哮喘患儿外周血树突状细胞共刺激分子表达研究

目的　探讨小儿哮喘发作时外周血树突状细胞 (DC)表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞 (Na veTcells)的作用 ,为进一步研究小儿哮喘的发病机制及治疗提供新的思路。方法　以Thomas法分离、培养并诱导哮喘患儿和健康儿童外周血DC细胞 ,流式细胞仪 (fluorescentactivatedcellsorter,FACS)检测DC表面协同刺激分子CD4 0、CD80、CD86和HLA DR的表达 ,以及其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的作用。结果　哮喘患儿外周血DC表面CD86和HLA DR的表达较对照组明显升高 (t分别 =3 .3 0 4、9.4 81;P分别 <0 .0 1、0 .0 0 1) ,而CD4 0则显著降低 (t=5 .65 9,P <0 .0 0 1) ;其激发同种异体T淋巴细胞和脐带血幼稚T淋巴细胞的能力较对照组明显增强 (P <0 .0 1～ 0 .0 0 1)。结论　哮喘患儿可通过其DC表面差异表达CD4 0、CD86和HLA DR等协同刺激分子 ,从而使其激发T淋巴细胞的作用增强。所以DC在小儿哮喘发作时起重要作用。     

细菌脂多糖对人外周血单核细胞来源的树突状细胞发育和功能的影响

目的 :探讨细菌脂多糖 (LPS)对正常成人外周血单核细胞来源的树突状细胞 (Dendritic cell,DC)表面分子表达及免疫功能的影响。方法 :分离正常人 (n=5 )外周血单个核细胞 (PBMC)以 GM-CSF、IL-4联合诱生 DC,实验组在培养的第 2天加入LPS,正常对照组不加。于第 4、8天 FACS检测 DC表面分子 CD1a、CD14、CD83、CD80、HL A-DR的表达。同期检测 DC的增殖和刺激同种异体 T淋巴细胞的增殖情况。结果 :经 LPS刺激后 ,正常人 DC早期、晚期表面分子 CD1a、CD83、CD80表达增高 ,CD14表达降低 (P<0 .0 5 )。DC数量的增加及刺激同种异体 T细胞能力明显增强。结论 :GM-SF、IL-4和 L PS联合刺激能促进正常人 DC的成熟和免疫功能的提高     

类风湿关节炎外周血和关节液树突状细胞的膜分子表达及功能研究

目的研究类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）患者树突状细胞（dendritic cell,DC）的膜分子表达水平和功能的变化,探讨DC在RA发病机制中的作用。方法应用流式细胞术、混合淋巴细胞培养测定诱导DC细胞表面分子表达、对同种异体T细胞功能情况,诱导成熟后DC表面分子表达与临床活动及预后相关指标ESR、CRP、RF、Stoke指数的相关性。结果RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD80、HLA—DR较正常人外周血来源DC增高（P〈0．05）,RA关节液来源DC较RA外周血来源DC表达CD83、CD209、CD86、CD80明显增高（P〈0．05）。RA关节液组较RA和正常人外周血DC对同种异体T细胞的刺激明显增强。RA患者外周血诱导成熟DC表型CD83、CD209与stoke评分指数呈正相关。结论提示RA时关节内免疫反应可能与局部DC分化、成熟能力增强有关,后者可通过激活T细胞引起自身免疫反应,造成滑膜组织损伤。RA患者DC表面共刺激分子表达水平的增高可能与患者免疫亢进及所致的免疫损伤有关。     

rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF共感染增强人外周血单核细胞来源树突状细胞免疫刺激功能

目的探讨rAAV-2-HBsAg(表达乙肝表面抗原的重组腺相关病毒)和rAAV-2-GM-CSF(表达粒细胞/巨嗜细胞-集落刺激因子的重组腺相关病毒)共感染对人外周血单核细胞来源树突状细胞(DC)免疫刺激功能的影响.方法用rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-GM-CSF同时感染新分离的树突状细胞;CytoTox 96 Non-Radioactive Ctoxicity Assay试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞(cTL)反应;混合白细胞反应(MLR)检测DC刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力;流式细胞仪检测DC表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR.结果rAAV-2-HBsAg和rAAV-2-CM-CSF共感染的DC刺激同种异体淋巴细胞增值的能力和激发的自身淋巴细胞的CTL效应增强,CD83表达水平提高.结论内源性表达的GM-CSF能促进DC成熟、增强DC的免疫刺激功能.     

