两种重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白转染大鼠成骨细胞效率的体外研究

目的 比较2种不同重组腺相关病毒(rAAV)介导的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)对大鼠成骨细胞的转染效率,评价其作为成骨细胞病变基因治疗载体的可行性.方法 采用Ⅰ型胶原酶阶段消化法分离培养大鼠成骨细胞并鉴定,rAAV-EGFP按转染复数(MOI) 1×10~3、1×10~4、1×10~5、5×10~5分为只加rAAV和rAAV与腺病毒(ADV)共同转染组转染成骨细胞,倒置荧光显微镜观察转染后荧光强度随转染时间的变化,流式细胞仪检测rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP对成骨细胞的转染效率及荧光强度,确定转染的较佳MOI值,以此值用MTT法描绘细胞生长曲线,观察rAAV对细胞的毒性.结果 分离培养的细胞具有体内成骨细胞的生物学行为,rAAV对成骨细胞的转染效率随MOI值的增加而提高,ADV(-)组荧光强度在第5 d达到高峰,当MOI为1×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率分别为90.2%、66.1%,MOI值增到5×10~5时转染效率无显著提高;ADV(+)组荧光强度在第3 d即达高峰,MOI值为5×10~5时,rAAV2/6-EGFP和rAAV2/9-EGFP的转染效率为47.6%、30.5%.细胞生长正常,rAAV对细胞活性影响小.结论 两种病毒载体对成骨细胞转染效率均较高,其中rAAV2/6高于rAAV2/9,是一种理想的基因治疗载体.     

腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因体外转染兔结膜上皮细胞

目的:研究2型重组腺相关病毒( recombinant adeno-associated virus 2,rAAV2)载体介导增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced green fluorescent protein,EGFP) 对体外培养兔结膜上皮细胞的转染和表达情况,为后续研究提供依据。方法:体外培养兔结膜上皮细胞,rAAV2-EGFP 按感染复数(multiplicity of infection ,MOI)为104、105、106 转染第2代兔结膜上皮细胞,转染后第1 、3 、5 、7日倒置荧光显微镜下观察细胞中EGFP表达情况,计算转染率。MTT方法检测rAAV2-EGFP转染对细胞增殖的影响。结果:随着MOI值增大及转染时间延长,EGFP 表达效率逐渐增高,转染后第7～8日达到高峰并维持。MTT检测各MOI组与对照组差别无统计学意义。结论:rAAV2载体可以介导EGFP 基因高效稳定转染兔结膜上皮细胞,并且对细胞增殖无影响。     

2种腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白对人成纤维细胞转染效率的研究

目的 比较2种不同腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)介导的增强型绿色荧光蛋白对人皮肤成纤维细胞(human fibroblast, HFB)的转染效率.方法 原代分离培养人皮肤成纤维细胞并鉴定,按照感染复数(multiple of infection,MOI)为104、105、106转染传2代的人成纤维细胞,流式细胞检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的转染效率,倒置荧光显微镜观察转染后的荧光强度.MTT法检测AAV2-EGFP和AAV2/1-EGFP对HFB的毒性.结果 腺相关病毒AAV2-EGFP对HFB的转染效率随着MOI增加而增高, MOI为104时转染效率为(7.68±1.18)%,当MOI达到105后,转染效率稳定在(22.16±5.59)%,随着MOI增加,最高至MOI 106转染效率无显著提高.而病毒AAV2/1对于HFB的转染效率在MOI 为106转染效率仅为(3.47±0.93)%.2种病毒在转染过程中,细胞生长正常,MTT显示各转染组与未转染组的吸光度值无统计学差异.结论 AAV2载体对体外培养的HFB转染效率高于AAV2/1,但2种病毒载体对人皮肤成纤维细胞转染效率均不高,AAV2/1-EGFP对HFB几乎无感染能力.     

