EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立

目的构建含EB病毒（EBV）潜伏膜蛋白基因2A（LMP2A）的逆转录病毒表达载体，筛选建立携带该基因的高滴度产毒细胞系。方法逆转录一聚合酶链反应（RT—PCR）扩增获取目的基因LMP2A，定向插入逆转录病毒表达载体pMSCVpuro，形成重组质粒pMSCVpuro-2A，脂质体法将pMSCVpuro-2A转染逆转录病毒包装细胞PT67。嘌呤霉素筛选产毒细胞克隆，扩大培养产毒细胞克隆，收获病毒进行滴度测定，RT-PCR检测产毒PT67细胞目的基因的转录表达。结果限制性酶切、PCR及测序鉴定证实LMP2A正确插入逆转录病毒表达载体；筛选获得稳定产毒的抗性细胞克隆；收获病毒的滴度为3．2×10^7CFu／L，且重组腺病毒在PT67细胞能有效转录。结论携带LMP2A基因的重组逆转录病毒表达载体pMSCVpuro-2A构建成功，转染PT67细胞后包装出重组逆转录病毒，进而筛选获得了能转录表达LMP2A的产毒细胞系PT67-LMP2A。     

小鼠A20RS样细胞模型的初步建立

目的：研究EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)转染小鼠B淋巴瘤细胞A20能否诱导出霍奇金淋巴瘤H／R-S样细胞．方法：采用RT-PCR方法获得LMP1全外显子片段，使之克隆到真核表达载体PLXSN中，限制性酶切、PCR扩增和测序鉴定重组载体；运用脂质体介导转染技术，将LMP1的真核表达重组质粒和空载体质粒导入．420细胞．结果：扩增的LMP1cDNA长度为1．1kb，测序结果与已知序列吻合，重组真核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子；经G418筛选获得稳定整合了LMP1和空载体的亚克隆细胞，Western Blot印迹鉴定PLXSN-LMP1组有LMP1蛋白的表达，出现了H／R—S样细胞形态改变．结论：建立了小鼠A20RS样细胞模型，为下一步建立霍奇金淋巴瘤动物模型，研究其发病机制奠定了基础．     

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体，并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法：用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后，克隆到毕氏酵母载体PICZαA中，构建重组表达质粒pPICαA—LMP2A。pICZαA—LMP2A经SAC Ⅰ酶切线性化，采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115，经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株，用PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS—PAGE电泳和westem—b10tting分析。结果：重组质粒pPICZαA—LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS—PAGE电泳和west-em-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54Kda，与预计值相同。结论：构建了LMP2A毕氏酵母表达载体，并在酵母细胞中成功表达。     

EB病毒LMP1 C端原核表达质粒的构建

目的 通过巢式PCR技术扩增EB病毒LMP1 C端,并构建其原核表达重组质粒,经诱导获得EB病毒LMP1C端蛋白.方法 用巢式PCR技术,从B95-8细胞中扩增EBV-LMP1 exon c DNA,克隆至pET-32a载体,转化入原核表达菌BL21,IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western blot对表达产物进行鉴定.结果 巢式PCR扩增的LMP1exon c DNA长度为801 bp,测序结果与LMP1 C端cDNA序列吻合,诱导pET-32a-LMP1c重组原核表达菌株获得大小约48×103的LMP1 C端融合蛋白,Western blot表明重组蛋白能与LMP1单克隆抗体特异结合.结论 通过巢式PCR成功构建了原核表达载体,获得的EB病毒LMP1 C端融合蛋白为制备国产LMP1单克隆抗体,研究LMP1致瘤机制奠定了基础.     

