垂体腺苷酸环化酶激活多肽调节LPS激活的树突状细胞免疫功能

目的:研究垂体腺苷酸环化酶激活多肽(pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP)能否调节小鼠骨髓起源的LPS激活的树突状细胞(dendritic cell,DC)的免疫功能。方法:联合应用rmGM-CSF和rmIL-4自C57BL/6小鼠骨髓细胞制备DC,以LPS和(或)PACAP刺激DC;收集被激活的DC及其上清液行ELISA和流式细胞术分析;自DC提取总RNA行RT-PCR和RNase分析。结果:PACAP能明显抑制LPS激活的DC分泌细胞因子IL-2、IL-12和TNF-α(P<0.05,P<0.01,P<0.01),以及LPS激活的DC分泌趋化因子MIP-2(P<0.01),但抑制细胞因子IL-6,趋化因子MIP-1α和MIP-1β的作用并不明显(P>0.05)。结论:PACAP对LPS激活的DC的免疫功能具有负性调节作用。     

热休克瘤细胞裂解物冲击的异基因树突状细胞促进抗肿瘤免疫

目的探讨热休克瘤细胞裂解物冲击的异基因树突状细胞（DC）抗肿瘤免疫效应。方法应用热休克（43℃,1h）小鼠Lewis肺癌细胞（LLC）裂解物（LhTCL）冲击的小鼠骨髓细胞衍生的树突状细胞（DC）作为瘤苗（DC／LhTCL）。应用Western印迹检测可诱导HSP70表达。用FITC-标记的LhTCL和CFSE-标记的异基因DC分别进行体外吞噬和体内示踪实验,藉酶联免疫吸附（ELISA）、流式细胞术（FCM）和共聚焦荧光显微镜观察分析不成熟异基因DC体外摄取LhTCL对其表型和IL-12产生的影响以及受鼠接种局部引流淋巴结DC（LD-DC）对异基因DC的摄取。然后,通过免疫接种的小鼠脾细胞体外诱生CTL的杀瘤活性（LDH法）和产生的Th-1相关细胞因子检测,LLC移植瘤的免疫预防和早期带瘤鼠的治疗实验以评价C57BL小鼠接种异基因或同系DC／LhTCL瘤苗的产生的抗肿瘤免疫效应。结果（1）热休克增加LLC胞浆内可诱导HSP70表达。（2）小鼠不成熟异基因DC能充分摄取LhTCL并促进其DC成熟（增加DC表面共刺激分子表达和IL-12分泌）。（3）皮下注射LhTCL冲击的异基因DC观察到有促进受鼠DC摄取异基因DC的效应。（4）LhTCL冲击的异基因DC免疫的C57BL小鼠脾细胞能特异性杀伤活LLC,分泌Th-1相关的细胞因子（高水平IFN-γ和低水平IL-4和IL-10）。（5）C57BL小鼠LLC移植瘤免疫保护实验和治疗实验均证实,免疫接种异基因DC／LhTCL瘤苗能够阻止或延缓LLC肿瘤的生长,其产生的免疫保护效应要比同系DC／LhTCL瘤苗强。结论接种热休克处理的肿瘤裂解物冲击的异基因树突状细胞瘤苗有促进抗肿瘤免疫的效应。     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞细胞因子分泌及其PI3K-Akt信号通路的影响

目的:探讨乙型肝炎e抗原(HBe Ag)对小鼠骨髓源性树突状细胞(DCs)细胞因子分泌及其PI3KAkt信号通路的影响。方法:分离C57BL/6小鼠骨髓细胞,体外诱导为未成熟树突状细胞(DCs),经CD11c磁珠分选纯化并用LPS刺激成熟后,分成3组:空白组、OVA组和HBe Ag组。经酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组培养上清中IL-12p70和IL-10的分泌,用混合淋巴细胞反应(MLR)和Westernblot法分别检测各组DCs刺激T淋巴细胞增殖能力以及细胞内Akt磷酸化水平。结果:HBe Ag组上清液中IL-12p70分泌水平以及DCs刺激T淋巴细胞增殖能力较空白组和OVA组明显降低(P<0.05),而IL-10分泌水平及DCs细胞内Akt的磷酸化水平较其余2组明显升高,差异均具统计学意义(P<0.05)。结论:HBe Ag能够减弱DCs的免疫功能,抑制后者分泌IL-12的同时,增加IL-10的分泌。这些改变可能与PI3K-Akt信号通路的激活有关。     

益气养阴解毒方抑制Lewis肺癌小鼠移植瘤生长及诱导移植瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究益气养阴解毒方对Lewis肺癌(LLC)小鼠移植瘤生长及细胞凋亡的影响.方法 复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌模型,将接种Lewis肺癌的C57BL/6小鼠随机分为6组:对照组(A组)、益气养阴解毒方低剂量组(B组)、中剂量组(C组)、高剂量组(D组)、顺铂(DDP)组(E组)、益气养阴解毒方联合DDP组...     

HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞表型及功能的影响

目的 研究HBeAg对小鼠骨髓源性树突状细胞(dendritic cell,DC)表型及功能的影响。 方法 以rmGM-CSF和rmIL-4定向体外诱导C57BL/6小鼠骨髓细胞分化成未成熟DC,随机分为空白对照组、HBeAg刺激组、脂多糖(LPS)刺激组和HBeAg+LPS刺激组。以流式细胞术检测DC表型变化,混合淋巴反应(MLR)检测DC促T淋巴细胞增殖能力,酶联免疫法(ELISA)检测细胞上清液中IL-12的分泌水平,CCK-8法检测HBeAg对骨髓源性树突状细胞活力影响。 结果 HBeAg刺激后,CD11c阳性细胞百分数下降。 HBeAg可抑制DC表面MHC-Ⅱ、CD86的表达和DC促淋巴细胞增殖的能力,且HBeAg可抑制LPS诱导的树突状细胞IL-12的分泌,细胞活力检测显示HBeAg对细胞没有明显毒性作用。 结论 HBeAg对树突状细胞的成熟有一定的负性调节作用,这可能是HBV的持续感染的机制之一。     

抗原致敏树突状细胞诱导CTL对MCF-7细胞的体外杀伤效应

目的:采用MCF-7乳腺癌细胞裂解物致敏树突状细胞(DC),观察其体外诱导人T淋巴细胞产生特异性抗乳腺癌免疫的效能。方法:联合应用细胞因子从外周血单个核细胞(PBMC)中诱导出DC,体外负载MCF-7细胞冻融抗原,活化自身T淋巴细胞,采用ELISA法测定γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-12(IL-12)水平,乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对MCF-7细胞的杀伤效应。结果:负载抗原DC与T淋巴细胞共培养产生IFN-γI、L-12的水平,显著高于未负载抗原DC组(P<0.05)、单纯抗原组(P<0.01)和对照组(P<0.01);负载抗原DC诱导CTL对MCF-7的杀伤效应,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:MCF-7细胞裂解物致敏DC诱导的人CTL,对MCF-7细胞具有明显的特异性杀伤效应。     

CpG寡核苷酸对C57BL/6小鼠肝癌模型影响的初步研究

目的建立C57BL/6小鼠肝癌模型并研究CpG寡核苷酸（ODN）对C57BL/6小鼠肝癌模型的治疗效果。方法用HE染色鉴定C57BL/6小鼠肝癌模型。肝癌模型建立后,分别用PBS及CpG寡核苷酸处理C57BL/6小鼠肝癌模型,并用FCM检测小鼠脾脏CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的组成,ELISA法测免疫小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平。结果成功建立C57BL/6小鼠肝癌模型,ODN处理组的肝癌细胞裂解物中CD3-FITC、CD4-FITC、CD8-FITC、NK1.1-FITC的体外杀伤活性以及荷瘤小鼠血清中IFN-γ、IL-4水平均显著高于PBS组。结论 CpG ODN能够提高小鼠对肝癌的免疫功能,尤其是特异性细胞免疫功能     

吗啡持续刺激对小鼠树突状细胞发育及分泌IL-12的影响

目的 吗啡持续刺激对C57BL/6小鼠骨髓来源的树突状细胞成熟的影响.方法 体外培养C57BL/6小鼠骨髓来源的树突状细胞,培养过程中给予吗啡刺激,观察细胞形态的变化;应用酶联免疫吸附法检测树突状细胞分泌细胞因子IL-12水平的变化.结果 吗啡干预各组树突状细胞中细胞因子IL-12分泌水平较对照组显著升高.结论 吗啡持...     