rAAV1-EGFP和rAAV2-EGFP转染犬骨髓间充质 干细胞的比较

 【目的】 研究不同血清型腺相关病毒(rAAV)载体介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)对体外培养犬骨髓间充质干细胞(MSC)的转染效率及其毒性作用&#65377;【方法】 应用密度梯度离心法及贴壁筛选法分离培养犬MSC,倒置显微镜及Giemsa染色观察细胞形态,透射电镜观察其超微结构,流式细胞仪鉴定其表面标记物&#65377;取第3代MSC,以MOI为104 ~ 105 v.g./cell 的rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP进行转染,3 d&#65380;7 d&#65380;21 d后荧光显微镜观察检测转染效率;MTT法检测rAAV1-EGFP 和rAAV2-EGFP对MSC的毒性作用&#65377; 【结果】 原代及传代培养的MSC呈梭形外观,具有较强的增殖能力&#65377;MSC超微结构显示其胞体较小,细胞核/浆比例大,胞浆少,染色质较疏松&#65377;细胞表面抗原CD29&#65380;CD44表达阳性,CD34表达阴性&#65377;随MOI的增加及时间的延长,rAAV1-EGFP&#65380;rAAV2-EGFP对犬MSC的转染效率逐渐增加,rAAV2-EGFP转染效率明显高于rAAV1-EGFP(P < 0.01)&#65377;转染MSC细胞后,细胞生长正常,MTT法显示各转染组与未转染组的OD值无统计学差异(P > 0.05)&#65377; 【结论】 相对犬MSC,rAAV2是一种比rAAV1更优越的转基因载体,而且对细胞生长无明显抑制,做为组织工程种子细胞的载体是安全可行的&#65377;     

2型重组腺相关病毒转染新西兰兔关节软骨细胞的体外研究

目的为进一步研究腺相关病毒重组体在体内间接和直接基因治疗的效果提供依据。方法应用AAVMaxTM包装系统,复制和包装2型腺相关病毒重组体,进行纯化和滴度检测后,按照不同的转染指数(MOI)转染体外培养的新西兰兔关节软骨细胞,观察转染效果与及转染效果与时间的关系。倒置荧光显微镜观察证实表转染成功,流式细胞仪检测转染效果,包括表达绿色荧光信号细胞的百分比和平均荧光强度,将未转染的软骨细胞自发表达的绿色荧光信号百分比的最大值4·76%和荧光信号强度的最大值1·04设定为空白对照。结果当MOI值在1×105v·g·/cell以下时,MOI值(v·g·/cell)与转染率之间的剂量-反应曲线为正相关的线性关系,在MOI超过105v·g·/cell时,转染率不会再有显著的提高。在转染第7天,绿色荧光信号表达达到了峰值,随着转染时间的延长和传代次数的增加,表达绿色荧光信号的软骨细胞百分比和荧光强度均呈现降低趋势,但在转染后第56天仍可检测到绿色荧光蛋白的表达。结论2型腺相关病毒重组体在体外对新西兰兔关节软骨的转染效果良好;增强绿色荧光蛋白是观察2型腺相关病毒重组体转染关节软骨细胞效果一种良好的报告基因。     

重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的实验研究

目的 研究重组腺相关病毒 (rAAV)介导增强型绿色荧光蛋白 (EGFP) 基因经角膜基质瓣转染兔角膜基质细胞的有效性和安全性。方法 微型角膜刀制作兔角膜基质瓣；转染组用含rAAV－EGFP转染液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，对照组用等量BSS液浸泡角膜瓣和角膜基质床10 min，不同时间点(1、3、7、14、21d)通过荧光体视镜观察角膜出现EGFP荧光的起始时间及分布情况，收集角膜，其中一半用激光共聚焦显微镜观察、照相，另一半固定后行HE染色。结果 转染组于转染第3天，体视荧光显微镜下观察到兔眼角膜瓣内面及基质床中开始有GFP阳性表达；7d达到高峰, 21d时仍有微弱表达。第7天 在激光共聚焦显微镜下可观察到兔角膜基质中有明显的荧光表达。对照组角膜始终未见荧光表达。转染组和对照组角膜HE染色均未见炎症细胞浸润及新生血管等异常。结论 rAAV- EGFP经兔角膜基质瓣转染角膜基质细胞的方法可将基因安全、相对高效地转入角膜基质细胞。为转基因治疗角膜病提供了新的转染途径。     

