NF⁃κB p65调控IRF⁃8基因启动子活性及其启动子结合元件的初步鉴定

目的：探讨大鼠核因子?κB（nuclear factor?κB,NF?κB）p65亚基在细胞内过表达和其活性变化对干扰素调节因子?8（interferon regulatory factor?8,IRF?8）基因启动的影响,并初步筛查IRF?8启动子上可能的p65结合元件。方法：采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术扩增大鼠p65基因蛋白编码区（complete sequence coding,CDS）序列,将其插入到空载pIRES2?EGFP质粒中,构建大鼠野生型（wild type,WT）p65过表达质粒（pIRES2?p65 WT）。在此基础上,将p65第535位丝氨酸（serine,S）突变为天冬氨酸（aspartic,D）或丙氨酸（alanine,A）,分别构建p65持续活化突变型质粒（pIRES2?p65 S535D）和p65显性负性突变型质粒（pIRES2?p65 S535A）。之后应用生物信息学软件预测IRF?8基因启动子区p65的结合元件,并据此构建IRF?8启动子全长（full?length,FL）和3个截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3?IRF?8?FL（-1 892 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?1（-1 360 ~ +174 nt）、pGL3?IRF?8?2（-752 ~ +174 nt）和pGL3?IRF?8?3（-68 ~ +174 nt）。将上述质粒行不同组合共转染人胚肾293T（human embryonic kidney 293T,HEK?293T）细胞,Western blot和荧光素酶实验分别检查p65的表达和IRF?8的启动子活性,并分析IRF?8启动子区可能的p65结合元件。结果：菌液PCR及测序证实上述质粒构建成功。分别将pIRES2?p65 WT、pIRES2?p65 S535D、pIRES2?p65 S535A和pGL3?IRF?8?FL共转染HEK?293T,发现过表达pIRES2?p65 WT或pIRES2?p65 S535D均可明显增加IRF?8启动子活性,且以pIRES2?p65 S535D更为显著;而过表达pIRES2?p65 S535A后,IRF?8启动子活性无明显变化。将pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1~3和pIRES2?p65 S535D共转染HEK?293T后发现,pGL3?IRF?8?3的启动子活性显著低于pGL3?IRF?8?FL、pGL3?IRF?8?1和pGL3?IRF?8?2,提示大鼠IRF?8启动子-752~68 nt区域可能存在p65结合元件。结论：在HEK?293T细胞内过表达野生型或持续活化突变型p65可显著促进IRF?8基因的启动,且p65与IRF?8启动子的结合元件可能位于-752~-68 nt部位。     

Pellino1 SUMO修饰位点突变对TRAF6介导的NF⁃κB信号转导的影响

目的：研究Pellino1蛋白翻译后修饰——小泛素相关修饰物（small ubiquitin?related modifier,SUMO）修饰对肿瘤坏死因子受体相关分子?6（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）介导的核因子κB（nuclear factor κB,NF?κB）信号转导的影响。方法：构建Pellino1 SUMO修饰位点突变的质粒,与TRAF6、泛素（ubiquitin,Ub）质粒共转染至HEK?293细胞中,荧光显微镜观察转染效率,免疫共沉淀的方法检测突变型Pellino1与TRAF6的相互结合作用;同时,检测Pellino1和TRAF6的泛素化修饰水平。采用脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导炎症反应,分提胞浆胞核蛋白,Western blot检测核因子κB的抑制蛋白α（inhibitor of NF?κBα,IκBα）的磷酸化和NF?κB P65的核转位,分析Pellino1蛋白SUMO修饰突变对TRAF6介导的NF?κB信号通路的影响。结果：与野生型Pellino1相比,SUMO修饰突变型Pellino1不仅增加Pellino1的自身泛素化修饰水平,而且可增加其与TRAF6的相互结合作用,并增强TRAF6的泛素化修饰;LPS刺激可增加IκBα的磷酸化和NF?κB P65的核转位,转染使Pellino1 SUMO修饰突变高表达可明显增强LPS诱导的NF?κB信号激活。结论：Pellino1 SUMO修饰突变,可通过增加Pellino1的自身泛素化修饰及其与TRAF6的结合,增强TRAF6的泛素化,最终促进TRAF6介导的NF?κB信号通路的激活。     

