线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠的构建与鉴定

目的：构建线粒体靶向过表达ECSIT转基因小鼠,并对其进行鉴定和心功能分析,建立ECSIT基因相关功能研究模型动物。方法：构建过表达打靶载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,采用电转导方法将线性化打靶载体转入胚胎干细胞（ES细胞）;将含有过表达载体的ES细胞进行囊胚腔注射,并将嵌合囊胚移植至代孕小鼠体内,繁殖嵌合体小鼠。嵌合体小鼠和 C57BL/6J 鼠交配繁殖出杂合子,PCR 筛选阳性过表达小鼠。采用小动物超声分析线粒体靶向过表达ECSIT小鼠的心功能。结果：成功构建了线粒体靶向过表达ECSIT载体pCAG?OTCL?ECSIT?3Xflag?BPA,经PCR鉴定为阳性;完成线粒体靶向过表达ECSIT基因打靶及囊胚注射,经PCR鉴定为阳性;分别提取转基因小鼠心肌组织线粒体和胞浆蛋白,检测发现线粒体特异性过表达ECSIT。8周龄转基因小鼠心功能与同龄野生型小鼠无明显差异。结论：成功构建出线粒体靶向过表达ECSIT小鼠;线粒体过表达ECSIT对8周龄小鼠心功能无明显影响。     

miRNA⁃205过表达载体的构建及其对猪诱导性多能干细胞建系的作用

目的：构建miRNA?205过表达载体并研究miRNA?205对猪诱导多能干细胞系建立的影响。方法：对本实验室已建系的猪primed胚胎干细胞、猪内细胞团细胞及猪胎儿成纤维细胞三者之间进行miRNA表达谱的分析比较,利用PCR扩增miRNA?205前体序列,并将其克隆于基础表达载体pCAGDNA3?hFat1,构建过表达载体pCAG?miR205。使用脂质体转染技术将该载体转染到已转基因修饰的猪胎儿成纤维细胞（含有鼠源干细胞多能性转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c?Myc）。利用干细胞培养液诱导培养建立猪诱导性多能干细胞系。通过实时荧光定量PCR检测转染前后细胞内miRNA?205的表达情况,比较分析miRNA?205对猪诱导性多能干细胞的建系效率的影响。结果：成功构建了pCAG?miR205过表达载体;相较于未转染细胞,转染该载体细胞的miRNA?205表达量显著升高（P＜0.01）;利用干细胞培养液诱导后培养转染组的诱导性多能干细胞克隆长出率高于未转染细胞组。结论：研究结果表明在细胞水平上过表达microRNA?205,可提高猪诱导性多能干细胞建系效率;已构建的miRNA?205过表达载体将有助于在后续研究中建立稳定表达miRNA?205的细胞系,为进一步深入研究miRNA?205在干细胞重编程和多能性维持中的作用机制打下基础。     

青藤碱对PKC⁃α/NF⁃κB⁃p65通路的抑制作用及机制

目的：探讨过表达蛋白激酶C?α（protein kinase C?α,PKC?α）对HEK?293T细胞中核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）磷酸化水平的影响,并检查青藤碱（sinomenine,SIN）对PKC?α/NF?κB?p65信号通路的抑制作用。方法：采用PCR技术扩增大鼠PKC?α基因蛋白质编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到pIRES2?EGFP空载质粒中,构建野生型（wide type,WT）PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?WT,PKC?αWT）;在PKC?αWT质粒的基础上,将PKC?α第25位丙氨酸（A）与368位赖氨酸（K）分别突变为谷氨酸（E）和精氨酸（R）,即构建持续活化（constitutively active,CA）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?A25E,PKC?αCA）和显性负性（dominant negative,DN）突变型PKC?α过表达质粒（pIRES2?PKC?α?K368R,PKC?αDN）。本课题组前期构建的大鼠野生型NF?κB?p65过表达质粒（pIRES2?NF?κB?p65,p65WT）分别与上述各PKC?α过表达质粒共同转染HEK?293T细胞,免疫印迹法检测PKC?α、NF?κB?p65的表达及磷酸化水平。再将上述不同质粒转染HEK?293T细胞,46 h后予50 ng/mL SIN处理细胞2 h,再行免疫印迹实验分析SIN对PKC?α、NF?κB?p65磷酸化的影响。结果：菌液PCR及测序证实,上述PKC?α过表达质粒构建成功。在HEK?293T中过表达PKC?αWT或PKC?αCA可促进NF?κB?p65的磷酸化,且过表达PKC?αCA时尤为显著,而过表达PKC?αDN后NF?κB?p65的磷酸化无明显变化。SIN处理可抑制PKC?αWT、PKC?αCA和PKC?αDN转染组HEK?293T细胞中PKC?α的磷酸化,同时也能抑制过表达PKC?αWT上调的NF?κB?p65磷酸化修饰,但不影响过表达PKC?αCA和PKC?αDN对NF?κB?p65的磷酸化作用。结论：过表达PKC?α可促进HEK?293T细胞中NF?κB?p65的磷酸化,SIN处理HEK?293T细胞后可通过抑制PKC?α的磷酸化下调NF?κB?p65的磷酸化修饰。     