过敏性哮喘患者树突状细胞对原始T细胞活化的影响

目的　探讨过敏性哮喘病人和正常人外周血单个核细胞 (PBMC)来源树突状细胞(DC)表达表面分子 (CD1a、CD83、CD4 0、CD86 )和细胞因子 (IL -1 2 )的差异及其对Th1和Th2型细胞因子平衡的影响。方法　分别取哮喘患者和正常人外周血经Ficoll和不连续密度梯度离心法获取贴壁细胞 ,加入细胞因子 (GM CSF和IL 4)体外培养为不成熟DC(iDC) ,给予LPS刺激使其发育为成熟DC(mDC)。另取脐血同上方法获得非贴壁细胞 ,分别加CD4单抗和CD4 5RA单抗及磁珠分离得到原始T淋巴细胞 ,分别将两组mDC和原始T细胞共培养。使用流式细胞仪 (FACS)检测树突状细胞表面共刺激分子CD1a、CD83、CD4 0、CD86的表达 ,通过ELISA法检测mDC分泌的IL -1 2及T细胞分泌的IFN -γ和IL- 4的含量。结果　 (1 )哮喘组PBMC来源DC表达CD86分子比对照组显著升高(P <0 . 0 1 )。 (2 )哮喘组DC产生IL- 1 2及其亚单位p4 0均较正常对照组显著减少 (P值均 <0 . 0 1 ) ;(3)混合淋巴细胞反应中 ,哮喘组T细胞释放Th1型细胞因子IFN -γ较对照组减少 (P <0 . 0 5 ) ,Th2型细胞因子IL -4较对照组显著增多 (P <0 . 0 1 ) ;(4)哮喘组CD86表达水平与IL 4浓度呈正相关(r=0 5 4 87,P <0 . 0 5 ) ;(5 )哮喘组IL- 1 2水平与IFN -γ水平呈正相关 (r =0 . 75 81 ,P <0 . 0     

梅毒患者外周血单核细胞体外诱导树突状细胞的形态学与功能研究

目的探讨梅毒患者外周血单个核细胞(PBMC)向树突状细胞(DC)分化的形态学与功能特征。方法分别分离健康人(10例,对照组)和梅毒患者(10例,实验组)外周血中PBMC,与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)共同培养。用倒置显微镜观察细胞形态,用流式细胞仪测定细胞表型,同时进行混合淋巴细胞反应(MLR),观察其刺激同种异体未致敏T淋巴细胞增殖的能力。结果梅毒患者PBMC经GM-CSF与IL-4诱导获得的细胞具有典型的DC形态特征。细胞表面的CD80、CD83、CD86及HLA-DR的表达率分别为77.92%、39.34%、75.78%和95.42%。与对照组相比,CD80表达明显增高(P<0.05)、CD86表达明显降低(P<0.05),CD83及HLA-DR的表达与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。MLR结果显示,梅毒患者PBMC诱导分化的DC可以刺激同种异体T细胞增殖。结论经GM-CSF、IL-4刺激后,梅毒患者的PBMC可以诱导分化为具有典型形态特征及抗原呈递功能的DC,DC表型的特征可能影响梅毒患者的细胞免疫状态。     