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因，研究其基因工程疫苗，方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出EBV B95．8株LMP2A全部编码蛋白的基因，并克隆至载体pGEM-T中，通过α－插入失活，PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒，采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸 序列。结果：克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA，测序结果与EB病毒B95．8原型株LMP2AcDNA作同源比较，完全一致，结论：本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。     

LMP1基因重组慢病毒载体的构建及体外表达

目的 构建EB病毒潜伏膜蛋白Ⅰ(LMP1)基因重组慢病毒载体,并检测其在体外的表达.方法 采用DNA重组技术,将LMP1基因克隆到带绿色荧光蛋白的慢病毒表达载体质粒pCDF中,筛选阳性克隆,经限制性酶切、PCR扩增和DNA测序鉴定重组载体.以脂质体介导法将慢病毒包装系统的包装质粒pFIV-34N、包膜质粒pVSV-G和带目的 基因的质粒pCDF-LMP1共同转染到包装细胞293FT细胞内包装病毒,荧光显微镜观察包装细胞报告基因的表达情况,收集病毒上清,浓缩鉴定,测定重组病毒的滴度.将重组慢病毒转染小鼠B淋巴瘤细胞系A20,RT-PCR和Westernblotting检测LMP1的表达.结果 重组慢病毒表达载体质粒经限制性酶切和DNA测序分析证实LMP1基因准确克隆入pCDF的多克隆位点,LMP1序列与GenBank中的数据完全一致.荧光显微镜下观察可见293FT细胞的细胞浆与细胞膜有大量的绿色荧光,重组慢病毒浓缩后滴度为107Tu/ml,慢病毒转染A20细胞的效率>90%.RT-PCR和Westernblotting检测A20细胞内有LMP1的表达.结论 成功构建了LMP1基因重组慢病毒表达载体,慢病毒可高效转染A20细胞,为后期研究EBV致瘤基因LMP1在淋巴瘤发病机制中的作用奠定基础.     

HCV C区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达

目的 观察HCVC区基因在SP2/0细胞及荷瘤小鼠瘤内的表达情况。方法 构建pEF-HCVC重组质粒，转染SP2/0细胞，经G418进行筛选，建立稳定转染pEF-HCVC的SP2/0细胞系，并将转染后的SP2/0细胞接种于BALB/c小鼠皮下产生浆细胞瘤。结果 用斑点杂交方法检测转染后的细胞，有HCVmRNA，免疫组化检测瞬时转染以及稳定转染的SP2/0细胞涂片均发现存在有阳性信号，另外，对瘤组织进行免疫组化检测，发现有HCVC蛋白表达。结论 pEF-HCVC重组质粒可以在SP2/0细胞中长期稳定表达。也可以在BALB/c小鼠浆细胞瘤内表达。     

放射治疗荷肾癌小鼠肿瘤生长抑制与脾细胞及肿瘤组织IL-2，IFN-γ和IL-10的关系

目的：观察放射治疗对BALB／c小鼠肾癌移植瘤的抑瘤作用与细胞因子IL-2,IFN-γ和IL-10表达分泌的关系．方法：建立BALB／c小鼠的Renca肾癌细胞移植瘤放射治疗的模型;采用ELISA试剂盒检测小鼠脾淋巴细胞的细胞因子IL-2,IL-10和IFN-γ分泌水平．RT—PCR法检测肿瘤组织IL-2,IL-10和IFN-γ基因的表达水平．结果：治疗组小鼠肾癌移植瘤生长速度较肿瘤对照组明显减慢．放疗组小鼠脾细胞分泌IL-2,IFN-γ及肿瘤组织IL-2,IFN-γ的表达较肿瘤对照组明显升高,IL-10较肿瘤对照组降低．结论：经放射治疗后,小鼠肿瘤生长受到明显抑制,与放疗引发小鼠脾细胞分泌IL-2,IFN-γ和肿瘤组织IL-2,IFN-γ表达分泌增强,IL-10细胞因子降低有关．     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建与表达(英文)

目的构建EB病毒基因LMP2A、BZLF1重组分泌性表达质粒Ag85B,然后将它成功转化成卡介苗。方法分别用PCR扩增Ag85B信号序列和LMP2A和BZLF1融合基因,将Ag85B信号序列与大肠杆菌-卡介苗穿梭质粒pMV261重组构建获得质粒pMVS。然后将LMP2A和BZLF1融合基因Z2A与质粒pMVS重组获得质粒pMVZ2A,将其电转化卡介苗,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对其结果进行分析。结果信号序列与LMP2A和BZLF1融合基因被正确插入分泌表达载体pMV261。重组质粒经限制性内切酶双酶切、PCR扩增、基因测序等鉴定。蛋白纯化后可得到一条带。结论 pMVZ2A在BCG中能够分泌表达,本研究为获得抗结核杆菌和EB病毒的双价疫苗奠定了基础。     