胰岛 β 细胞中 PP2Acα 基因失活小鼠模型的建立与初步表型分析

摘要 目的：建立胰岛 β 细胞特异性失活 PPAcα 基因小鼠模型,对其表型进行初步观察。方法：通过 Ins2-Cre 与 PP2Acαflox/flox 小鼠交配,获得胰岛 ? 细胞特异性失活 PP2Acα 基因小鼠 (PP2Acαflox/fIox:Ins2-Cre)。PCR 和 Western Blot 鉴定 PP2Acα 基因第二外显子敲除小鼠 (KO)。4 月龄时行腹腔注射葡萄糖耐量试验 (IPGTT),以 PP2Acαflox/flox 小鼠为对照。结果：1,PP2Acα 转录本在 KO 小鼠短于对照小鼠。2,KO 小鼠胰岛中 PP2Ac 蛋白水平较对照小鼠显著下降。3,IPGTT 结果显示：4 月龄 KO 小鼠 30 min、60 min、120 min 时血糖明显高于对照小鼠 (P<0.05)。结论：成功建立胰岛 ? 细胞特异性失活 PPAcα 基因小鼠模型,4 月龄 PP2Acαflox/fIox:Ins2-Cre 小鼠糖耐量受损。     

转基因Tomoregulin⁃1低表达加速扩张型心肌病小鼠的病理进程

目的：探究Tomoregulin?1对扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy,DCM）小鼠病理进程的影响。方法：Western blot方法检测Tomoregulin?1在cTnTR141W DCM小鼠模型心脏组织中的表达水平;于2、4和6月龄对同窝阴性（non?transgenic littermates,NTG）小鼠、心脏组织特异Tomoregulin?1低表达小鼠、cTnTR141W DCM小鼠和心脏组织特异Tomoregulin?1低表达×cTnTR141W双转基因（double transgenic,DTG）小鼠进行M型超声心动图和病理组织学表型分析。结果：Tomoregulin?1在cTnTR141W DCM小鼠模型心脏组织中表达显著增高;M型超声心动图显示,与NTG小鼠相比,心脏组织特异Tomoregulin?1低表达小鼠在2、4和6月龄时心脏均呈现显著的室壁变薄、心腔增大和心收缩功能减退的表型;与cTnTR141W DCM模型小鼠相比,DTG小鼠在2、4和6月龄时心脏均呈现显著的室壁变薄的表型,亦呈现心腔增大和心收缩功能减退的趋势;病理组织学显示,与NTG小鼠相比,心脏组织特异Tomoregulin?1低表达小鼠心肌细胞排列紊乱并出现间质纤维化的表型;与cTnTR141W DCM模型小鼠相比,DTG小鼠的心肌细胞排列紊乱和间质纤维化程度更加严重。结论：转基因低表达Tomoregulin?1加速了cTnTR141W DCM小鼠的病理进程,Tomoregulin?1可能是DCM调节的重要修饰基因。     

MiR?31 转基因小鼠的构建及其在组织器官的表达

目的构建稳定过表达的miR?31 转基因小鼠,检测其主要组织器官中miR?31的表达变化情况并对在体miR?31 过表达的应用提供合格的工具鼠?方法使用Gateway cloning 技术构建miR?31过表达载体,使用DNA 显微注射技术将构建好的载体注入受精卵内,随后转移至假孕母鼠内,待其自然生产?将新生小鼠提取尾部DNA,PCR 及琼脂糖凝胶电泳鉴定miR?31 过表达阳性小鼠,筛选阳性小鼠并饲养繁殖?另取阳性小鼠,提取主要组织器官的miRNA 并使用RT?PCR检测其miR?31的表达量?同时对比阳性小鼠和野生型小鼠神经系统中Nestin的表达和神经干细胞的数量?结果成功构建了miR?31 过表达转基因小鼠,并在屏障环境下饲养繁殖至14代以上?各主要组织器官miR?31的表达均升高且稳定表达?阳性小鼠Nestin 的表达和神经干细胞数量均高于野生型小鼠?结论通过使用Gateway cloning技术成功构建了miR?31 过表达转基因小鼠,且在各代小鼠中miR?31的表达稳定,神经系统内的神经干细胞数量多于野生型小鼠,可为进一步研究miR?31过表达后在体内的功能和神经系统疾病的治疗提供良好的工具小鼠?     