口腔癌患者外周血树突状细胞的生物学特性

目的:研究口腔癌患者外周血树突状细胞(DC)的形态、表型和功能性变化及其临床意义. 方法: 口腔癌患者(实验组)及正常人(对照组)15例外周血单个核细胞经GM-CSF,IL-4及TNF-α诱导培养, 获取成熟DC, 光镜和电镜观察细胞的形态,流式细胞仪检测细胞表型如CD1a,CD83,CD80,CD86和HLA-DR等分子的表达变化,用噻唑蓝(MTT)法检测DC与自体和同种异体的混合淋巴细胞反应(MLR)中对淋巴细胞增殖的刺激能力. 结果: 正常人及口腔癌患者的外周血单个核细胞经体外7 d诱导培养,均诱导出具有典型形态和表型的DC,其中实验组细胞的CD83,CD1a表达率分别为49.3±9.5和48.1±7.3,与对照组两者表达率62.1±7.9和60.2±6.8相比,差异有统计学意义(P＜0.05),CD86,CD80和HLA-DR的表达率分别为85.5±8.7,83.2±8.1和78.3±5.4,与对照组三者表达率89.2±6.7,87.7±7.2和82.3±4.1相比无明显统计学差异(P＞0.05);实验组DC细胞CD83,CD1a,CD86,CD80和HLA-DR表达的平均荧光指数(MFI)分别为4.80±2.13,3.96±1.15,12.33±6.75,19.63±8.12和39.44±7.9, 均低于对照组,但差异无统计学意义(P＞0.05);口腔癌患者来源的DC在体外具有诱导同种异体和自体外周血T细胞增殖的能力. 结论: 口腔癌患者外周血单核细胞来源可诱导成为具有功能性的成熟DC,该细胞可应用于口腔癌的免疫治疗.     

A23187诱导慢性髓性白血病患者外周血单核细胞转化为树突状细胞的实验研究

目的　探讨钙离子载体A2 3187在体外能否诱导慢性髓性白血病 (CML)患者的外周血单核细胞 (pe ripheralbloodmonocytes,PBMC)向树突状细胞 (dendriticcells,DC)分化及细胞分化后的免疫活性研究。方法　分离初诊CML患者的PBMC ,用含rhGM -CSF和 (或 )A2 3187的培养液培养 4 0h ;高倍显微镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测诱导前后细胞表面HLA -DR ,CD80 ,CD86和CD83分子的表达 ,MTT比色法检测其对混合T淋巴细胞的刺激增殖作用 ,ELISA试剂盒检测上述方法培养的细胞刺激T淋巴细胞前后 ,上清液中IL - 2及γ -INF水平的变化。结果　CML患者的PBMC经A2 3187联合rhGM -CSF共同培养 4 0h ,具有典型的树突状突起 ,高表达HLA -DR ,CD80 ,CD86和CD83分子 ,具有较强刺激混合T淋巴细胞增殖的能力 ,刺激前后的T淋巴细胞培养液上清中 ,IL - 2及γ -INF的水平有明显差别。结论　体外利用A2 3187联合rhGM -CSF在 4 0h内 ,可将CML患者的PBMC诱导成成熟的DC。     

含未甲基化CpG寡脱氧核苷酸对人外周血树突状细胞抗肿瘤作用的影响

目的：研究含未甲基化CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)对人外周血树突状细胞(dendritic cells，DC)分化、成熟及其抗肿瘤作用的影响。方法：分离正常人外周血DC,透射电镜观察CpG ODN刺激组和未刺激组DC的超微结构，流式细胞仪分析其表面HLA-DR、CD86的表达，MTT法检测其对同种异体混合淋巴细胞反应(mixed—lymphocyte reactor，MLR)中T细胞增殖的影响及调节T细胞杀伤肿瘤的能力。结果：与未刺激组相比，CpG ODN刺激组DC表面突起细、长且规则，粗面内质网增多，空泡减少甚至消失；同时DC表面HLA-DR、CD86的表达上调，能明显促进MLR中T细胞的增殖，增强DC调节T细胞杀伤肿瘤活性：结论：CpG ODN可诱导人外周血DC分化成熟，增强DC调节T细胞杀伤肿瘤活性。     

