药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究

目的：研究不同培养基、不同培养条件对桑黄菌丝生长的影响。方法：通过液体发酵培养,并利用L9(3^4)正交试验筛选出了桑黄液体发酵的优化培养基。结果与结论：玉米粉为最佳碳源,麸皮为最佳氮源,优化培养基配方为：玉米粉5％、麸皮3％、磷酸二氢钾0．3％、硫酸镁0．15％、维生素B1 20μg／100mL、维生素B2 30μg／100mL;最适菌丝体生长的液体发酵条件为：培养温度为26℃,摇瓶转速130r／min,pH值6．5,接种量15％～20％,种子液培养时间为5d,装液量(500mL三角瓶)为140mL．发酵时间为7d。     

粗茎秦艽组织培养及再生植株

用粉茎秦艽Gentianacrassicaulis子叶和下胚轴为材料。在MS＋2mg／L2，4－D＋0．5mg／LBA的培养基上进行培养，子叶及下胚轴的出愈率为100％。愈伤组织继代培养于MS＋0．5mg／L2，4-D＋0．5mg／LBA＋0．5mg／LNAA＋500mg／LLH＋3倍MS有机物和维生素的培养基上生长旺盛。愈伤组织转入分化培养基MS＋1mg／LNAA＋2mg／LBA＋3mg／LZT＋3mg／LGA＋500mg／LLH＋6％蔗糖＋3倍MS有机物和维生素＋3倍FeSO4（Na2－EDTA）上培养，其中40％形成体细胞胚。体细胞胚在无激素MS培养基上发育成苗。     

新生隐球菌荚膜基因CAP60对菌体荚膜形成的影响

目的：研究新生隐球菌荚膜相关基因CAP60对菌体荚膜形成的影响。方法：用PCR方法分离CAP60基因并测序鉴定，将该基因导入转化载体并转化cap60ura^-菌株，乳胶凝集试剂盒筛选转化分子。结果：部分转化子恢复莱膜的表型，表明得到的片段具有荚膜基因功能。结论：荚膜基因对新生隐球菌的荚膜形成都是必须的，缺失其中的任何一个基因都会使新生隐球菌变成无荚膜表型。     

中枢神经系统感染性疾病的病原学研究

目的：探讨中枢神经系统感染性疾病的病原学特点。方法：分别用双抗体夹心ELISA法和传统的细菌及真菌培养等方法检测患者血清IgM，IgG抗体和脑脊髓液中病原体。结果：823例中枢神经系统急症患者中有126例(15．3％)单纯疱疹病毒IgM和／或IgG阳性，其中10岁以下年龄为高峰。10(1．2％)例巨细胞病毒特异性IgM和／或IgG阳性；8(0.97％)例水痘-带状疱疹病毒特异性IgM和／或IgG阳性；7(0．85％)例为结核性脑膜炎；6(0．72％)例为新生隐球菌性脑膜炎；1(0.12％)例为脑膜炎球菌性脑膜炎。结论：病毒，特别是单纯疱疹病毒，是中枢神经系统感染性疾病的常见病原：结核杆菌和新生隐球菌感染也占一定比例。     

新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株。方法：(1)用体外基因重组技术将G418抗性基因插入到新生隐球菌1．2kb的ura5基因中;(2)用电转化方法将体外重组片段导入受体菌;(3)利用5-氟乳清酸(5-FOA)反筛选法筛选ura5突变株;(4)用遗传学鉴定营养缺陷株的方法鉴定突变体。结果：1株突变株ura5基因的序列与重组片段相同;其Southern杂交显示在20kb和7kb处出现2条杂交条带;该突变株能在SDU、SDU和YEPD／G418平板上生长,不能在SD平板生长;其生长曲线显示突变株生长速度依赖于尿嘧啶的提供量。结论：获得了1株新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株ura5突变株,建立了新生隐球菌CAP64荚膜缺陷株转化系统,为CAP64基因的功能研究提供了工具。     

