缓解期的骨髓均可以得到MSCs,两种样本分离培养得到的MSCs在形态学、表面标志、增殖特性等方面没有显著差异。从人类骨质颗粒得到的MSCs的生长从数量上优于从骨髓中获得的MSCs。     

脐血单个核细胞体外分离和定向分化为神经干细胞的实验研究

目的 探讨人脐血单个核细胞的分离培养和诱导后神经干细胞(NSCs)标志物mRNA的表达.方法 使用密度梯度离心法得到脐血单个核细胞,用体外贴壁生长的方法获得脐血间质干细胞(MSCs),观察培养过程中脐血MSCs形态的变化,通过流式细胞仪检测干细胞表面抗原的表达,使用NGF和RA联合诱导后,用RT-PCR方法鉴定诱导前后NSCs标志物巢蛋白(nestin)及Musashi-1蛋白mRNA的表达.结果 脐血单个核细胞贴壁生长后大部分细胞呈梭形,诱导后可分化为神经元样细胞.流式细胞仪检测该细胞不表达CD34、CD11a、CD11b和强表达CD29,符合MSCs特征.诱导后,NSCs表面标志Nestin及Musashi-1表达明显增强,48h达高峰,然后逐渐减弱.结论 脐血中存在间质干细胞,分离后可以体外扩增,诱导后分化为神经元样细胞,并表达NSCs表面标志.脐血能够成为NSCs的新来源.     

兔外周血间充质干细胞生物学性状的研究

目的应用G—CSF动员骨髓干细胞后分离外周血间充质干细胞（MSCs）,并体外培养扩增然后进行鉴定。方法应用密度梯度离心法和贴壁培养法分离、培养兔外周血MSCs,并用显微镜观察细胞形态,测定细胞的生长曲线并用流式细胞仪鉴定。结果@MSCs于体外培养2h开始贴壁生长,细胞形态为梭形、多角形及纺锤状等。传代MSCs变为形态均一、排列有序的长梭形细胞,增殖活跃,细胞平均倍增时间为30h;②流式细胞仪检测MSCs表面抗原CD34、CD45呈阴性表达,CD44呈阳性表达。结论采用密度梯度离心法和贴壁法可以有效获得应用G—CSF动员后的外周血MSCs,且细胞纯度高,生长增殖活性好。     

淫羊藿苷对骨髓问充质干细胞免疫调控能力的影响

目的研究淫羊藿苷对人骨髓问充质干细胞（MSCs）免疫调控能力的影响。方法从人骨髓中分离MSCs并进行传代培养,通过流式细胞术观察其表型。选取第5代MSCs进行研究,通过混合淋巴增殖反应和定量PCR方法检测淫羊藿苷对MSCs免疫抑制能力和免疫调控相关基因表达情况的影响。结果所获得的骨髓贴壁细胞CD34和CD45表达阴性,CD44、CD71、CD90和CDl05阳性表达,符合MSCs的特征。在体外混合淋巴细胞培养体系中,淫羊藿苷处理后的MSCs对淋巴细胞增殖的抑制作用增强,且淫羊藿苷处理后的MSCs中表达更多的HMOX-1、IL-10、iNOS和IL-2基因,而IL-1α、IL-1β和IFN-γ基因的表达水平下降。结论淫羊藿甘可提高骨髓MCSs的免疫抑制能力,淫羊藿苷处理后的MSCs免疫抑制相关基因表达增加,促炎相关基因表达减弱。     

孕周与母儿血甲状腺激素含量的关系

目的：观察不同孕周与母儿血甲状腺激素的关系。方法：应用放射免疫分析法对67例中、晚期妊娠要求引产患者，10例早产及78例孕足月自然分娩患者进行了母血及胎儿脐静脉、脐动脉血中TSH、T3、T4的测定。结果：TSH值在母血及胎儿血中随着孕周的增加而增加．T3值在胎儿血中与母血中比较，显示低T3血症，T4值接近正常母体水平。结论：测定母血中的甲状腺激素，可动态观察不同孕周甲状腺激素变化，可及时发现胎儿低甲血症。     

褪黑素载药纳米粒的优化设计及研制

目的：探讨采用复合乳液-溶剂挥发法制备褪黑素载药纳米粒的最佳工艺条件。方法：以聚乳酸、壳聚糖可降解生物材料为载体,明胶为分散剂,span-80和tween-80混合液为微乳液,根据微粒的表面形态、粒径大小、分布、包封率、载药量选择最佳工艺条件,制备褪黑素载药纳米粒。结果与结论：原子力显微镜下可见纳米粒表面圆滑,分布均匀。正交设计效应曲线图直观分析和方差分析结果显示,搅拌速度、溶剂挥发温度、聚乳酸与褪黑素投药比、壳聚糖浓度是影响制备工艺的主要因素。在30℃,1000r／min搅拌速度,搅拌时间45min,m(褪黑素)：m(聚乳酸)为1：5,V(Tween-80)：V(Span-80)为5：1,壳聚糖质量浓度为1％条件下,可制备成平均粒径为45．84nm,包封率为38．33％,载药量为8．35％的褪黑素载药纳米粒。     