慢性乙型肝炎外周血树突状细胞的功能障碍机制的初步探讨

目的:探讨慢性乙型肝炎者树突状细胞(DCs)的功能状态及机制。方法:以直接荧光法进行表型分析、CCK8法测定DCs对同种异体淋巴细胞的刺激作用、AnnexinV/FITC法测定细胞凋亡率进行分析。结果:慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞经诱导分化形成的DCs,与正常人相比,表达协同刺激分子CD80、CD86水平均较低;刺激同种异体淋巴细胞增殖能力也低于正常人;DCs凋亡率明显增高。结论:慢性乙型肝炎患者外周血的DCs免疫功能处于抑制状态,而HBV感染导致的DCs凋亡增多可能是引起DCs功能障碍的原因之一。     

α-干扰素联合GM-CSF体外诱导培养脐血树突状细胞及其功能的测定

目的 探讨重组人α-干扰素(rhIFN-α)联合重组人粒-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)体外诱导培养脐血树突状细胞(DCs)的实验方法。方法 人脐血贴壁单个核细胞加入rhIFN-α及rhGM-CSF诱导培养，镜下观察培养细胞形态；流式细胞术检测培养细胞CD83、CD86的表达；MTT法检测诱导培养的DCs体外刺激同种异体T淋巴细胞增殖的活性。结果 人脐血贴壁单个核细胞经rhIFN-α联合rhGM-CSF共同培养后，第7d镜下可见有表面呈树状突起的DCs；细胞免疫表型检测结果示培养细胞有成熟DCs特异性标记CD83及共刺激分子CD86表达；rhIFN-α为600U／ml、rhGM-CSF为2000U／ml时为脐血DCs诱导培养的合适浓度(培养细胞CD83^ CD86^ 细胞比率最高)；以诱导培养7d的脐血细胞(含DCs)作为刺激细胞与同种异体T淋巴细胞(反应细胞)以不同比例混合培养时，DCs均可刺激其增殖，其中以反应细胞：刺激细胞为20：1时最明显。结论 rhIFN-α联合rhGM-CSF细胞因子体外诱导人脐血贴壁单个核细胞，可生成具有典型形态及功能的成熟DCs。     

人外周血来源树突状细胞诱导培养及鉴定的实验研究

目的探讨树突状细胞(DC)体外培养的方法。方法用重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、重组人白细胞介素4、重组人肿瘤坏死因子α等细胞因子自外周血单个核细胞诱导分离DC,流式细胞仪检测其表面标志,四氮唑蓝法测定其刺激同种异体淋巴细胞增殖能力。结果体外培养第10天,大量细胞出现典型的树突状形态;流式细胞仪检测高表达CD80、CD86、CD83、CD40、CD1a、人白细胞DR抗原;在体外能强烈刺激同种异体混合淋巴细胞增殖反应。结论该方法可获得较高纯度典型的DC,为DC的临床免疫治疗提供实验依据。     

三阴乳腺癌细胞-树突状细胞融合疫苗的抗肿瘤免疫效应

目的利用细胞电融合技术制备外周血来源树突状细胞(DC)和三阴乳腺癌细胞(MDA-MB-231)全抗原肿瘤疫苗,观察其特异性抗肿瘤免疫效应。方法从健康人外周血中分离培养DC,利用电融合技术,将DC和三阴乳腺癌细胞融合;荧光显微镜观察融合疫苗的形态;流式细胞仪进行融合疫苗的表型鉴定;ELISA试剂盒检测IL-12、IFN-γ的分泌情况;CCK-8试剂盒测定融合疫苗刺激同源异体T淋巴细胞增殖和细胞毒性效应。结果成功分离培养DC,其表面高表达DC的分子标记CD83、CD11c、CD86、HLA-DR;融合疫苗形态不规则,其表面共同表达DC和三阴乳腺癌的标记分子;T淋巴细胞增殖实验证明融合疫苗有很强的免疫刺激活性;细胞毒性实验证明融合疫苗具有比对照组更强的杀伤肿瘤细胞作用。结论电融合技术成功诱导DC和三阴乳腺癌细胞融合,全抗原融合疫苗体外实验可显著增强抗肿瘤免疫效应。     