Bmi⁃1通过下调NF⁃κB信号通路防治小鼠萎缩性胃炎

目的：明确Bmi?1是否有防治萎缩性胃炎的作用及其机制。方法：针对7周龄Bmi?1基因缺失（Bmi?1 knock out,BKO）纯合子小鼠和同窝野生型（wild type,WT）小鼠,利用组织学切片、免疫组织化学和 Western blot比较分析胃的表型差异。结果：与WT小鼠相比,BKO小鼠表现为胃壁变薄、腺体萎缩和炎症浸润的萎缩性胃炎表型。免疫组化结果显示白细胞介素6（interleukin 6,IL?6）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α,TNF?α）阳性细胞面积和核因子?κB?p65（nuclear factor?κB?p65,NF?κB?p65）阳性细胞数明显增加;Western blot 结果显示IL?6、TNF?α和NF?κB?p65蛋白表达水平明显升高。结论：在小鼠中,Bmi?1可通过下调NF?κB信号通路防治萎缩性胃炎。     

Tristetraprolin通过NF-?B通路抑制肺腺癌细胞自噬

目的研究RNA结合蛋白tristetraprolin在肺腺癌中的表达及抑制自噬作用的分子机制。方法瞬时转染tristetraprolin过 表达质粒,分别在转染tristetraprolin 24、48 及72 h 后采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blot 检测肺腺癌细胞中 tristetraprolin表达及自噬相关分子Beclin1、LC3II/LCI及p62的表达变化。瞬时转染tristetraprolin过表达质粒及加入TNF-α,将 肺腺癌细胞分为空载组、tristetraprolin 组、空载+TNF-α组及tristetraprolin+TNF-α组,应用免疫荧光和Western blot检测NF-ĸB p65、c-rel、p50分子在细胞核中表达情况。共转染tristetraprolin过表达质粒及IκBα-mut质粒,将肺腺癌细胞分为tristetraprolin 空载组、IκBα-mut 空载组、tristetraprolin 组、IκBα-mut 组及tristetraprolin+IκBα-mut 组,采用RT-qPCR 和Western blot 检测 tristetraprolin表达及自噬相关基因表达变化。结果Tristetraprolin在肺腺癌细胞中RNA及蛋白水平表达低（P<0.001）。过表达 tristetraprolin 后,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达均较空载组降低（P<0.001）。同时,过表达 tristetraprolin后,细胞核内的p65及c-rel蛋白表达较空载组及空载+TNF-α组减少（P<0.05）,但p50表达无明显变化（P>0.05）。 过表达tristetraprolin后,p65及c-rel核移位较空载组减少。共转染IκBα突变质粒及tristetraprolin过表达质粒后,NF-κB信号通 路被阻断,自噬相关基因Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ在RNA及蛋白水平表达较tristetraprolin过表达组升高（P<0.05）,NF-ĸB信号 通路被阻断后tristetraprolin对自噬的抑制作用减弱。结论Tristetraprolin在肺腺癌细胞中低表达,过表达tristetraprolin可能通 过抑制NF-ĸB p65及c-rel核移位而抑制肺腺癌细胞自噬。     

真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Asc12的构建及表达

目的 构建真核表达载体pIRES2-AcGFP1-Ascl2,并在真核细胞HEK293T细胞中表达,为今后研究Ascl2基因在Tfh细胞的相关分子机制奠定实验基础.方法 PCR方法扩增健康人外周血单个核细胞中Ascl2基因,连接至pIRES2-AcGFP1质粒的多克隆位点中,构建pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒.通过脂质体转染法对HEK293T细胞进行转染.Realtime-PCR及Westernblot方法分析转染pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒的HEK293T细胞中Ascl2表达情况.结果 经Realtime-PCR及Westernblot方法,证实Ascl2基因能够在HEK293T细胞中正确表达.结论 成功建立表达Ascl2基因的pIRES2-AcGFP1-Ascl2重组质粒,并能在HEK293T细胞中表达,为进一步研究Ascl2在自身免疫性疾病中Tfh细胞的相关机制奠定了实验基础.     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