黄芪、苏木及其组方对荷瘤小鼠脾调节性T细胞表达及血清细胞因子水平的干预作用

目的观察黄芪、苏木及其组方对荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞表达及血清细胞因子水平的干预作用。方法复制C57BL/6小鼠Lewis肺癌动物模型,动态观察黄芪、苏木及其组方对抑瘤率、肺转移抑制率、荷瘤小鼠体重、生存期的影响。接种后6、10、15、20d流式细胞仪检测荷瘤小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞的表达,20d采集小鼠血清,流式微球阵列技术检测细胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12p70、IFN-γ水平,酶联免疫法(ELISA)法检测转化生长因子β(TGF-β)水平。结果苏木组6d、黄芪+苏木组10d瘤重低于荷瘤对照组(P<0.05);黄芪+苏木组肺转移抑制率为77.75%;荷瘤对照组小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+细胞表达随荷瘤天数的增加呈上升趋势,20d黄芪组小鼠脾CD4+CD25+Foxp3+细胞表达低于荷瘤对照组(P<0.05),黄芪+苏木组显著低于荷瘤对照组(P<0.01);黄芪+苏木组小鼠血清IL-10、TGF-β水平低于荷瘤对照组(P<0.05);中位生存期分别为黄芪+苏木组(39d)>黄芪组(38d)>苏木组(35d)>荷瘤对照组(24d)...     

TNF-α gene-modified dendritic cells act as more potent adjuvants for peptide delivery to induce specific antitumor immunity in mice

Objective To investigate the antitumor immune efficiency of mouse dendritic cells (mDCs) by using adenovirus-mediated tumor necrosis factor-alpha (AdV-TNF-α) gene transfer.Methods MDCs infected with AdV-TNF-α and AdV-pLpA (no gene insert) at 100 multiplicity of infection (MOI) were analyzed by RNase protection assay for their cytokine secretion. Mixed lymphocyte reactions were also performed to analyze their capacity for alloantigen-presentation. C57BL/6 mice were challenged with R3LL tumor cells (Lewis lung carcinoma line) 10 days after vaccination with different engineered DCs and regular DCs as well.Results Compared to AdV-pLpA and mock-infected DCs, AdV-TNF-α-infected DCs displayed up-regulated expression of alpha tumor necrosis factor, interleukin-12 (IL-12), interleukin-18 (IL-18) and granulocyte macrophage colony stimulation factor (GM-CSF), and indicated stronger allogeneic T cell proliferative responses. Furthermore, vaccination of mice with dendritic cell tumor necrosis factor-alpha (DCTNF-α) pulsed with Mut1 peptide induced more efficient tumor-specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) cytotoxicity against R3LL tumor cells in vitro and with efficient antitumor immunity in vivo. Conclusion This type of engineered DCs could be applied in clinical settings of DC-based cancer vaccines     

吞噬凋亡肿瘤细胞的树突细胞疫苗抗肿瘤效果观察

目的：研究吞噬凋亡肿瘤细胞的树突细胞疫苗的抗肿瘤效果,以确定一种有效的树突细胞疫苗。方法：由黑色素瘤细胞（BLb-10)生成凋亡细胞,树突细胞（DC）与凋亡肿瘤细胞培育后,收集和提纯吞噬凋亡肿瘤细胞的树突细胞,再对其表型变化及抗肿瘤效果进行检测,并与加肿瘤细胞肽（mTRP2)的树突细胞的结果比较。结果：吞噬凋亡肿瘤细胞后,DC更加成熟。表现出促炎症细胞因子（IL－1,IL－6,TNF－α,IFN--γ和GM－CSF）,趋化因子（MIP－1,MIP－1和MIP－2）,细胞表面分子（HMC-Ⅱ,CD11bCD40和CD86）以及某些趋化因子受体（CCR7）表达增加而某些趋化因子受体（CCR2和CCR5）表达减少。吞噬了凋亡黑色素瘤细胞的树突细胞疫能（i）更强地刺激体外T细胞增生,（ii）诱导体内Th1型免疫反应而导致更有效的肿瘤特异细胞毒CD8＋细胞 介导的免疫,和（iii)防止了免疫鼠肺肿瘤转移,而加肿瘤细胞肽的树突细胞疫苗只能减少免疫鼠的肺肿瘤转移。结论：吞噬凋亡黑色素瘤细胞的树突细胞疫苗为癌细胞疫苗研究提供了新的途径。     

