Bmi-1基因沉默对人视网膜母细胞瘤SO-RB50细胞生长的体外抑制作用

[目的] 探讨体外沉默Bmi-1基因对人视网膜母细胞瘤SO-RB50瘤细胞增殖和凋亡的影响。[方法] 免疫组织化学和RT-PCR分别检测Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。体外化学合成法合成靶向Bmi-1基因的siRNA双链转染培养的人SO-RB50瘤细胞。荧光定量RT-PCR和western-blot分别检测转染Bmi-1 siRNA后的人SO-RB50瘤细胞中Bmi-1 mRNA和蛋白水平的变化。MTT法测定Bmi-1基因干扰后SO-RB50瘤细胞增殖情况。流式细胞仪检测Bmi-1 siRNA对人SO-RB50瘤细胞凋亡的影响。[结果] 免疫组化和RT-PCR显示Bmi-1基因在人视网膜母细胞瘤瘤组织和SO-RB50瘤细胞中表达。人SO-RB50瘤细胞经Bmi-1沉默处理后,与阴性对照组相比,Bmi-1在mRNA和蛋白水平抑制率分别为（83.9±3.2）%和（82.8±1.1）%。MTT结果显示干扰组细胞在第3天增殖抑制作用最明显,抑制率达（52.5±1.9）%。干扰组人SO-RB50瘤细胞凋亡率为（20.67±1.1）%,阴性组细胞凋亡率为（1.9±0.2）%,两者有统计学差异。[结论] Bmi-1特异性siRNA能显著抑制人SO-RB50瘤细胞 Bmi-1基因的表达,抑制细胞生长,可能通过促进瘤细胞凋亡而起作用,Bmi-1基因可能为RB治疗的新靶点。     

DNA甲基转移酶3b对肝癌细胞系中细胞周期素D1基因的表达和启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶3b(DNMT3b)在人肝癌细胞系(SMMC7721)中对细胞周期素D1(cylin D1)表达及其启动子甲基化水平的影响,并进一步探讨DNMT3b的作用.方法 用小分子干扰RNA(siRNA)技术抑制DNMT3b在SMMC7721细胞系中的表达(实验组),另设转染对照siRNA的对照组,及未加任何处理因素的正常组.用蛋白质印迹检测转染前后DNMT3b及cylin D1蛋白的表达.用噻唑盐(MTT)法检测其生长增殖的变化,并应用甲基化特异性PCR(MSP)技术分别检测实验、对照两组细胞中cylin D1基因启动子区的甲基化状况.结果 DNMT3b siRNA 转染组SMMC7721的生存率(53.7%)与对照组、正常组相比明显降低(P=0.01).蛋白质印迹结果 显示DNMT3b表达水平明显低于对照组和正常组,cylin D1蛋白的表达也低于对照组和正常组.两组中cylin D1启动子区甲基化状态无差异,均未发生甲基化.结论 DNMT3b可以调节cyclinD1的表达,而不改变基因的甲基化状态,可能发挥了转录调控因子的作用.     

siRNAi沉默DNMT1基因对肺癌细胞WIF-1启动子甲基化的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶(DNMT1)siRNAi对人肺癌A549细胞内抑癌基因wnt抑制因子-1(WIF-1)基因启动子高甲基化的影响.方法 利用pSilencer 4.1-CMV neo载体,通过siRNAi表达载体法制备DNMT1 siRNAi.将DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞,采用RT-PCR和Western blot检测观察转染前后肺癌A549细胞DNMT1内DNMT1基因的表达改变,并利用甲基化PCR,直接测序法检测WIF-1基因启动子甲基化水平.结果 构建的DNMT1 siRNAi转染肺癌A549细胞后,明显抑制DNMT1基因的表达,mRNA表达下降75%,蛋白表达下调82%;同时,WIF-1基因启动子序列较转染前甲基化水平明显降低.结论 靶向DNMT1的siRNAi可明显下调靶基因DNMT1的表达,并逆转WIF-1基因启动子高甲基化水平.     