CDDO⁃Me对缺氧诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化的影响

目的：探索甲基巴多索隆（bardoxolone methyl,CDDO?Me）对缺氧诱导的人肺动脉外膜成纤维细胞（pulmonary artery adventitia fibroblast,PAAF）活化的影响及其相关机制。方法：体外培养人PAAF,随机分为常氧组（21%O2）、缺氧组（1%O2）、缺氧+ CDDO?Me组和常氧+CDDO?Me组。采用CCK?8法检测细胞活力;Transwell实验检测细胞迁移;DCFH?DA荧光探针检测细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）水平,ELISA试剂盒检测细胞内谷胱甘肽（glutathione,GSH）、丙二醛（malondialdehyde,MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）含量以及细胞上清液中转化生长因子（transforming growth factor,TGF）?β1、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor,TNF）?α、白细胞介素（interleukin,IL）?1β表达水平;免疫荧光法观察细胞内α?平滑肌肌动蛋白（α?smooth muscle actin,α?SMA）表达以及核因子κB（nuclear factor kappa?B,NF?κB）p65核转位情况;Western blot检测细胞内α?SMA、Ⅰ型胶原蛋白、波形蛋白表达以及Smad3、p65磷酸化水平。结果：CDDO?Me（62.5、125.0、250.0、500.0 nmol/L）可以浓度依赖性地降低缺氧诱导的PAAF细胞活力的升高,并在250.0 nmol/L和500.0 nmol/L时具有显著抑制作用。CDDO?Me（500.0 nmol/L）可以抑制缺氧诱导的PAAF迁移以及肌成纤维细胞转化,恢复细胞形态,抑制缺氧诱导的PAAF中α?SMA、Ⅰ型胶原蛋白和波形蛋白表达水平的升高。在缺氧条件下,CDDO?Me（500.0 nmol/L）显著降低PAAF中ROS和MDA水平,升高GSH和SOD含量,提高细胞抗氧化应激能力。CDDO?Me（500.0 nmol/L）可以抑制缺氧诱导的PAAF中细胞因子TGF?β1的分泌,抑制TGF?β1/Smad3信号通路的激活。此外,CDDO?Me（500.0 nmol/L）还可以抑制缺氧诱导的PAAF中NF?κB（p65）的核转位及其磷酸化,并抑制其下游炎症因子TNF?α和IL?1β的表达。结论：CDDO?Me可以抑制缺氧诱导的PAAF增殖、迁移以及向肌成纤维细胞转化,提高PAAF抗氧化应激能力,并抑制TGF?β1/Smad3信号通路和NF?κB信号通路。     

兰索拉唑致皮肤炎症的机制研究

目的：通过体内实验和体外实验探索兰索拉唑诱发皮肤炎症的可能机制。方法：体内实验,小鼠连续灌胃给药6个月,通过HE染色和免疫组化评价小鼠皮肤组织损伤情况;体外实验,通过CCK?8测定10~200 μmol/L兰索拉唑孵育24 h和48 h后人永生化角质形成细胞（HaCaT）活力的变化,并用10、20、40 μmol/L的兰索拉唑分别孵育HaCaT 24 h、48 h,Western blot检测HaCaT中磷酸化核因子（NF）?κB蛋白（phospho?NF?κB p65,P?p65）的表达水平,同时检测细胞炎症因子白介素（interleukin,IL）?6、IL?1β的蛋白表达量。此外,兰索拉唑及NF?κB通路抑制剂吡咯烷二硫代甲酸铵（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）单独或联合孵育HaCaT 24 h、48 h后,检测HaCaT中P?p65、IL?6和IL?1β蛋白的表达情况。结果：体内实验结果显示,兰索拉唑可造成小鼠皮肤损伤;体外实验发现,兰索拉唑可降低细胞活力,增加P?p65蛋白的表达,介导NF?κB通路激活,进一步刺激炎症因子IL?6和IL?1β的表达。PDTC可抑制兰索拉唑介导的NF?κB通路的激活,减少炎症因子的表达。结论：兰索拉唑可以促进炎症因子表达继而诱发皮肤损伤,其机制可能与NF?κB信号通路的激活有关。     