肿瘤抗原冲击DC诱导淋巴细胞对小鼠胃肠癌的杀伤作用

目的：用胃肠癌冻融抗原冲击树突状细胞（DC）诱导荷瘤小鼠脾细胞，观察DC及细胞毒T细胞（CTL）的生物学功能及对胃肠癌靶细胞体外杀伤作用。方法：小鼠骨髓细胞经GM-CSF、IL-4诱导和胃肠癌细胞系 KATO3、CT26细胞冻融抗原（Ag）的冲击，诱生致敏的DC与活化脾淋巴细胞共培养，获得的CTL对相应靶细胞及对照黑色素瘤细胞进行体外杀伤。结果：制备的DC与CTL具有良好的生物学活性，胃肠癌 Ag冲击的DC诱导的CTL对相应靶细胞的杀伤率分别平均75.98%和86.75%，且效靶比显示量效关系；对无关靶细胞A375为10.57%和11.53%。结论：胃肠癌Ag冲击致敏的DC能诱导CTL产生特异性杀伤作用。     

In Vitro Anti-tumor Immune Response Induced by Dendritic Cells Transfected with Recombinant Adenovirus Carrying Mutant K-ras Genes

Summary： The specific anti-tumor immune response induced by mouse bone marrow dendritic cells （DCs） lransfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes was investighted. DCs were generated from mouse bone marrow in the presence of rmGM-CSF （3.3 ng/mL） and rmIL-4 （1.3 ng/mL） and detected by FACS, and then transfecled with the recombinant adenovirus encoding mutant k ras gene. The efficacy of transfection and T cell stimulating activity of DCs were detected. CTL activity of the mice vaccinated with DCs was observed. The resuhs showed thai DCs had dendritic veiled morphology. BmDCs highly expressed B7-1（80%）, B7-2（77%）, MHC Ⅱ （70%）, CDllc （65%）, CD40 （70%） and CD54 （96%） with FACS, and no significant difference in the expression was observed before and after the transfection （P〈0.05）. The DCs transfeeled by mutant k-ras gene could significantly stimulate lymphoeytes proliferation as compared with those transfeeted by Ad e or non-modified DCs （P〈0.05）. DC vaccine transfected by mutant k-ras gene could induce CTL activity against Lewis lung cancer, but not against B16. The specific eytotoxicity against Lewis lung cancer in Ad-k-ras/12-transdueed DC group was signifieantly higher than those in the control, vector and non transfeeted DCs groups （P〈0.05）. It was concluded that special antitumor response could be induced by DCs transfected with recombinant adenovirus carrying mutant k-ras genes.     

白细胞介素-23基因修饰树突细胞获取凋亡癌细胞抗原诱导的抗胰腺癌免疫治疗

目的 探讨白细胞介素23（IL-23）基因转染的树突状细胞（DC）负载凋亡癌细胞抗原后诱导的免疫应答对小鼠胰腺癌的治疗作用。方法 克隆并构建IL-23基因真核双表达载体,转染DC后检测其表型及自分泌IL-23和IL-12的能力;观察各组脾脏T淋巴细胞γ干扰素（IFN-γ）和IL4的分泌量以及DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对胰腺癌细胞的杀伤作用。转染DC并负载肿瘤抗原后制备成疫苗对小鼠抗肿瘤的免疫保护作用和肿瘤抑制作用。结果基因测序证实IL-23基因克隆及双表达载体构建成功,转染后DC对共刺激分子MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表达增强;DC自分泌IL-23和IL-12的能力显著增强。DC介导的免疫应答促进了IFN-γ生成型Th1细胞的产生,IL-23转染组每24hIFN-γ的分泌（最高为535pg／ml／10^6）与其他各组比较（对照组每24h为60pg／ml／10^6）,P〈0．01;转染的DC疫苗在体内诱导出高水平的CTL活性（P〈0．05）。接种IL-23修饰DC疫苗后小鼠的免疫防御能力显著增强;对肿瘤的生长有明显抑制作用,治疗组荷瘤鼠生存期与其他各组比较差异有显著意义。结论IL-23使DC抗原递呈能力更强,IL-23修饰DC疫苗可强化宿主针对特异肿瘤的CTL免疫应答,使宿主不仅产生防御性免疫反应而且增强自动免疫能力。     

