New SD rat osteoblasts by modified explant culture in vitro and identification

分别采用传统组织块法、传统酶消化法和优化组织块法进行新生SD大鼠原代成骨细胞体外分离和培养,并对培养出的细胞予以鉴定和比较.优化组织块法可短期内培养出大量纯度高的成骨细胞,具有典型的形态特征和成骨能力,碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原免疫荧光均呈阳性,ALP检测活性可达92%.该法优于其他两种方法,提供了一种切实可行、操作简单的体外原代成骨细胞培养方法.     

改良植块法培养原代成骨细胞

目的:应用改良植块法体外培养大鼠颅骨成骨细胞.方法:将1～3天的新生SD大鼠的颅骨剪碎、接种于培养瓶底,当成骨细胞从组织块中爬出、融合成单层,消化收集成骨细胞,组织块则继续进行培养.将分批次得到的成骨细胞进行MTT,ALP活性以及钙结节计数分析.结果:利用该方法连续分次培养出的成骨细胞.经形态学及ALP鉴定符合成骨细胞的生物学特性,MTT,ALP活性以及钙结节计数无统计学差异.结论:连续植块法培养成骨细胞,操作简便,成功率高,能持续提供细胞,满足实验需求.     

连续外植块法培养SD大鼠成骨细胞及鉴定

目的针对目前体外培养成骨细胞方法的不足,探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法．方法采用SD大鼠胎鼠颅盖骨培养原代成骨细胞,并收集1-3次连续植块进行培养,观察细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶（ALP）活性及钙化的变化．结果连续植块培养收集的1～3次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,细胞内碱性磷酸酶染色及矿化作用均无明显的区别．结论连续植块法用于培养SD大鼠成骨细包具有简便、经济高效的特点．     

连续植块培养原代成骨细胞及其特性的比较

目的: 探讨简便、经济、高效的原代成骨细胞培养方法,并比较其特性.方法: 收集1～4次连续植块培养获得的SD乳鼠颅盖骨原代成骨细胞,观察第1～4次连续植块培养获得的成骨细胞在细胞形态、分裂增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性及骨钙素和BMP-2免疫组织化学表达的变化.结果:连续植块培养收集的1～4次原代成骨细胞,在细胞贴壁、变形、铺展、汇合时间,Gomori改良钙-钴法ALP活性,骨钙素及BMP-2免疫组织化学染色表达上,均没有明显的区别.结论: 连续植块培养可获得与植块培养性状相同的SD乳鼠原代成骨细胞,且细胞数量多,节约经费、时间,操作简便.     

大鼠成骨细胞的原代培养与鉴定

目的:针对目前体外培养成骨细胞方法的不足,建立一种理想的原代培养成骨细胞的方法,为骨替代材料的研究提供成骨细胞。方法:本实验用新生1~2d大鼠颅盖骨,采用多次酶消化法进行细胞体外培养。倒置显微镜观察细胞形态,并对其碱性磷酸酶(ALP)活性及矿化能力进行鉴定。结果:所培养细胞具有体内成骨细胞的生物学行为。结论:本实验原代培养成骨细胞的方法切实可行,为体外研究提供了一种客观而有效的实验手段。     

骨膜成骨细胞分离培养的方法

目的：探讨骨膜成骨细胞分离培养的最佳方法,为骨组织工程的研究提供稳定可靠的种子为源,方法：分别以组织块法,酶消化法和联合法分离培养兔骨成骨细胞,观察原代培养的成功率,细胞生长曲线,成骨细胞的表型特征,结果：组织块法原代培养耗时较长,成功率低,酶消化法细胞增殖快但有大量的杂细胞掺入,联合法提高了组织块成活率,并维持了较高的成骨细胞表型,结论：胶原 时预消化的联合法能够在较短时间内获得高纯度的成骨细胞,效果优于传统的组织块法和酶消化法,有望成为骨组织工程种子细胞培养的常规方法。     

诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 明确大鼠骨髓间充质干细胞(bone mensenchymal stem cells,BMSCs)在体外全骨髓培养条件下的生物学特性及其向成骨细胞分化的能力,探索更为简便有效的BMSCs体外培养方法.方法 提取大鼠原代BMSCs,用酠EM完全培养基和成骨诱导条件培养基体外培养,倒置相差显微镜和HE染色观察细胞形态;台盼蓝活细胞计数绘制细胞生长曲线;ALP检测试剂盒检测ALP含量变化和von Kossa染色检测细胞矿化结节,以判断细胞是否向成骨细胞分化.结果 全骨髓培养法在体外培养的大鼠原代BMSCs贴壁生长,呈梭形或多角形;使用Dex-SaMEM向成骨诱导后的BMSCs具有与成骨细胞在体外培养时相似的特征,倍增时间延长;合成ALP能力显著增强(P<0.05),von Kossa染色出现阳性的棕褐色或棕黑色团块的钙化结节.结论 全骨髓培养法取材方便,经成骨诱导培养的BMSCs表现出成骨细胞的形态特征和生物学特性,该方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.     

兔骨髓间充质干细胞的制备及诱导成骨的实验研究

目的:在体外原代培养兔骨髓间充质干细胞,观察兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性,为用于组织工程学的种子细胞培养提供实验基础。方法:自兔股骨、胫骨取骨髓,分离骨髓间充质干细胞,分别采用常规培养液及含矿化液的培养液两组进行培养,对第3代细胞进行酶动力学法碱性磷酸酶(ALP)活性检测及钙结节茜素红染色,观察细胞在体外长期培养时钙结节形成情况。结果:两组细胞其培养液中的ALP含量不断升高,经过两独立样本t检验,矿化液诱导组第2,6,10天的ALP水平较正常对照组均明显升高(P<0.05)。细胞表现出成骨细胞特性,在体外长期不传代培养时可形成钙结节。结论:兔骨髓间充质干细胞在体外适当的培养条件下,增殖能力很强,可以向成骨细胞方向分化,可作为组织工程学的种子细胞。     

联合培养法进行人牙周膜细胞的比较培养与鉴定

目的 比较消化法与组织块法联合培养与单纯组织块法两种方法获得人牙周膜细胞的成功率及细胞来源鉴定情况.方法 刮取因正畸需要而拔牙的牙周膜,分别进行组织块法和消化法与组织块法联合培养进行人牙周膜细胞的原代培养,并进行波形丝蛋白、角蛋白和碱性磷酸酶(ALP)的检测,以鉴定细胞来源.结果 组织块法在1～2周内有原代细胞游出.在第2或第3天,联合培养法消化游离出来的细胞开始贴壁,消化后的疏松状牙周膜亦可贴壁,且有细胞爬出.组织块法的成功率为27％,联合培养法成功率为70％.ABC免异组化法及ALP鉴定其为非牙龈来源的中胚层细胞.结论 联合培养法可显著提高原代细胞培养的成功率,并在短期内获得大量和相对纯化的实验用细胞.     

体外培养人牙周膜细胞方法的探讨

目的:研究如何提高体外培养人牙周膜细胞(hPDL)的成功率,为简便、快速地获得大量成活率高的hPDL膜细胞,建立体外细胞模型提供一定的实验方法.方法:利用3种不同方法(组织块法、酶消化组织块法、全牙消化法)进行牙周膜细胞的原代培养,用形态学、免疫细胞化学染色等方法鉴定细胞来源;通过生长曲线的测定研究体外细胞生长特性.结果:3种方法获得的细胞形态和生物学行为大致相同;波丝蛋白抗体染色阳性,角蛋白抗体染色阴性.组织块法培养的细胞同源性好,但初代培养时间长;全牙消化法的原代培养成功率高于其他2种方法.结论:通过对牙周膜细胞培养方法的改良,可以显著提高hPDL原代培养的成功率.     