Generation of dendritic cells from healthy human peripheral blood]

OBJECTIVE: To get high quality and sufficient numbers of mature dendritic cells (DC) from healthy human peripheral blood. METHODS: Cultured plastic-adherent monocytes were isolated from healthy human peripheral blood by use of granulocyte-monocyte clony-stimulating factor and Interleukin-4 for 7 days without fed with fresh medium and cytokine. RESULTS: A large number of DCs with high purity were generated. These DCs expressed HLA-I, II molecules, Costimulating molecules and adherent molecules highly, showing the characteristics of mature DC. These DCs could stimulate proliferation of allogenic T lymphocytes and had active endocytosis ability which peaked at the third day in culture but decreased afterwards. CONCLUSION: These results provide evidence that CD monocytes isolated from peripheral blood monocytes exhibit dendritic cells characteristics and may facilitate further studies of DC and its clinical application.     

含hTERT片段的重组逆转录病毒感染对树突状细胞功能的影响

目的观察含人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的重组逆转录病毒感染对树突状细胞（DCs）功能的影响。方法ELISA试剂盒检测DCs培养液中IL-12水平；混合白细胞（MLR）反应检测含hTERT片段的重组逆转录病毒感染的DCs（hTERT-DCs）和未感染的DCs（N-DCs）刺激同种异体淋巴细胞增殖能力；流式细胞术检测DCs表面分子CD80、CD83、CD86和HLA-DR的变化；CytoTox96非放射性细胞毒性检测试剂盒检测细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。结果hTERT-DCs和N-DCs在分泌IL-12的水平、刺激同种异体淋巴细胞增殖的能力方面无明显差异；hTERT-DCs的CD83表达水平低于N-DCs，同时，hTERT-DCs激发的CTL对端粒酶阳性的靶细胞杀伤率明显高于端粒酶阴性的靶细胞（P〈0．05）。结论hTERT-DCs尽管有可能阻止DCs自身的成熟，但在活化淋巴细胞、刺激淋巴细胞分化增殖的能力方面并没发生明显改变，并且还能激发hTERT特异性CTL。     

卵巢癌细胞对人树突状细胞成熟及功能的影响

目的 探讨肿瘤组织树突状细胞(DC)功能缺陷机制,研究卵巢癌细胞对DC成熟及功能的影响.方法 体外共培养卵巢癌细胞与DC,观察DC表面标志、吞噬功能及对T淋巴细刺激胞能力的变化,检测免疫相关因子的变化.结果 成人外周血单个核细胞,经rhGM-CSF和rhIL-4诱导生成DC后,表达CD1a(55.0%±10.3%)、CD86(63.5%±11.1%)、HLA-DR(89.4±19.7%)和CD83(9.7%±3.4%),经肿瘤坏死因子(TNF)-α促成熟后,DC成熟标志CD83(39.5%±7.5%)升高.与卵巢癌细胞共培养,DC特异性标志CD1a(19.1%±4.0%)表达减少,成熟特异性标志CD83(44.2%±8.3%)增高且时间提前,对TNF-α诱导无反应.卵巢癌细胞使DC对葡聚糖的吞噬功能下降43.05%,对同种异体T淋巴细胞刺激活性降低56.35%;抑制DC分泌白细胞介素(IL)-12及与IL-12相关的p38磷酸化,使MLR中T细胞分泌干扰素(IFN)-γ降低而IL-10增高.结论 卵巢癌细胞影响DC成熟及功能,DC吞噬能力及抗原处理功能下降,不能有效刺激T淋巴细胞增殖,抑制特异性CTL活化,造成T细胞对肿瘤细胞耐受.可能是肿瘤逃避机体免疫监视作用的机制之一.     