靶向树突状细胞的肿瘤疫苗OVA慢病毒载体构建及其体外抗肿瘤效应

目的构建靶向树突状细胞(dendritic cell,DC)的肿瘤疫苗pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体,并观察肿瘤抗原特异性DC激活T细胞对小鼠Lewis肺癌细胞(lewis lung carcinoma cell,LLC)的抗肿瘤效应,为肺癌的临床治疗提供实验依据。方法以分子克隆方法构建携带模拟肿瘤抗原鸡卵清蛋白(ovalbumin,OVA)的慢病毒表达载体,经XhoⅠ及XbaⅠ双酶切后电泳和DNA测序验证;应用脂质体法三质粒共转染293T细胞,包装产生慢病毒,转导LLC,进行单克隆化筛选培养后,经RT-PCR、Western blot检测所获得的OVA稳定表达细胞株中OVA的表达;分离纯化小鼠骨髓DC;用慢病毒感染DC;分离纯化小鼠脾T淋巴细胞;应用MLR和MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激T淋巴细胞对LLC的杀伤作用。结果 (1)构建的pHR-CMV-EGFP-OVA慢病毒表达载体经酶切后电泳和DNA测序,结果显示载体构建正确;(2)获得了纯化的小鼠骨髓来源的DC;(3)获得了携带肿瘤抗原OVA的LLC和DC;(4)负载肿瘤抗原的DC刺激T淋巴细胞能有效地杀伤负载相同肿瘤抗原的LLC。结论本研究成功地构建了携带肿瘤模拟抗原OVA的慢病毒表达载体pHR-CMV-EGFP-OVA,并成功地转导LLC与DC,获得了稳定表达OVA的肺癌细胞株和携带OVA的DC,基于肿瘤抗原靶向DC的抗肿瘤策略能有效地杀伤LLC,为靶向DC的肺癌免疫治疗提供了体外实验依据。     

肿瘤抗原多肽致敏白细胞介素18基因修饰的树突状细胞治疗小鼠转移性肺癌

目的探讨肿瘤多肽致敏的白细胞介素18(IL-18)基因修饰的树突状细胞(DC)对自发性肺转移癌的治疗作用。方法小鼠足垫注射3LLLewis肺癌细胞建立自发性肺转移癌模型,经骨髓来源的IL-18基因修饰、3LL特异抗原多肽Mut1体外致敏DC(DC-IL-18/Mut1)皮下免疫2次,观察荷瘤鼠肺脏重量、肺表面转移结节、存活期的变化及相应免疫指标等变化,实验分8组,组间差异行t检验,生存期行时序检验。结果与对照病毒组(DC-LacZ/Mut1)及未处理DC组相比,DC-IL-18/Mut1组肺脏重量最轻(215mg±20mg与398mg±23mg和987mg±45mg比较,t值分别为14.7及38.4,P均<0.01)、肺表面转移结节最少(0与7.8±2.7和49.4±4.3比较,t值分别为7.07及16.2,P均<0.01)、存活期最长(χ2分别为6.78、10.49,P均<0.01),其诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性(53.4±3.1与41.3±2.6和9.8±2.1比较,t值分别为7.3及28.5,P均<0.01)和天然杀伤细胞(NK)活性(35.8±2.4与15.6±2.8及13.6±2.5比较,t值分别为13.4及15.7,P均<0.01)最显著,且CD4+T、CD8+T及NK细胞比例增加。结论MHCⅠ类限制性肿瘤抗原多肽致敏的IL-18基因修饰的DC能通过诱导显著的抗肿瘤免疫反应而对自发性肺转移癌有明显的治疗作用。     

塞来昔布对Lewis肺癌细胞增殖及移植瘤的抑制作用

目的:探讨选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对Lewis肺癌细胞株增殖及小鼠皮下移植瘤的影响。方法:常规培养Lewis肺癌细胞,实验分为对照组和塞来昔布用药组。MTT法检测细胞增殖水平,损伤修复实验检测细胞迁移能力;将Lewis肺癌细胞接种于12只C57BL/6小鼠皮下,对照组隔日腹腔注射生理盐水;塞来昔布用药组隔日腹腔注射塞来昔布30 mg/kg,24 d后处死,计算抑瘤率,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测移植瘤组织中VEGF mRNA表达水平,同时酶联免疫检测小鼠血清中MMP-9浓度。结果:塞来昔布对Lewis肺癌细胞增殖的抑制作用呈时间-剂量依赖性效应(P<0.05)。20μmol/L塞来昔布组细胞迁移速度(0.37±0.03)μm/h明显减慢,与对照组(3.17±0.22)μm/h相比具有显著性差异(P<0.01);在体实验显示,塞来昔布具有明显的抑制Lewis肺癌移植瘤增殖的作用,同时能抑制移植瘤组织中VEGF表达、降低血清MMP-9浓度。结论:塞来昔布可以显著抑制Lewis肺癌细胞的增殖与迁移能力,且对Lewis肺癌移植瘤有明显抑制作用。