TNF⁃α预处理MC3T3⁃E1细胞后上调N⁃cadherin并影响骨髓血液生成

目的：研究肿瘤环死因子α（tumor necrosis factor α,TNF?α）处理小鼠前成骨细胞株MC3T3?E1对其血液生成能力的影响及可能机制。方法：Western blot方法检测TNF?α处理MC3T3?E1细胞后,N?cadherin、p?Erk1/2和p?Akt的表达水平;将TNF?α预处理的MC3T3?E1细胞作为饲养层细胞,联合造血生长因子SCF、TPO和Flt3?配体,体外扩增分选的小鼠Sca?1（+）细胞7 d后,检测粒?单系集落形成单位（CFU?GM）、红系形成单位（BFU?E）和前B淋系形成单位（CFU?pre?B）。并检测Erk抑制剂FR180204对MC3T3?E1细胞N?cadherin和p?Erk水平的影响。结果：MC3T3?E1细胞经TNF?α预处理后,N?cadherin和p?Erk的表达上调,p?Akt没有明显变化。饲养层细胞联合造血生长因子体外扩增Sca?1（+）细胞7 d,与对照组比较,TNF?α预处理组中的总CFU、BFU?E及CFU?GM数目下降（P < 0.05）,但CFU?pre?B数目明显升高（P < 0.05）。Erk抑制剂FR180204处理MC3T3?E1细胞可下调Erk的同时上调N?cadherin水平。结论：TNF?α可能通过影响骨髓微环境中造血支持细胞而间接影响血液生成和造血干细胞向各系列的分化;调节成骨细胞Erk1/2的磷酸化和N?cadherin的表达,可能是TNF?α影响骨髓血液生成的机制之一。     

人p65和IκBα基因真核表达载体的构建及在永生化滑膜细胞中的表达

目的：构建人p65和IκBα基因的真核表达载体并检测其在人永生化滑膜细胞MH7a中的毒达．方法：应用RT—PCR方法从体外培养的HEK293细胞mRNA中扩增出p65和IκBα基因的编码区。克隆至pMD18T载体并测序，然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3．1myc／His（-）A，酶切鉴定正确后以脂质体法瞬时转染MH7a细胞，Western Blot检测p65和IκBα的表达．结果：测序证实PCR扩增得到的p65和IκBα基因编码区序列正确；脂质体法转染MH7a细胞后检测到预期目的蛋白的表达．结论：成功构建了p65和IκBα的真核表达载体并使其在人永生化滑膜细胞中表达．     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板,经PCR获得Hath1-cDNA,将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoⅠ、EcoRⅠ双酶切,酶切产物琼脂糖凝胶电泳,割胶纯化,前者回收1065bp片断,后者回收大片断,再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接,转化感受态DH5α细胞,挑选单克隆,提取质粒,将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体LipofectamineTM2000转染HEK293T细胞,观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1,该质粒能有效地转染HEK293T细胞,目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

重组腺病毒介导siRNA抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达

目的构建重组腺病毒Ad-NF-κB p65-siRNA，并观察其抑制大鼠肝细胞NF-κB p65表达的效果。方法（1）筛选针对大鼠NF-κB p65特异性siRNA靶序列，设计合成其对应的双链DNA，插入到pShuttle—H1中，得到psiRNA—NF-κB p65质粒。将构建好的psiRNA—NF-κB p65质粒与腺病毒骨架载体pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中进行重组，酶切鉴定、293A细胞包装、扩增，得到重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA。（2）将构建好的Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞株BRL，48h后，采用RT-PCR和Western blot检测NF-κB p65表达。结果成功地构建了重组腺病毒Ad—NF-κB p65-siRNA；Ad—NF-κB p65-siRNA转染大鼠肝细胞48h后，NF—κB的mRNA水平下降了81％，细胞内的NF—κB蛋白浓度下降了71％。结论腺病毒介导的RNAi技术体外显著地抑制大鼠肝细胞NF-κB p65的表达。     

人生发中心激酶基因克隆及其转基因细胞的构建

目的克隆人生发中心激酶（GCK）基因,并构建含有该目的基因的pIRES2-EGFP重组质粒载体,获得稳定表达GCK分子的基因转染细胞。方法采用RT-PCR法从pCMV5-GCK质粒载体上克隆GCK基因,通过双酶切（BglⅡ,SalI）装入pIRES2-EGFP质粒载体中,脂质体法共转染HEK293细胞,24 h后加入G418进行筛选,挑选出能稳定表达GCK蛋白的HEK293细胞株。结果构建了用于表达的含GCK基因的pIRES2-EGFP质粒载体,继而经RT-PCR、Western blot检测筛选出稳定表达人GCK蛋白的HEK293转基因细胞。结论构建了含人GCK基因重组pIRES2-EGFP质粒载体和稳定表达人GCK蛋白的细胞株,为该基因功能的后续研究奠定了基础。     