雷公藤甲素对乳腺癌细胞P53、P73基因甲基化的影响以及对细胞增殖的抑制作用

摘要 目的：研究雷公藤甲素（triptolide,TP）对人乳腺癌MCF-7细胞系增殖的影响及其与P53、P73基因表达和甲基化状态的关系。方法：用不同浓度（10、20、40ng/ml）TP处理MCF-7细胞,采用MTT法检测TP对MCF-7细胞增殖的作用;RT-PCR检测MCF-7细胞甲基转移酶1（DNMT1）、DNMT3a、DNMT3b mRNA的表达;甲基特异性PCR检测TP对MCF-7细胞P53/P73基因甲基化的影响; 蛋白质印迹分析检测MCF-7细胞中P53/P73蛋白的表达。结果：TP剂量依赖性地抑制MCF-7细胞的增殖（P<0.05, P<0.01）,其半数抑制浓度（IC50）约为20ng/ml（P<0.01）,高浓度（40ng/ml）时抑制率达（70.13.52）%。TP可明显抑制MCF-7细胞中DNMT1、DNMT3a、DNMT3b mRNA（P<0.05,P<0.01）的表达。TP处理MCF-7细胞后P53启动子区的甲基化降低,TP(20ng/ml)处理后P53 mRNA的表达升高,而在高浓度(40ng/ml) TP作用下表达明显上调(P<0.0501);TP处理MCF-7细胞后P73基因启动子区的甲基化则明显降低,并呈剂量依赖性,且TP(20ng10ng/ml)处理后P73 mRNA的表达亦明显增强(P<0.0105) ,并呈剂量依赖性。蛋白质印迹分析检测TP(20ng/ml)处理MCF-7细胞后,P53、P73蛋白的表达均增强。结论：TP可通过抑制甲基转移酶活性、抑制P53特别是P73基因启动子区甲基化,促进P53/P73的表达,从而抑制MCF-7细胞的增殖。     

胃癌细胞中BNIP3基因CpG岛甲基化及其调控作用

目的观察胃癌细胞株MKN1中BNIP3基因启动子区的甲基化状态,探讨DNA甲基化调控BNIP3表达的机制。方法应用亚硫酸氢盐修饰后克隆测序法检测MKN1细胞中BNIP3基因启动子区的甲基化状态,应用甲基化抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)处理MKN1细胞,观察给药前后BNIP3 m RNA表达及启动子区Cp G岛甲基化状态的改变。应用染色质免疫沉淀技术检测BNIP3基因与DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的结合。结果 MKN1细胞中BNIP3基因启动子区呈高甲基化状态。应用5-Aza-Cd R处理细胞后,药物处理组(5-Aza-Cd R浓度为10μmol/L)和对照组甲基化率和BNIP3 m RNA表达的差异均有统计学意义(P<0.05)。5-Aza-Cd R抑制MKN1细胞中DNMT1与BNIP3基因的结合。结论 MKN1细胞中BNIP3基因表达受启动子区Cp G岛甲基化调控,DNA甲基化的发生与DNMT1和BNIP3基因结合有关。     

靶向抑制 DNMT1对人脑胶质瘤细胞增殖的影响

目的：应用靶向 DNA 甲基转移酶1（DNMT1）基因的小干扰 RNA（siRNA）重组质粒来转染体外培养的人脑胶质瘤细胞,观察其对胶质瘤细胞增殖活性的影响。方法实验组予以 siRNA-DNMT1序列进行转染,对照组仅予以 siRNA-阴性对照序列。应用 qRT-PCR 分析 DNMT1基因表达变化, Western blot 法分析 DNMT1、PCNA 和 Cyclin D1蛋白表达变化,MTT 法检测细胞增殖生长能力,细胞克隆法分析细胞增殖克隆形成能力。结果与对照组比较,qRT-PCR 结果表明实验组 DNMT1 mRNA 表达明显减少（ P <0.01）;Western blot 法表明实验组 DNMT1、PCNA 和 Cyclin D1蛋白表达水平明显降低（P <0.01）;MTT 法检测表明实验组中活细胞数明显低于对照组（P <0.05）;细胞克隆法表明实验组细胞的增殖克隆形成能力明显低于对照组（ P <0.01）。结论靶向 DNMT1基因的 siRNA 重组质粒可减少人脑胶质瘤细胞内 DNMT1基因的表达,从而抑制胶质瘤细胞的增殖。     