高效液相色谱法检测人血浆中咖啡因及其3种去甲基代谢产物

以８－氯茶碱作为内标，利用高效液相色谱同时测定人血浆中咖啡及其３种去甲基代谢产物－－副黄嘌呤、可可碱和茶碱的方法。这４种物质可以在一个固定相柱子上被同时分离；流动相为甲；０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸二氢钠（３０：７０）（Ｖ／Ｖ）；流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ；紫外检测器，波长２７４ｎｍ。实验表明这４种物质的最小检出量均在７５ｎｇ／ｍｌ，并具有较好的线性、重复性及较高回收率。     

HepG2 细胞谷胱甘肽含量和谷胱甘肽转移酶活力的诱导

目的：建立一种具有较高ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力的肝细胞系。方法：将ＨｅｐＧ２细胞在０．１,０．３,０．５ｍｇ／Ｌ浓度的ＣＤＤＰ间歇作用下传代１２个月后得到三种稳定的ＣＤＤＰ耐药细胞系ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．３,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．５细胞的ＧＳＨ含量和ＧＳＴ活力,结果用显著性ｔ检验方法作统计学处理。结果：诱导刺激后的子代ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０．１,ＨｅｐＧ２／ＣＤＤＰ０     

清醒豚鼠的耳蜗电图

在面神经管内长期植入电极记录清醒豚鼠的耳蜗电图，测量了耳蜗电图中各项指标的正常值。耳蜗微音器电位的波幅以短纯音２ｋＨｚ刺激时为最大，其次是０．５、１、４ｋＨｚ，以８ｋＨｚ时为最小。面神经管法记录的总和电位（ＳＰ）的极性均为负性，在短声刺激时ＳＰ／ＡＰ为０．０８４±０；０４３。动作电位（ＡＰ）Ｎ，波的反应阈值在短声刺激时为２．６±４．２ｄＢ，在０．５和ｌｋＨｚ短纯音刺激时分别为５３．２±５．４和４２．４±７．３ｄＢ。在０．５、１．２、４ｋＨｚ短纯音刺激时均可见频率跟随反应，在０．５和１ｋＨｚ时，其波幅大于同频率ＡＰ（Ｎ１）波幅，其反应阈值低于同频率ＡＰ（Ｎ１）反应阈值。     

应用重组促红细胞生成素治疗长期血透患者的贫血

作者应用重组促红细胞生成素(rHuEPO)治疗68例依赖输血的透析患者(醋酸盐血透32例,碳酸氢盐血透24例,血液滤过12例)。治疗前 Hb 52.7±8.0g/L,Ht19.4±2.2%,血清铁蛋白>100μg/L。rHuEPO 治疗剂量150～300 u·kg~(-1)/周,静脉推注。当 Hb>100～120g/L,Ht>30%～35%时将 rHuEPO 减至维持量。疗程6.2±4.3个月。所有患者经 rHuEPO 治疗后不再输血,Hb 和 Ht 均有不同程度上升。其中39例 Hb 净增大于60g/L,Ht 增加大于10%,分别占治疗病例的57.4%。结果表明,rHuEPO 剂量为150～300 u·kg~(-1)/周是安全有效的,副作用远较国外报道为低。     

急性心肌梗死心力衰竭患者血浆肌钙蛋白Ⅰ、高敏C-反应蛋白和NT-proBNP的变化及心脉隆干预疗效

目的研究急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)心力衰竭(简称心梗心衰)患者血浆中肌钙蛋白(Ⅰcardiac troopingⅠ,cTnI)、高敏C-反应蛋白(high-sensitivity creactive protein,hs-CRP)、N末端脑钠肽前体(N-terminal-pro-brain-natriuretic-peptide,NT-proBNP)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase-MB,CK-MB)的变化,探讨心脉隆对急性心梗心衰患者干预的疗效。方法选取35例健康者为正常对照组;42例急性心梗心衰患者为心梗组,并随机将其中21例患者分为心脉隆组,21例为常规治疗组,两组均按急性心肌梗死治疗指南进行处置,常规治疗组患者接受抗血小板、抗凝、降脂、扩张冠状动脉、抗心衰等方面治疗,心脉隆组在此基础上加用心脉隆静脉滴注;心脉隆的使用方法为5%的葡萄糖中加入6mL心脉隆2次/d,疗程为14d。结果与正常健康人比较,急性心梗心衰患者肌钙蛋白I、高敏C-反应蛋白、NT-proBNP、肌酸激酶同工酶及左心室收缩末期容量指数(left ventricular ...     