蛋白激酶D1在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用

目的研究蛋白激酶D1（PKD1）在烟曲霉介导的NF-κB信号通路激活及转录活性中的作用,为进一步探讨PKD1在烟曲
霉感染引起的肺曲霉病中的作用及其机制奠定基础。方法首先将GFP、GFP-PKD1表达质粒分别转染人肺腺癌细胞A549和
HEK293细胞中,分别将灭活的烟曲霉分生孢子（1×105 CFU/ml）于不同时间处理上述两组细胞,Western blotting证实PKD1的
过表达,并检测PKD1的磷酸化活性;其次在A549细胞中分别转染GFP-PKD1、siRNA-PKD1并以灭活的烟曲霉分生孢子处理
细胞30 min,分别检测下游NF-κB通路相关信号分子的磷酸化活性;最后,将NF-κB-luc 荧光素酶报告基因及内参照报告质
粒海肾荧光素酶（pRL-SV40）共转染入表达GFP、GFP-PKD1的A549细胞中,两组细胞在有无烟曲霉分生孢子的作用下处理
24 h,收集细胞裂解液,进行双色荧光素酶活性检测。结果Western blotting证实PKD1的过表达时间依赖性地增强烟曲霉刺激
的A549细胞和HEK293 细胞中PKD1的磷酸化活性及NF-κB通路中IКB和p65（pS276）的磷酸化活性,反之,敲低PKD1的表
达则抑制烟曲霉介导的NF-κB通路中IКB和p65（pS276）的磷酸化活性。过表达PKD1明显增加NF-κB-luc荧光素酶的转录激
活活性。结论PKD1可能在烟曲霉刺激的NF-κB通路的激活及转录活性中起重要作用。
     

siRNA阻断NF—κB通路抑制HepG2细胞增殖及NK杀伤抵抗性

目的利用小于扰RNA（siRNA）阻断肝癌细胞HepG2中的NF—κB信号通路,研究其对肝癌细胞增殖活性及NK杀伤敏感性的影响。方法利用NF—κB p65 siRNA转染HepG2细胞,48h后分别进行Western blotting及ELISA检测NF—κB p65蛋白的表达;MTT法检测转染后细胞的增殖变化及对NK-92细胞杀伤敏感性的变化。结果转染NF—κB p65 siRNA后肝癌细胞中NF—κB p65蛋白表达的水平明显下降;MTT检测发现,与对照组相比,NF—κB p65 siRNA能够明显抑制HepG2细胞的增殖活性,同时使其对NK-92细胞介导的杀伤敏感性增加（P〈0．05）。结论siRNA阻断NF—κB通路能够抑制肝癌细胞增殖及对NK细胞杀伤的抵抗性。     

干扰和过表达热休克转录因子2对肠上皮细胞炎症的影响

【摘要】 目的 通过脂质体法干扰和过表达肠上皮细胞的热休克转录因子2（heat shock factor 2,HSF2）,探讨其对肠上皮细胞炎症反应的影响和涉及的信号通路,为溃疡性结肠炎发病机制及诊治靶点提供线索。方法 选取结肠肿瘤上皮细胞Caco 2作为研究材料,采用脂质体法分别转染HSF2 siRNA和pCMV HSF2 FLAG重组质粒,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染前后细胞生理特性的变化;并用脂多糖（LPS）刺激转染组及对照组细胞,Griess Reagent System 测定各组细胞的NO浓度;RT PCR检测细胞炎性酶iNOS、COX 2,炎症因子TNF α、IL 8mRNA转录水平;ELISA检测细胞培养基中TNF α、IL 8含量;Western Blot检测COX 2、IκB、NF κB p65蛋白水平,以及 ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平。结果 MTT法检测结果显示,脂质体法转染入siRNA或重组质粒对细胞活性无显著影响;干扰HSF2后,LPS刺激Caco 2产生iNOS、COX 2、TNF α及IL 8,在mRNA和蛋白水平均较对照组表达上调（P＜0.05）,这一过程中信号通路IκB表达降低,而NF κB p65表达升高,MAPK中ERK1/2磷酸化水平降低,而JNK和p38则呈增强趋势。转染入重组质粒过表达HSF2后,结果则相反。结论 HSF2通过增强ERK1/2蛋白磷酸化水平,抑制JNK、P38及NF κB表达,能有效抑制LPS引起Caco 2细胞的炎性酶及炎性因子的表达,在炎症反应中起保护性作用,对研究溃疡性结肠炎的发病机制提供线索,可能成为其治疗新的靶点。     