CCL20重组慢病毒对小鼠肿瘤生长的影响

目的 通过CCL20重组慢病毒整合的间充质干细胞，观察肿瘤原位高表达CCL20能否激发机体的抗肿瘤免疫。方法 构建小鼠CCL20重组慢病毒lenti—mCCL20，体外转导BALB／c小鼠间充质干细胞（mMSCs），杀稻瘟索（blasticidin）筛选出稳定表达mCCL20的混合克隆，命名为lenti—mCCL20-mMSCs，与CT26混合后皮下接种至同系BALB／c小鼠，设lenti-null—mMSCs与CT26混合接种、mMSCs与CT26混合接种、CT26单独接种为对照，观察肿瘤生长情况。结果 构建了重组慢病毒lenti—mCCL20，体外转导BALB／c小鼠MSCs，获得lenti—mCCL20-mMSCs，动物实验发现CCL20瘤内表达增加肿瘤内淋巴细胞的浸润，但促进肿瘤生长。结论 CCL20瘤内表达增加肿瘤内淋巴细胞的浸润，促进肿瘤生长，机制有待进一步研究。     

Induction of T-cell immunity against Epstein-Barr virus-associated tumors by means of adenovirally transduced dendritic cells

Background Dendritic cells (DCs) are the most powerful antigen-presenting cells to induce specific T-cell immunity, which plays an important role in the body‘s anti-tumor responses. In this study, we assessed the feasibility and efficacy of inducing T-cell immunity against Epstein-Barr virus (EBV)- associated tumors in vivo using dendritic cells transfected with EBV latent membrane 2A (LMP2A) recombinant adenovirus.Methods Cytokine-activated bone marrow-derived DCs transfected with EBV LMP2A recombin antadenovirus were infused into BALB/c mice. Splenic cytotoxic T-cell responses were evaluated by cytotoxicity and interferon-γ production assays, in vivo immune protection was then assessed in the mice tumor models implanted with tumor cells expressing EBV LMP2A. Results DCs transfected with EBV LMP2A recombinant adenovirus could strongly induce EBV LMP2A-specific cytotoxic T-cell responses and upregulate interferon-y production in vivo. Vaccination using these DCs led to prolongation of overall survival rates in the mice tumor models and retarded tumor growth.Conclusions The results suggest that DCs transfected with EBV LMP2A recombinant adenovirus can serve as a feasible and effective tool for eliciting LMP2A-specific cytotoxic T-cell responses against EBV LMP2A in vivo in the treatment of EBV-associated tumors.     

抗EB病毒LMP2A单克隆抗体的制备及免疫学特性分析

目的:利用杂交瘤技术制备抗EB病毒潜伏膜蛋白2A(LMP2A)单克隆抗体并分析其免疫学特性?方法:以LMP第2和第5胞外区表位串联制备的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取免疫后小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,制备抗LMP2A的单克隆抗体?通过ELISA?Western blot?免疫荧光?免疫组化?流式细胞术等方法鉴定单抗的免疫学特性?结果:获得1株稳定并持续分泌抗LMP2A单克隆抗体的稳定杂交瘤细胞株,所分泌的单克隆抗体5C12-C4-A6 能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面的LMP2A蛋白?结论:本文制备了能够特异性识别鼻咽癌细胞膜表面LMP2A蛋白的单克隆抗体,为进一步进行鼻咽癌临床早期诊断和分子靶向治疗奠定了基础?     