反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体联合转染对人胆管癌细胞增殖和凋亡的影响

目的观察联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因真核表达载体对人胆管癌细胞株QBC-939的增殖能力和细胞凋亡的影响。方法分别构建反义DNMT1基因和反义DNMT3b基因真核表达载体,脂质体介导法将二者先后转染入QBC-939,经G418筛选和荧光细胞克隆挑选得到稳定转染细胞株,并用Western blot检测转染前后的蛋白表达变化;用MTT法和软琼脂克隆形成试验观察各组细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞生长周期及凋亡率的变化。结果Western blot检测证实转染反义基因能使相应蛋白表达水平降低;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因能影响QBC-939的生长曲线,使细胞增殖减慢,并以前者为甚;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1基因的细胞克隆形成率分别为(6.78±0.89)%和(14.86±2.13)%,明显低于未转染组;联合转染反义DNMT1、DNMT3b基因和单独转染反义DNMT1能影响QBC-939的细胞周期,使之阻滞于G1期,细胞凋亡率从(1.63±0.27)%分别增加到(18.47±1.46)%和(6.19±0.78)%;在上述效应检测中,单独转染反义DNMT3b基因实验组对QBC-939细胞的生长无明显影响。结论通过联合转染反义DNMT1和DNMT3b基因真核表达载体,能抑制胆管癌细胞的生长和增殖,并促进凋亡的发生,其效果明显优于单独转染DNMT1反义基因;在DNA甲基化的过程中,DNMT1起着主要的作用,DNMT3b扮演着协同的角色,二者通过甲基化途径对胆管癌的发生发挥作用。     

miRNA-143通过DNMT3a介导血管平滑肌细胞增殖作用的研究

目的 探讨miRNA-143(miR-143)和DNMT3a在血管平滑肌细胞增殖中的作用及机制.方法 分别用miR-143的前体和抑制物干预血管平滑肌细胞(VSMCs),MTT法检测VSMCs增殖情况,qRT-PCR法检测miR-143和DNMT3a的表达,Westem blot法检测DNMT3a的蛋白表达,巢式降落式特异性甲基化PCR法分析miR-143启动子区的甲基化状态,双荧光素酶报告基因检测系统分析荧光素酶活性.结果 miR-143的前体干预VSMCs后,细胞的增殖活性显著下降,DNMT3a mRNA和蛋白表达均降低,而miR-143的抑制物作用后细胞增殖活性明显增强,DNMT3a表达增加;转染miR-143前体后,荧光素酶活性减弱,而用miR-143抑制物作用细胞后,荧光素酶活性明显增强(P＜0.01);干扰DNMT3a后,miR-143的表达增加,但miR-143启动子区甲基化程度降低.结论 miR-143和DNMT3a相互调控可能是VSMCs增殖的重要机制.     

人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系

目的:探讨人胃癌细胞株CDX2基因表达与其启动子区甲基化的关系.方法:不同浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞株,甲基化特异性PCR(MSP)检测用药前后CDX2启动子甲基化状态;实时荧光定量RT-PCR和Western Blot分别检测CDX2和DNMT1 mRNA和蛋白表达.结果:MKN45细胞株CDX2基因启动子区域高甲基化,CDX2 mRNA表达极低,蛋白不表达;经3种浓度5-aza-CdR处理MKN45细胞72 h后,细胞中CDX2 mRNA和蛋白表达均出现上调,而DNMT1表达出现下调.结论:CDX2基因表达下调与其启动子CpG岛高甲基化有关,DNMT1可能参与该过程的调节.     

linc00152通过调控DNMT3A和DNMT3B促进人宫颈癌细胞生长与侵袭

探讨linc00152在宫颈癌中的生物学功能及其调控机制。运用qRT-PCR检测人宫颈癌细胞与正常宫颈上皮细胞中linc00152的表达;转染sh-linc00152、si-DNMT3A和si-DNMT3B于HeLa细胞以敲低细胞中linc00152、DNMT3A和DNMT3B的表达水平,采用qRT-PCR与Western blot法检测转染效率;采用Western blot法检测sh-linc00152对甲基化转移酶(DNMT)3A和3B蛋白表达水平的影响;采用MTT、Transwell侵袭实验检测sh-linc00152、si-DNMT3A以及si-DNMT3B对人宫颈癌HeLa细胞增殖与侵袭的影响。结果显示,linc00152在宫颈癌细胞中的表达水平明显高于正常宫颈上皮细胞(P<0.01);在HeLa细胞中,sh-linc00152组DNMT3A和DNMT3B蛋白表达水平明显低于sh-control组;sh-linc00152组、si-DNMT3A以及si-DNMT3B组HeLa细胞的存活率及穿过基质胶的HeLa细胞数量均明显低于各自对照组。linc00152可能通过调控DNMT3A和DNMT3B信号通路促进人宫颈癌细胞生长与侵袭。     