真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1的构建及其在HEK293T细胞中的表达术

目的构建真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，并验证其在HEK293T细胞中的表达。方法从人的全血标本中提取DNA模板，经PCR获得Hath1-cDNA，将Hath1-cDNA和pIRES2-DsRed2质粒用限制性内切酶XhoI、EcoRI双酶切，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，割胶纯化，前者回收1065bp片断，后者回收大片断，再将回收的2个片断用T4DNA连接酶连接，转化感受态DH5q细胞，挑选单克隆，提取质粒，将所提取的质粒双酶切鉴定并测序。再将构建成功的pIRES2-DsRed2-Hath1质粒通过脂质体Lipofectarnine^TM2000转染HEK293T细胞，观测其转染情况和目的基因的表达情况。结果成功地构建了真核表达载体pIRES2-DsRed2-Hath1，该质粒能有效地转染HEK293T细胞，目的基因能有效表达。结论pIRES2-DsRed2-Hath1的构建为Hath1基因转染致聋小鼠的耳蜗的实验奠定了基础。     

脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞的效率研究

目的:脂质体介导重组起搏基因pIRES2-EGFP-HCN2转染HEK293细胞,观察转染效率,探讨其构建生物起搏器的可行性。方法:对含hHCN2cDNA的PTR载体进行转化和扩增,将所得hHCN2基因定向克隆到真核表达载体pIRES2-EGFP中,双酶切来鉴定克隆的正确性。将重组质粒用脂质体转染HEK293,荧光显微镜观察EGFP的表达并计算转染效率。结果:构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2。荧光显微镜下可见转染后的HEK293呈绿色荧光,其转染效率可达90%以上。结论:成功构建了重组质粒pIRES2-EGFP-HCN2,并用脂质体转染的方法导入HEK293细胞,为生物起搏的研究奠定实验基础。     

肾癌组织中NF—κB信号分子的表达及As2O3对人肾癌786—0细胞中NF—κB信号通路影响的研究

目的：探讨NF—κB信号通路与肾癌发生和发展的关系以及三氧化二砷（As2O3）对人肾癌细胞系786—0的NF—κB信号转导的影响。方法：采用ICC、ISH、Westernblot和EMSA技术检测15例肾癌组织和10例正常肾组织中NF—κB信号分子IKKα／β、IκBα、p65和ICAM-1的表达和NF—KBDNA结合活性；As2O3处理肾癌786—0细胞后NF—κB信号分子蛋白表达、p65mRNA表达和NF—κBDNA结合活性的改变。结果：肾癌组织中NF—κB DNA结合活性及p65、IKKα／B和ICAM-1蛋白表达量升高（R〈0．01），但IKB仅蛋白明显降低（P〈0．01）；经2μmol／L浓度As2O3处理786-0细胞72h后，p65mRNA含量、NF—κBDNA结合活性及p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白的表达量均降低（P〈0．01）。结论：NF—κBDNA结合活性及p65、IKKα/β和ICAM-1蛋白增加可能与肾癌的发生和进展有关；2μmol／L以上浓度As2O3可以全面抑制786—0细胞中p65、IKKα/β、IκBα和ICAM-1蛋白和p65mRNA的表达，抑制NF—κBDNA结合活性，可能是As2O3抑制786—0细胞增殖的另一种机制，NF-κB有可能成为抗肾癌治疗的靶点之一。     

α-actinin2增加SK2通道在HEK293膜蛋白的表达

目的：证实α-Actinin 2与小电导钙激活钾通道（Small Conductance Ca2＋-activated K＋Channels, SK）的共同表达增加SK2在HEK293细胞膜上的表达。方法：HEK293细胞用RPMI 1640培养基培养。将HEK293细胞分为两组,对照组细胞转染pIRES-SK2质粒,实验组细胞共转染pIRES-SK2和pcDNA3-α-actinin2质粒。免疫荧光共聚焦显微镜和蛋白印迹技术检测SK2通道蛋白在HEK293细胞膜上的表达。结果：免疫荧光共聚焦显微镜检测到转染pIRES-SK2质粒的HEK293细胞膜上有SK2通道蛋白的表达。蛋白印迹技术显示实验组蛋白条带亮度明显高于对照组。结论：α-Actinin 2能增加SK2在HEK293细胞膜上的表达。