EB病毒潜伏膜蛋白LMP2A对人鼻咽癌细胞增殖与迁移特性的影响

目的:制备重组慢病毒载体pLMP2A,并检测其在人鼻咽癌细胞CNE1的表达情况及潜伏膜蛋白2A(latent membrane protein 2A,LMP2A)对人鼻咽癌细胞CNE1增殖?迁移?侵袭的影响?方法:利用DNA重组技术将EB病毒编码的LMP2A基因克隆到慢病毒表达载体plv-GFP中,通过酶切?测序验证,将重组慢病毒载体pLMP2A与包装质粒pdelta-8.91?pVSVG共转染人胚肾上皮细胞株293T,包装重组慢病毒LV-LMP2A,并感染人鼻咽癌细胞CNE1,经单克隆筛选后,用RT-PCR?免疫荧光和Western blot检测LMP2A在人鼻咽癌细胞CNE1的表达,CCK8法检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1增殖的影响,划痕实验?Transwell侵袭实验检测LMP2A对人鼻咽癌细胞CNE1迁移和侵袭的影响?结果:酶切及测序结果表明,成功制备了重组慢病毒载体pLMP2A;RT-PCR?Western blot?免疫荧光结果显示筛选出的细胞克隆能高表达EBV-LMP2A,CCK8结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1增殖,划痕实验结果显示LMP2A能促进人鼻咽癌细胞CNE1迁移,Transwell侵袭实验结果显示LMP2A能提高人鼻咽癌细胞CNE1侵袭能力?结论:成功制备了慢病毒载体pLMP2A,包装的慢病毒能够成功感染人鼻咽癌细胞系CNE1,使LMP2A基因得以高表达,并发现LMP2A能够促进人鼻咽癌细胞株CNE1增殖?迁移?侵袭,为进一步探讨EB病毒在鼻咽癌中的发病机制及基因治疗奠定了基础?     

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究

目的 观察乙肝病毒(hepatitis B virus, HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答, 及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用.方法 将BALB/c小鼠随机分为3组, 于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒( pCMV,对照组2 )各3次.末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性.各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV 细胞作阴性对照.种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率.结果 pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组[(19.64±1.50)%]和pCMV组[(3.45±1.89)%](P＜0.05).荷瘤后10 d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P＜0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异.荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24 d,较两对照组均延迟了13 d,平均生存时间为(31±1) d,较两对照组延长(P＜0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P＜0.05), 两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义.结论 HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护.     

自制扩散匣的免疫隔离作用及匣内异基因瘤细胞的在体生长观察

目的 观察自制细胞扩散匣的免疫隔离作用及匣内异基因瘤细胞的在体生长情况。方法 通过PEG介导制备SP2/0-BALB／c小鼠脾细胞杂交细胞。注入BALB／c小鼠和C57BL／6(B6)小鼠腹腔，观察腹水产生和瘤体形成，了解杂交细胞MHC抗原携带情况。再将含杂交细胞的微孔膜扩散匣分别植入BALB／c和B6小鼠腹腔，观察匣内细胞生存情况。结果 腹腔注射杂交细胞后2个月内，BALB／c小鼠产生血性腹水，或形成瘤体，B6小鼠未见腹水产生和瘤体形成。腹腔植入杂交瘤细胞扩散匣后30d和101d，两组动物体内扩散匣均被大网膜或肠系膜包裹，外壁可见新生血管，匣内形成瘤体，但不能充满整个匣腔。结论 SP2／0细胞与BALB／c小鼠脾细胞融合后可转变为携带BALB／c品系MHC抗原的永生细胞，在异基因宿主(B6小鼠)体内不能存活。自制微孔膜扩散匣能有效起到免疫隔离作用。微孔膜外表面能够形成新的营养血管，支持匣内细胞长期生存与增殖。     

EBV—LMP1反义基因真核表达载体的构建及序列鉴定

目的：构建ＥＢ病毒ＬＰＭ１反义基因的真核表达载体。方法：通过ＰＣＲ方法,扩增ＥＢＶ－ＬＭＰ１基因的第一外显子片段,使之反向克隆到质粒ｐｃＤＮＡ３．１的多克隆位点中。经限制性酶切、ＰＣＲ扩增和测序鉴定重组载体。结果：酶切产物和ＰＣＲ产物的凝胶电泳显示４００ｂｐ左右的目的基因片段,测序结果显示与已知ＬＭＰ１基因序列一致。结论成功构建了ＬＭＰ１反义基因的真核表达载体。     