优化酶消化法分离培养及鉴定小鼠前体成骨细胞

目的优化小鼠前体成骨细胞体外分离培养方法,提高分离效率。方法用胶原酶A和分散酶消化出生72h以内的小鼠颅盖骨,分离获得的细胞通过光镜观察、碱性磷酸酶活性测定、Von Kossa染色和茜素红染色方法鉴定。结果获得的细胞活力高且具有典型的成骨特性。结论优化酶消化法是一种方便、高效分离小鼠前体成骨细胞的方法。     

碱性成纤维细胞生长因子影响兔成骨细胞增殖与分化的实验研究

目的：研究不同剂量碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF)对兔成骨细胞DNA合成、碱性磷酸酶活性的影响。以探讨b-FGF在骨折修复过程中的作用,方法：采用酶消化分段收集法分离培养兔成骨细胞,倒置相差显微镜下观察细胞形态,免疫组化法检测细胞ALP和I型胶原,酶动力学方法检测碱性磷酸酶活性,应用流式细胞仪进行细胞DNA含量分析。结果：b-FGF可明显促进兔成骨样细胞的DNA合成,但却抑制其碱性磷酸酶的活性。结论：b-FGF对骨折修复起重要作用。但仍需通过与其它生长因子的协同来完善。     

大黄酸-雌酮对大鼠成骨细胞增殖和分化的作用

【目的】研究大黄酸-雌酮（LC-1）对原代培养大鼠成骨细胞增殖和分化的作用。【方法】酶消化法分离培养SD乳鼠颅盖骨成骨细胞；采取MTT法测定细胞增殖，磷酸苯二钠法（pNPP）测定细胞内外碱性磷酸酶（ALP）活性，研究不同浓度LC-1对成骨细胞增殖和分化能力的影响，并与雌酚酮和大黄酸的作用进行比较。【结果】给药3d后，与空白对照组相比：10^-6mol／L LC-1组、10^-7mol／L LC-1组和10^-7mol／L雌酚酮组明显促进成骨细胞增殖和增加细胞内外ALP活性（P〈0．05）；大黄酸抑制成骨细胞增殖，其中10^-6mol／L组有明显差异（P〈0．05），同时有增加细胞ALP活性的趋势，但无统计学差异。【结论】大黄酸-雌酮在体外可以促进成骨细胞增殖和分化。     

不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律分析

目的探讨不同月龄雌性SD大鼠成骨细胞内雌激素受体表达规律,以此拟描述不同年龄人类女性个体成骨细胞内雌激素受体表达的生理曲线。方法以不同月龄雌性SD大鼠为标本,二次酶消化法收集成骨细胞并培养,倒置相差显微镜观察成骨细胞形态,钙钴法碱性磷酸酶染色、上清液碱性磷酸酶(ALP)及骨钙素(OCN)检测对成骨细胞进行鉴定。结果二次酶消化法获得的成骨细胞,形态呈多边形,碱性磷酸酶染色阳性细胞染色率80%,不同培养时间的成骨细胞和成纤维细胞上清液碱性磷酸酶和骨钙素含量相比较成骨组明显高于成纤维组。结论二次酶消化法可获得较多的成骨细胞,符合成骨细胞的生物学特性,可作为成骨细胞相关研究的细胞来源。     

改良分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞及诱导分化鉴定

目的  采用改良分次酶消化法体外分离培养家兔肌腱干细胞,观察其生物学特性,并进行诱导分化及鉴定。方法  无菌条件下取出家兔髌腱组织,分别运用改良的分次酶消化法和酶消化后低密度稀释接种法进行分离、培养、传代,用倒置相差显微镜观察细胞形态特征并绘制两种方法的生长曲线,通过流式细胞鉴定仪检测肌腱干细胞表面抗原标志物的表达,取P3-P4代肌腱干细胞向成骨细胞、成软骨细胞诱导分化并鉴定。结果  改良的分次酶消化法较酶消化后低密度稀释接种法细胞增殖速度加快,形态均一,杂质细胞少。分离出的肌腱干细胞表面抗原标志CD90、CD44呈阳性,而CD34、CD14呈阴性,证实之前分离的细胞为肌腱干细胞。鉴定出肌腱干细胞具有向成骨细胞和成软骨细胞分化能力。结论  采用改良的分次酶消化法分离培养兔肌腱干细胞简单易行,肌腱干细胞生长及传代速度可观,活性良好,纯度较高。另外,肌腱干细胞的成功分离培养,也为肌腱相关疾病的研究开辟了一条新途径。

     