三氧化二砷诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡的实验研究

目的:探讨三氧化二砷体外诱导视网膜母细胞瘤细胞凋亡的作用及其可能的机制. 方法:梯度浓度三氧化二砷处理视网膜母细胞瘤细胞系HXO-RB44,MTT法观察增殖的变化,AO/EB染色法、Annexin V PI法流式细胞仪检测细胞凋亡.活性比色法检测caspase-3活性变化,Western 免疫印迹法测定bcl-2和bax蛋白的表达. 结果:三氧化二砷处理后的HXO-RB44细胞增殖抑制,抑制率呈剂量时间依赖性;其细胞凋亡率显著增加;caspase-3活性增加,bcl-2/bax的比值下调. 结论:三氧化二砷在体外可通过诱导HXO-RB44细胞凋亡达到抑制其增殖的作用;其诱导凋亡的作用可能与激活caspase-3和下调bcl-2/bax比值有关.     

Effects on Biological Behavior of Bladder Carcinoma T24 Cells via Silencing DNMT1 and/or DNMT3b with shRNA In Vitro

In this study,RNA interference technique was employed to silence the expression of DNMT1 and/or DNMT3b in human bladder cancer T24 cells.The expression levels of their mRNA and protein were greatly decreased by up to 75% and 65% respectively after T24 cells were transfected with lipofectamine2000 for 72 h,indicating RNA interference is an effective tool in gene knockdown.Proliferation and apoptosis of T24 cells were detected by MTT,and annexin-V-FITC and propidium iodide staining flow cytometry,respectively.It was found that loss of the DNMT1 or DNMT3b expression could inhibit the cell growth and promote the cell apoptosis to some extent.However,combined treatment with shRNA targeting both DNMT1 and DNMT3b mRNA could ob-viously enhance the above effects.It was concluded that simultaneously silencing both genes could result in strong suppressing effect on tumor proliferation and promoting ceil apoptosis than separate use,suggesting combined use of DNMT1 and DNMT3b can achieve a synergistic effect in the CpG island methylation in human bladder tumorigenesis.     

DNMT3B通过Hippo信号通路促进肝癌细胞的增殖与侵袭

目的 探索DNMT3B 对肝癌细胞的增殖与侵袭的影响。方法 收集2008年5月~2013年5月在重庆医科大学附二院确诊的175例肝癌患者并制作成组织芯片,分析DNMT3B蛋白表达水平的差异与患者的预后情况及患者肿瘤无瘤生存率与肿瘤特异性生存率的关系。使用单因数与多因素Cox回归分析DNMT3B 的表达对肝癌患者预后的影响。使用小干扰RNA（siRNA） 与慢病毒过表达干扰DNMT3B 的表达,利用CCK-8及EDU染色检测肝癌细胞增殖情况,对细胞进行Transwell 实验检测细胞迁移侵袭能力分析。结果 免疫组化显示DNMT3B 蛋白在肝癌中的表达率（67.4%）高于配对癌旁组织的表达率（41.1%）。DNMT3B 的高表达与肿瘤大小（P=0.001）、血管侵犯（P=0.004）、肝内转移（P=0.018）密切相关。DNMT3B 高表达患者其肿瘤无瘤生存率与肿瘤特异性生存率低于DNMT3B 低表达患者（P<0.005）。沉默DNMT3B 显著抑制Huh-7 细胞增殖,Transwell 实验检测结果表明,与对照组相比沉默DNMT3B 抑制Huh-7 细胞的迁移与侵袭能力。Western blot 检测显示,沉默DNMT3B 的表达升高了LATS1 的表达水平,降低了YAP1 的表达,激活了Hippo 信号通路。同时,甲基化特异性PCR显示LATS1 的甲基化水平降低。结论 肝癌中DNMT3B的表达高于癌旁组织,并且DNMT3B 的高表达与患者的低生存率密切相关。沉默DNMT3B 抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力。DNMT3B 主要通过甲基化LATS1 并抑制其表达,促进癌基因YAP1的表达进而抑制Hippo信号通路的抑癌作用,从而促进肝癌恶性发展。