角蛋白19致敏的DC/CTL对MCF-7体外抑瘤作用的实验研究

目的探讨体外经角蛋白19（K19）致敏的树突状细胞（DC）诱导的细胞毒T细胞（CTL）对MCF-7细胞株的抑瘤作用.方法经抗原多肽K19体外致敏外周血来源的DC诱导特异性CTL,流式细胞仪检测DC表面标志及细胞因子分泌,3H-TdR掺入法检测DC诱导CTL增殖,51Cr释放法测定CTL对MCF-7细胞的杀伤活性.结果外周血单个核细胞经体外扩增培养出可见树突状形状的DC,流式细胞仪检测细胞表面CD83、CD40、CD80及CD86高表达,混合淋巴细胞反应观察经K19致敏的DC刺激的自体淋巴细胞增殖明显较对照组高（P＜0.01）.在同一效靶比时,K19致敏的DC诱导的CTL对MCF-7细胞的杀伤率与对照组比较差异有显著性（P＜0.01）,且随着效靶比增加,杀伤作用增强（P＜0.01）.结论DC在体外经K19抗原致敏后,可诱导产生对MCF-7细胞有特异性杀伤作用的效应细胞杀伤MCF-7细胞,且随效靶比增加,杀伤力增强.     

A23187诱导HL-60细胞分化为树突状细胞的研究

目的 探讨用钙离子载体A23187通过钙动员机制使人急性粒细胞性白血病细胞系HL-60细胞迅速分化为树突状细胞(DCs)的方法,为今后临床用DCs进行抗白血病免疫治疗打下基础.方法 将生长良好的HL-60细胞加入不同浓度A23187(45～720 ng/mL)或联用重组人γ-干扰素(rhIFN-γ,1000 U/mL)培养20～96 h,倒置显微镜和扫描电镜观察其形态学特征,流式细胞术检测其免疫表型,混合淋巴细胞反应检测其刺激T淋巴细胞增殖的能力.结果 HL-60细胞加入适量A23187(180 ng/mL)或联合rhIFN-γ(1000 U/mL)诱导20 h后,即可出现细胞表面树状突起,且树突状细胞表面特异性成熟标志抗原CD83、共刺激分子CD80、CD86表达升高;培养48 h,CD83分子表达开始降低;培养72 h,可获得DC的典型形态,CD80、CD86分子表达持续升高.同种异体混合淋巴细胞反应检测经A23187或联用rhIFN-γ诱生的DCs可明显刺激同种异体T淋巴细胞增殖.结论 钙离子载体可诱导HL-60细胞分化为高表达共刺激分子及具有刺激同种异体T淋巴细胞增殖的成熟DCs,钙动员有望成为一种快速获取DCs的有效方法.     

慢性粒细胞白血病患者外周血单个核细胞诱生树突细胞的体外研究

目的 :体外诱生慢性粒细胞白血病 ( CML)患者外周血单个核细胞 ( PBMNCs)为树突细胞( DCs)。方法 :CML患者 PBMNCs在含 GM- CSF、IL- 4、TNF- α的培养液中培养 1 4d,倒置显微镜、电镜下观察细胞形态 ,流式细胞仪检测细胞的表面标志 ,免疫磁珠 ( MACS)富集所诱生的 DCs,用D- FISH、RT- PCR方法检测 DCs的白血病源性。利用 MTT法检测所诱生 DCs刺激 T细胞增殖能力。结果 :所诱生的细胞高表达 CD80 、CD86、CD1a、HLA- DR,电镜下细胞表面有丰富突起 ,细胞浆内有丰富线粒体 ,D- FISH、RT- PCR检测所诱生的 DCs具有 bcr/abl融合基因。CML DCs具有刺激 T细胞增殖能力。结论 :体外利用 CML患者 PBMNCs成功诱导生成了来源于 CML细胞的 DCs( CML DCs)。