健骨胶囊含药血清对体外培养成骨细胞增殖和分化作用的影响

[目的]观察健骨胶囊含药血清对体外培养新生大鼠成骨细胞增殖和分化的干预作用。[方法]三天给药法制备健骨胶囊含药血清;酶消化法由新生大鼠头盖骨体外分离和培养成骨细胞,应用MTT法测定增殖率及PNPP法测定ALP活性,来评价健骨胶囊对成骨细胞的增殖和分化的作用。[结果]健骨胶囊能提高体外成骨细胞的增殖率、提高ALP活性。[结论]健骨胶囊含药血清对成骨细胞体外增殖与分化具有刺激作用,为健骨胶囊治疗原发性骨质疏松症提供血清药理学依据。     

小鼠颅骨成骨样细胞体外分离方法的改进

目的：改进成骨样细胞体外分离技术，提高酶消化法的消化效率。方法：连续使用3次I型胶原酶与胰酶的混合消化液和1次胰酶单独静置消化，使用培养瓶作容器，观察连续四次消化的过程和所得细胞数，进行原代和传代培养，并对其生物学特性进行测定。结果：获得大量的细胞，具有体内骨细胞的形态特征，ALP活性，并能在体外发生钙化。结论：该改进方法可有效提高骨样细胞的分离效果。     

新伤续断汤对成骨细胞增殖及骨形态发生蛋白的影响

【目的】探讨新伤续断汤(由骨碎补、续断、地鳖虫等组成)对大鼠成骨细胞增殖以及骨形态发生蛋白2(BMP-2)表达的影响。【方法】采用血清药理学方法制备新伤续断汤含药血清,与α-MEM培养基配成细胞培养液。按酶序列消化法从SD大鼠乳鼠颅骨获取、培养成骨细胞,以碱性磷酸酯酶染色和钙结节染色鉴定细胞。取第3~4代细胞用细胞增殖—毒性(CCK-8)法检测经体积分数为5%、10%、20%新伤续断汤含药血清处理24、48、72 h后的细胞增殖情况。用含体积分数10%的新伤续断汤、续断、骨碎补、空白对照含药血清分别培养细胞,采用微量酶标法检测碱性磷酸酶的活性,酶联免疫吸附法检测BMP-2的表达。【结果】新伤续断汤对成骨细胞的影响呈时间、浓度上的依赖性,其中浓度为10%时效果明显。体积分数10%的新伤续断汤、骨碎补、续断含药血清的成骨细胞碱性磷酸酶活性较空白对照组显著升高,差异有统计学意义(P0.01);7 d时,新伤续断汤组、骨碎补组与空白对照组比较,BMP-2表达显著升高,差异有统计学意义(P0.05)。【结论】新伤续断汤能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性及BMP-2的表达,其中单味药骨碎补可能发挥重要作用,其促进骨折愈合机制可能与提高细胞的成骨功能有关。     

低频正弦交变磁场磁力线方向对体外培养成骨细胞增殖与分化的影响

目的研究磁场强度1.8mT、频率50Hz,正弦交变磁场磁力线方向对体外培养大鼠成骨细胞(ratsosteoblasts,ROB)的影响。方法原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为3组,对照组、平行组和垂直组,平行组和垂直组分别暴露在磁场中,磁场强度1.8mT、频率50Hz、磁力线方向分别与培养皿平行和垂直,30min/次/d。倒置相差显微镜下观察细胞形态;MTT法测定细胞增殖;第3d、6d、9d、12d测定碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性和钙盐沉积量;第10d进行ALP组织化学染色,第12d进行茜素红钙化结节染色;在正弦交变磁场(sinusoidal electromagnetic fields,SEMFs)处理0h、24h、48h和96h后,Real-time RT-PCR检测ALP、骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)和Osterix(OSX)mRNA表达平行变化。结果成骨细胞于磁场暴露处理3～4d后呈漩涡样分布;与对照组相比,磁场组均抑制细胞增殖(P<0.01或P<0.05),其中与垂直组比较平行组显著抑制细胞增殖;与对照组比较,磁场组均促进细胞分化成熟,表现为提高细胞的ALP活性,促进钙盐沉积量,增加钙化结节数量,提高ALP、BMP-2和OSX mRNA表达水平,尤以平行组最为明显。结论 1.8mT、50Hz,磁力线方向与培养皿平行和垂直放置的正弦交变磁场均抑制体外培养成骨细胞的增殖,但能促进其分化成熟,此作用与磁力线方向有关,尤以平行组促分化效果最为明显。