细胞芯片检测新生隐球菌菌株丝氨酸蛋白酶的表达

目的:利用细胞芯片技术检测新生隐球菌菌株中丝氨酸蛋白酶的表达,初步探讨丝氨酸蛋白酶在新生隐球菌致病过程中的作用.方法:不同来源和血清型的新生隐球菌菌株36株,应用组织芯片构建仪制备菌株芯片,利用菌株细胞芯片和免疫组化技术对菌株中丝氨酸蛋白酶的表达情况进行检测.结果:丝氨酸蛋白酶在所有菌株细胞中强阳性表达率为67.0%(25/36),强阳性表达率在血清A型、血清B型、血清D/AD型分别为46.2%(6/13)、92.3%(12/13)、66.7%(4/6),在环境分离株、临床分离株及荚膜缺陷株中分别为55.6%(5/9)、82.6%(19/23)、25%(1/4).不同血清型及不同来源菌株中,以血清B型、临床分离株中的丝氨酸蛋白酶阳性表达率高(P<0.05).结论:菌株细胞芯片是检测致病性真菌样本成分的新技术;致病力强的新生隐球菌临床分离株中的丝氨酸蛋白酶表达最高,提示丝氨酸蛋白酶在临床菌株致病过程中起到主要作用.     

多巴培养基快速鉴定新生隐球菌产黑的研究

黑素被认为是新生隐球菌重要的毒性因子 [1 ] ,在现有的致病酵母中 ,只有新生隐球菌才能催化合成该产物 [2 ] 。对新生隐球菌黑素的研究主要集中于其致病机制以及利用其特性鉴定该菌种 ,但是否所有菌株都能产生黑素 ,或是多大程度上能产生黑素 ,以及如何更好的利用该特性为临床服务都是迫切需要解决的问题。本研究利用改良的多巴培养基对本室保存的 15 7株新生隐球菌进行显色培养 ,以期对该方法的临床意义作一客观的评价。1　材料和方法1.1　菌株　 15 7株菌株均为已明确鉴定好的新生隐球菌 ,其中 A型 35株 ,B型 2 6株 ,C型 4株 ,D型 9株 …     

PCR对新生隐球菌的基因分型研究

目的：用AP-PCR方法检测新生隐球菌的临床和环境分离株,观察PCR指纹与血清型的关系。探索PCR指纹对于新生隐球菌的分型标准。方法：采用3种寡核苷酸重复序列即CN1[（GTG5）]、CN2[（GACA）4]和CN3[（GATA）4]为引物对从患和鸽粪中分离到的48株新生隐球菌DNA进行扩增,根据圹增产物的电泳带型对比PCR指纹和血清型之间的关系。结果：38株血清A型株中,34株有完全相似的DNA带型,另4株中1株与血清D型的DNA带型相似,3株的PCR指纹与血清A、B、C、D型的带型均不相同,各有独特的PCR指纹带型。2株B型和2株C型产生几乎完全一致的PCR指纹带型,3株D型和3株其他隐球菌则各自产生特定的DNA带型。结论：（1）大多数血清A型产生隐球菌株具有相似PCR指纹带型;（2）血清B型和C型（gattii变种）的PCR指纹不易区别,相同血清型不同的株可能有不同的PCR指纹带型;（3）PCR指纹法用于新生隐球菌菌株鉴定的一种快速、方便、可行的方法。     

地黄优良品种"85-5"脱毒苗的快速繁殖研究

目的 探索“85－5”脱毒苗的快速繁殖技术。方法 将脱毒苗接种在不同培养基（单位：mg／L）（1．MS）（1．MS＋BA＋0．5．MS＋BA0．5＋NAA0．02；3．MS＋BA0．5＋NAA0．02＋GA30．1；4．1／2MS＋BA0．1；5．1／2MS＋BA0．1＋GA20．1；6．1／2MS＋GA30．1）上，30d后统计新生叶片数、根数以及苗高等。然后选用2号培养基，在不同的培养条件下培养，同上记录有关数据。结果 在1，2和3号培养基上，具茎尖苗主茎发育良好，基部具1－3个腑芽；无茎尖苗腋芽发育， 芽长0．5－1．5cm。4，5和6号培养基上脱毒弱，叶少根多。在相同光照条件下，28℃时，各项测量均显著高于23℃时的值，在相同温度与，低光照培养，叶小苗高，强光则相反。此外，还发现BA和GA3之间存在拮抗作用。结论 在28℃，1000－2000lx培养条件下，采用2号培养基适于“85－5”脱毒苗的快速繁殖。     