乙型肝炎病毒x基因转基因小鼠模型的建立及培育

目的：建立可表达乙型肝炎病毒X蛋白的HBx基因（adr亚型）转基因小鼠模型，以研究x基因的功能。方法：采用基因重组技术构建含有CMV启动子和HBx基因（adr亚型）开放阅读框（ORF）的真核表达载体pcDNA3-HBx。该载体经Sal I限制性内切酶线性化后，琼脂糖电泳回收目的的片段，用原核显微注射法将其注射入雄原核，制备转基因小鼠。复合PCR法在基因组水平筛选HBx基因转基因小鼠founder；免疫组织化学法在蛋白水平检测X蛋白在这些小鼠中的表达情况。结果：成功构建了HBx基因真核表达载体pcDNA3-HBx。经原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，出生并存活了11只新生鼠，经PCR检测后获得5只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(HBx)SMMU。免疫组织化学检测发现5只PCR阳性小鼠的肝细胞质中均有X蛋白的表达。将这5只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，复合PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F4代。结论：本研究成功地产生了稳定遗传HBx基因并表达X蛋白的转基因小鼠C57－TgN（HBx)SMMU，它将有利于体内研究HBx基因在肝细胞癌发生中的作用。     

TNF⁃α预处理MC3T3⁃E1细胞后上调N⁃cadherin并影响骨髓血液生成

目的：研究肿瘤环死因子α（tumor necrosis factor α,TNF?α）处理小鼠前成骨细胞株MC3T3?E1对其血液生成能力的影响及可能机制。方法：Western blot方法检测TNF?α处理MC3T3?E1细胞后,N?cadherin、p?Erk1/2和p?Akt的表达水平;将TNF?α预处理的MC3T3?E1细胞作为饲养层细胞,联合造血生长因子SCF、TPO和Flt3?配体,体外扩增分选的小鼠Sca?1（+）细胞7 d后,检测粒?单系集落形成单位（CFU?GM）、红系形成单位（BFU?E）和前B淋系形成单位（CFU?pre?B）。并检测Erk抑制剂FR180204对MC3T3?E1细胞N?cadherin和p?Erk水平的影响。结果：MC3T3?E1细胞经TNF?α预处理后,N?cadherin和p?Erk的表达上调,p?Akt没有明显变化。饲养层细胞联合造血生长因子体外扩增Sca?1（+）细胞7 d,与对照组比较,TNF?α预处理组中的总CFU、BFU?E及CFU?GM数目下降（P < 0.05）,但CFU?pre?B数目明显升高（P < 0.05）。Erk抑制剂FR180204处理MC3T3?E1细胞可下调Erk的同时上调N?cadherin水平。结论：TNF?α可能通过影响骨髓微环境中造血支持细胞而间接影响血液生成和造血干细胞向各系列的分化;调节成骨细胞Erk1/2的磷酸化和N?cadherin的表达,可能是TNF?α影响骨髓血液生成的机制之一。     

乙型肝炎病毒preS2蛋白在转基因小鼠肝脏中的表达

目的：分析乙型肝炎病毒preS2蛋白在3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠肝脏中的分布及其病理学作用。方法：采用原核显微注射法将质粒pcDNA3.1-preS/S^t注射入小鼠受精卵雄原核，制备转基因小鼠。PCR法在基因组小平筛选3’末端缺失的preS/S基因转基因小鼠首建者（founder）及后代；免疫组织化学法在蛋白水平检测preS2蛋白在这些小鼠中的表达；H－E染色分析转基因小鼠肝组织的病理学变化。结果：以原核显微注射法将目的片段注射入受精卵雄原核后，共出生15只新生小鼠，其中存活7只，经PCR检测后获得2只founder转基因小鼠，命名为C57－TgN(preS/S^t）SMMU。免疫组织化学检测发现转基因小鼠肝细胞质中有preS2蛋白表达，H－E染色发现转基因小鼠肝组织中央静脉周围有淋巴细胞聚集。将这2只转基因小鼠与正常同系异性小鼠交配，进行传代培育，PCR法筛选阳性转基因小鼠，目前已传至F2代。结论：本研究成功建立了稳定遗传3’末端缺失的preS/S基因并表达preS2蛋白的转基因小鼠C57－TgN(preS/S^t)SMMU，它将是体内研究3’末端缺失的preS/S基因的表达产物在体内的生物学作用及其与肝细胞内细胞癌基因的转录激活之间关系的理想动物模型。