同型半胱氨酸与缺血性心肌病和扩张性心肌病的关系探讨

目的：探讨同型半胱氨酸（Hcy）水平变化与缺血性心肌病和扩张性心肌病的关系及意义。方法：选取我院冠心病患者198例,其中缺血性心肌病患者80例（A组）,扩张性心肌病患者53例（B组）,普通冠心病患者65例（对照组）,入选者均行冠状动脉造影。比较三组的一般临床资料。采用酶联免疫法测定并比较三组血清同型半胱氨酸水平,测定相关生化指标。采用彩色多普勒超声诊断仪测定三组左房内径,左室舒末内径及左室射血分数。结果：B组与对照组相比,同型半胱氨酸水平无明显差异,A组同型半胱氨酸水平明显高于对照组（P〈0.05）,A组同型半胱氨酸水平与B组相比显著增高（P〈0.05）,A组年龄高于B组及正常对照组（P〈0.05）。三组一般临床资料,如糖尿病、血脂、高血压、吸烟饮酒、叶酸、维生素B12水平等方面比较,差异无统计学意义。与对照组相比,A组与B组的左房内径、左室舒末内径明显增大（P〈0.05）,左室射血分数明显降低（P〈0.05）。结论：检测同型半胱氨酸水平在临床上可对鉴别缺血性心肌病和扩张性心肌病提供帮助。     

急性胰腺炎患者血清IMD及PCT动态变化监测的临床价值

目的 探讨急性胰腺炎(AP)患者血清垂体中叶素(IMD)及降钙素原(PCT)动态变化监测的临床价值.方法 选取我院2013年1月至2016年9月急性胰腺炎患者91例作为研究对象,所有患者均于入院时、第3天、第5天、第7天采集静脉血,采用酶联免疫吸附法测定PCT,同时进行APACHEⅡ评分;根据患者急性胰腺炎严重程度分为轻症胰腺炎(MAP)组49例和重症胰腺炎(SAP)组42例.比较两组IMD及PCT动态变化.结果 组内比较,两组患者第3天、第5天、第7天IMD均低于入院时,第3天PCT明显高于入院时,差异均有统计学意义(P<0.05);MAP组第5天、第7天PCT明显低于入院时,SAP组第5天PCT高于入院时,第7天低于入院时,差异均有统计学意义(P<0.05);组间比较,MAP组患者入院时、第3天、第5天、第7天IMD均高于SAP组,PCT均低于SAP组,差异均有统计学意义(P<0.05);MAP组患者24 h APACHEⅡ评分为(4.54±0.98)分,明显低于SAP组的(15.09±3.72)分,差异有统计学意义(P<0.05);MAP组、SAP组APACHEⅡ评分与IMD的相关系数分别为-0.089、-0.118,呈负相关;与PCT相关系数分别为0.194、0.233,呈正相关(P<0.01).结论 血清IMD及PCT可在一定程度上反映AP严重程度及疗效,具有较高的临床价值.     

生长激素治疗特发性矮小儿童随访至接近成年终身高的治疗效果分析

目的 评价用生长激素治疗的特发性矮小（idiopathic short status,ISS）年长儿随访至接近成年终身高的治疗效果,并分析相关影响因素。方法 随访曾予生长激素治疗、目前已停药并达接近成年终身高的ISS患者。主要评价指标为接近成年终身高标准差积分（near-adult height standard deviation scores,NAHtSDS）与遗传靶身高（target height,TH）,也叫父母中位身高（mid-parent height,MPH）,标准差积分（standard deviation scores,SDS）的差值,即△HtSDS,并分析相关影响因素。结果 生长激素治疗初始HtSDS男女分别为-3.31,-2.86。接近成年终身高HtSDS分别为-1.98,-1.39。男女患儿接近成年终身高SDS与用药初始SDS相比,差异有统计学意义（P=0.000）。以遗传靶身高HtSDS为标准,采用非劣效检验分析接近成年终身高与遗传靶身高接近程度,提示ISS男性患儿接近成年终身高低于遗传靶身高,女性患儿接近成年终身高不劣于遗传靶身高。55.7%（59/106例）ISS男性患儿、71.4%（50/70例）ISS女性患儿其接近成年终身高HtSDS>-2 SD,即达到正常、非矮小身高。这部分人群,男性患儿和女性患儿在<1年和 ≥ 1年的疗程内,其接近成年终身高与遗传靶身高HtSDS相比,均具有非劣效性。采用多重线性回归,以△HtSDS为因变量,分析性别、用药初始年龄、用药初始HtSDS、用药初始骨龄、疗程对△HtSDS的影响。性别、用药初始HtSDS、疗程对△HtSDS的影响差异有统计学意义（P值分别为0.005,0.000,0.027）。结论 本研究ISS年长儿,应用生长激素治疗,大部分可达到正常人群身高。女性患儿、用药初始HtSDS高、长疗程,有助于其达到或接近遗传靶身高。