不同氧浓度对新生隐球菌尿素酶和磷脂酶的影响

目的低氧对新生隐球菌毒力因子的影响尚不清楚。文中探讨不同氧浓度对新生隐球菌分泌尿素酶和磷脂酶的影响。方法以厌氧、微需氧和CO2产气袋建立不同氧浓度(氧浓度分别为0%、8%和15%)培养条件,以尿素酶培养基和卵黄培养基采用平板法培养不同血清型的6株新生隐球菌,观察尿素酶培养基颜色变化情况,计算沉淀圈比值(PZ值),比较不同氧浓度培养条件下新生隐球菌分泌尿素酶和磷脂酶的情况。结果第7天正常氧浓度培养条件下除菌株ATCC32609外,其余菌株均出现颜色变化,CO2培养条件下仅菌株BLS63和ATCC34874出现轻微颜色变化,微含氧及厌氧培养条件下所有受试菌株均未出现颜色变化。菌株BLS71、ATCC32609和ATCC34874微含氧培养条件下的PZ值大于其他培养条件,差异有统计学意义(P<0.05)。其余菌株在正常氧、CO2和微含氧培养条件下PZ值差异无统计学意义(P>0.05)。厌氧培养条件下所有受试菌株均未产生肉眼可见的沉淀圈。结论低氧可能对新生隐球菌尿素酶和磷脂酶活性有抑制作用。     

黑色素与新生隐球菌性脑膜炎的关系

目的：分析新生隐球菌黑色素生成的影响因素,初步探讨黑色素与新生隐球菌脑膜炎的相互关系。方法;在含左旋多巴的液体培养液中孵育各种血清型新生隐球菌,分光光度计测定不同条件下液体下的Ｄ值。结果：新生隐球菌黑色素的产生要多种因素的影响,其中以氮源、葡萄糖和温度的影响最为明显。结论：脑组织中富含黑色素的底物儿茶酚胺类物质,新生隐球菌侵犯脑膜和脑组织似与黑色素无关。     

播散性隐球菌病1例分析

分析在1例肝硬化脾切除术后患者被新型隐球菌侵入血流引起播散性隐球菌病的临床表现、治疗措施与实验室检测结果。患者,男性,30岁,于2016年3月因“脾大、脾功能亢进”行“脾切除+贲门周围血管离断术”,术后多次无明显诱因发热,体温最高39 ℃,相继伴背痛、左下肢脓肿和右髋关节痛。CT和MRI显示患者肺部病变及多处骨质破坏,期间抗生素治疗效果不佳。2017年4月19日对脓液直接革兰染色、墨汁染色,使用API 32C、Vitek 2 Compact、rDNA ITS和IGS序列分析等方法对分离自患者脓液、血液中的菌株进行鉴定,检测患者血清中隐球菌抗原,使用ATB FUNGUS 3进行抗真菌药敏试验。结果在新鲜脓液标本墨汁染色后菌株呈现厚厚的荚膜,从脓液及血液中分离出的菌株经API 32C、Vitek 2 Compact、rDNA ITS和IGS序列分析均鉴定该菌为新型隐球菌,血清新型隐球菌荚膜抗原阳性。该菌对5-氟胞嘧啶、两性霉素B、氟康唑、伊曲康唑及伏立康唑的最小抑菌浓度分别为：<4 mg/L、<0.5 mg/L、4 mg/L、≤0.25 mg/L和0.125 mg/L。给予“氟康唑联合两性霉素B”抗感染治疗2个月脓肿缩小,6个月患者康复。隐球菌感染起病隐匿且临床症状不典型,缺乏特异性,经血流播散造成血流感染会累及包括皮肤、骨骼等全身多个脏器。临床应尽早采血培养监测,去除原发病灶以切断感染途径并进行有效抗隐球菌治疗。     

新型隐球酵母cap 70 荚膜缺陷株转化系统的建立

目的：构建新型隐球菌荚膜缺陷株cap70的转化系统。方法：⑴在新型隐球菌的荚膜缺陷株cap70中利用5-氟乳清酸（5-FOA）反选择法筛选尿嘧啶合成基因突变株（cap70 ura5),并用Southern杂交和PCR方法对突变株作进一步验证;⑵利用ura5及ura3为选择标记的质粒载体pCXJ18及pCXJU,用电转化法和化学转化法转化ura5突变株。结果：筛选到ura5突变株,经验证该突变株尿嘧啶合成功能缺失;首次用化学转化法在新型隐球菌的转化中获得高效率转化。结论：首次建立了新型隐球菌cap70荚膜缺陷株的转化系统,为克隆与荚膜形成有关的新基因提供了基础,并为以基因中断、基因替代方法研究基因功能及基因表达等方面的工作创造了条件。     