丙型肝炎病毒E2基因激发小鼠细胞免疫的实验研究

目的 :研究丙型肝炎病毒E2基因接种能否诱导机体产生细胞免疫以及乙型肝炎病毒preS基因对其诱导细胞免疫能力的影响。方法 :以BALB/c小鼠的骨髓瘤细胞株 (SP2 /O)为宿主细胞 ,建立表达丙肝病毒E2蛋白的靶细胞 ,将其注射于E2基因或 preS与E2融合蛋白基因免疫的小鼠腹腔 ,记录小鼠接种瘤细胞后的存活期 ,以小鼠存活期的长短作为反映基因免疫小鼠对HCVE2蛋白细胞免疫的有无或强弱的指标。结果 :靶细胞表达了相对分子质量约为 70 0 0 0的E2蛋白 ,E2基因接种小鼠的存活期长于对照组 ,单独E2基因接种组的存活期显著长于对照组 ,也长于 preS与E2融合蛋白基因免疫组。 结论 :E2基因接种能诱导细胞免疫 ,但与 preS融合后 ,其诱导细胞免疫的能力会降低。     

人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的建立

目的:探讨建立人眼眶横纹肌肉瘤动物模型的方法. 方法:培养人胚胎型横纹肌肉瘤细胞株RD细胞,取对数生长期细胞分别接种于4周龄SCID鼠和60Co照射 (1 Gy) 后1 d 的BALB/c裸小鼠;选用成瘤BALB/c裸小鼠的瘤块移植入另一批4周龄BALB/c裸小鼠胁部皮下(组织块接种法).观察各组动物肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线;肿瘤组织行常规病理H-E染色并镜检. 结果:60Co照射后1 d裸小鼠成瘤时间约6～8周,SCID鼠组约3～4周,组织块接种法移植2周后裸小鼠瘤体较明显,3组动物的成瘤率均为100%;成功绘制出肿瘤生长曲线,肿瘤均呈进行性生长;病理检查示各组移植性横纹肌肉瘤与人体肿瘤标本所见类似.结论:成功建立了裸小鼠和SCID鼠人眼眶横纹肌肉瘤模型,组织块接种法可以缩短BALB/c裸小鼠成瘤时间,为进一步研究人眼眶横纹肌肉瘤奠定了基础.     

RV-HSV-TK/GCV自杀基因系统治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨单纯疱疹病毒胸苷激酶/丙氧鸟苷(HSV-TK/GCV)自杀基因系统对人宫颈癌细胞系Hela体外及体内的杀伤作用及其产生的旁观者效应.方法采用脂质体转染法将GINaTK载体转入包装细胞PA317.取病毒上清液感染人宫颈癌细胞Hela,得到带有HSV-TK基因的Hela/TK细胞,并将其分别用于体外和体内实验.体外实验中,Hela/TK细胞对丙氧鸟苷(GCV)的敏感性和旁观者效应采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定.动物试验中分别在BALB/C小鼠的右腋窝皮下按不同比例注射Hela/TK细胞和Hela细胞,然后给予GCV治疗.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测肿瘤组织中HSV-TK基因的表达情况.结果转染HSV-TK基因的Hela/TK细胞表现出比亲本Hela细胞更强的杀伤肿瘤效应.体外实验结果显示,当Hela/TK细胞数占混合细胞10%时,低浓度(10μg·ml-1)的GCV就可将50%左右的肿瘤细胞杀死.体内实验结果显示,GCV可明显抑制Hela/TK细胞在BALB/C小鼠体内的肿瘤形成.经GCV治疗后,Hela/TK组和混合细胞组肿瘤体积分别较对照组肿瘤体积缩小52.8%和69.4%(均P＜0.001).小鼠的平均生存期也显著延长(P＜0.001).结论逆转录病毒可介导HSV-TK基因转入人宫颈癌细胞Hela并获稳定表达,HSV-TK/GCV自杀基因系统在体内外对宫颈癌细胞均有杀伤作用,且存在明显的旁观者效应.