影响新生隐球菌毒性及其他表型改变的微观进化

目的 :探讨微观进化在新生隐球菌感染中的作用。　方法 :取标准的产黑素和白化突变菌株分别培养 ,研究产黑素表型的变化 ,并用聚合酶链反应进行CNLAC1目的基因片段的扩增。　结果 :产黑素在转种培养后未见变化 ,而CNLAC1基因片段扩增时 ,发现转种后的菌株发生细微变化。　结论 :新生隐球菌微观进化现象不超越菌种 ,甚至表型都不发生明显变化 ,这为菌种保藏可能提供一个更早期的参考指标。     

三个品种豚鼠血液蛋白多态性的比较分析

新生隐球菌是一种具荚膜的酵母样真菌,主要侵犯中枢神经系统和肺脏,好发于免疫功能低下的成人。近年来隐球菌病的发病率越来越高,因而引起国内外真菌学家的高度重视。系统研究新生隐球菌感染导致疾病的关键是动物实验。该菌感染最常用的动物模型主要是小鼠、大鼠和豚鼠,其他动物如兔、猪和一些非哺乳动物也已被用于制作新生隐球菌动物模型。这些动物模型的构建对进一步研究新生隐球菌发病机制、免疫学变化、疫苗的开发和有效的药物的筛选等有极其重要的作用,现就近几年新生隐球菌感染动物模型的进展作一综述。     

Disseminated cryptococcal lymphadenitis with negative latex agglutination test

We reported an unusual case of disseminated cryptococcal lymphadenitis in an immunocompetent host who presented with fever and lymphadenopathy, which were the only two symptoms and signs. Latex agglutination test of serum and cerebrospinal fluid (CSF) were negative, while lymph node biopsy showed Cryptococcus neoformans. A diagnosis of disseminated cryptococcal lymphadenitis was made. Then the patient was treated with amphotericin B for 15 days as initial therapy and itraconazole for 6 months as maintenance therapy respectively. The patient received re-examination per 6 months and was followed up for 2 years. Swollen lymph nodes diminished gradually, and no fever or other symptoms were found. Latex agglutination test of serum and CSF were negative throughout the follow-up period, and anti-HIV, syphilis and tuberculosis antibody were all negative.

     

清轻胶囊辅助降血脂功能的实验研究

目的研究清轻胶囊的辅助降血脂功能。方法采用预防脂代谢紊乱模型法,设200、400、800mg／kgBW三个剂量组和空白对照组、高脂模型对照组,每天灌胃给予样品,并同时喂饲高脂饲料,于给样30d后,取血分别测定血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白（HDL-C）等指标。结果清轻胶囊剂量组的TC、TG水平较高脂模型对照组降低,差异有统计学意义（P〈0.01或P〈0.05）。结论清轻胶囊具有辅助降血脂功能作用。     

荚膜在新生隐球菌致人脐静脉内皮细胞损伤中的作用

目的:探讨无荚膜和有荚膜(野生株)两种新生隐球菌菌株对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)抑制率的差异,明确荚膜在其中发挥的作用. 方法:通过透射电子显微镜(TEM)观察新生隐球菌侵入和损伤HUVEC的过程以及作用后细胞的形态学变化;分别在不同时相点用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测细胞抑制率的变化.结果:通过TEM观察到两种菌株均造成细胞不同程度的损伤:细胞的内质网疏松,线粒体肿大,细胞核膜损伤及其细胞的基本结构紊乱.CCK-8试剂盒的检测结果表明,共孵30 min时,两菌株对HUVEC的抑制率比较无统计学意义;共孵1、2、3、4 h时,无荚膜株对内皮细胞的抑制率均高于野生株(P＜0.05),在1 h无荚膜株的抑制率可高达79%; 5 h时,两菌株对HUVEC的抑制率无统计学差异.结论:无荚膜株较野生株造成HUVEC更大程度的损伤,说明荚膜在隐球菌损伤HUVEC过程中发挥着重要作用.     

Identification of clinical and environmental isolates of Cryptococcus neoformans by AP-PCR fingerprinting

ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｎｅｏｆｏｒｍａｎｓｂｙＡＰＰＣＲｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇＷｅｎＨａｉ温海，ＷｕＪｉａｎｈｕａ吴建华，ＬｉａｏＷａｎｑｉ...