超声辐照与丁酸钠对腺相关病毒转染大鼠视网膜色素上皮细胞的影响

目的 探讨超声辐照与丁酸钠在携带增强型绿色荧光蛋白的2型重组腺相关病毒(rAAV2-EGFP)感染大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中的应用价值.方法 大鼠RPE细胞接种于24孔板中,分别以rAAV2-EGFP(对照组)、rAAV2-EGFP+超声辐照(超声辐照组,辐照时间60 s,声强0.5、1 W/cm2)、rAAV2-EGFP+不同终浓度丁酸钠(丁酸钠组)转染大鼠RPE细胞.转染后48 h,倒置荧光显微镜观察转染细胞EGFP表达情况,流式细胞仪检测细胞转染效率(EGFP阳性细胞百分率);转染后24 h,MTS法检测细胞增殖.结果 流式细胞仪检测结果显示:超声辐照组和丁酸钠组EGFP阳性细胞百分率显著高于对照组(P＜0.05),丁酸钠组转染效率提高的百分率显著高于超声辐照组(P＜0.05).细胞增殖检测结果显示,超声辐照组转染细胞的吸光度值显著高于丁酸钠组(P＜0.05).结论 丁酸钠和超声辐照均能提高rAAV2-EGFP对大鼠RPE细胞的转染效率,其中丁酸钠的效果显著,而超声辐照对细胞增殖的抑制程度较轻.     

2型腺相关病毒转导人骨髓CD34+细胞与间充质干细胞

目的:探讨2型重组腺相关病毒(AAV2)载体能否有效转导人骨髓CD34 细胞与间充质干细胞。方法:构建、包装、纯化携带绿色荧光蛋白基因的2型重组腺相关病毒(rAAV22/GFP),转染骨髓CD34 造血干/祖细胞和间充质干细胞,转导后48 h在荧光显微镜下观察GFP的表达,并比较羟基脲(HU)处理前后rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率。结果:rAAV2/GFP对CD34 细胞的转染效率为5.3%±1.7%。经羟基脲预处理后达13.2%±2.8%,rAAV2/GFP对间充质干细胞的转染效率为23%±3.6%。结论:rAAV2对间充质干细胞的转染效率高于骨髓CD34 细胞,羟基脲预处理可以明显提高rAAV2对CD34 细胞的转染效率。     

HSV1-TK基因重组腺相关病毒载体的构建及表达

目的:构建含单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(HSV1-TK)基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,制备重组腺相关病毒rAAV2/HSV1-TK,并检测HSV1-TK基因在转染晶状体上皮细胞中的整合和表达,为后囊膜混浊的基因治疗奠定基础.方法:用基因重组技术构建含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0-TK,并通过PCR和酶切鉴定;将该质粒转染BHK-21细胞,经G418筛选出携带该质粒的载体细胞株BHK-21/TK,在辅助病毒的参与下包装成重组病毒rAAV2/HSV1-TK;用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法和高效液相色谱(HPLC)法检测重组病毒rAAV2/HSV1-TK的纯度,用斑点杂交法检测重组病毒的滴度;重组病毒rAAV2/HSV1-TK转染兔晶状体上皮细胞N/N1003A,用PCR和RT-PCR检测HSV1-TK基因的整合和表达.结果:经PCR和酶切鉴定重组质粒pSNAV2.0-TK构建成功;成功制备了重组病毒rAAV2/HSV1-TK,病毒滴度达1×1012v.g./mL;重组病毒转染N/N1003A细胞后,PCR和RT-PCR检测显示HSV1-TK基因在细胞中整合并且有效表达.结论:成功构建了含HSV1-TK基因的重组腺相关病毒载体质粒,制备了高滴度重组病毒rAAV2/HSV1-TK,HSV1-TK基因在转染该病毒的晶状体上皮细胞中可有效表达.     

rAAV2载体介导G卯基因转染树突状细胞

目的：在诱导人骨髓CD34^＋细胞分化成树突状细胞（dendritic cells，DCs）的基础上，探讨2型重组腺相关病毒（Type 2 recombinant adeno-associated virus，rAAV2）载体介导绿色荧光蛋白（green fluo-rescent protein，GFP）基因转染DCs的条件。方法：采用免疫磁珠法分离纯化人骨髓来源的CD34^＋细胞。在含有IL-4和GM-CSF的培养体系中体外诱导CD34^＋细胞生成DCs，于第5天加入TNF-α诱导DCs成熟，在不同时间用rAAV2载体介导GFP基因转染未成熟和成熟的DCs。通过电子显微镜和流式细胞仪鉴定树突状细胞，荧光显微镜及流式细胞仪检测GFP的表达。结果：人骨髓CD34^＋细胞经诱导分化后，在光镜及透射电镜下均可观察到DCs的形态特征，流式细胞仪检测到DCs表型；荧光显微镜及流式细胞仪检测细胞培养第3天、第5天和加入TNF-α后的rAAV2-GFP转染率分别为0．45％，13．54％和0．25％。结论：本实验中所采用的培养体系可成功将人骨髓CD34^＋细胞诱导分化成DCs，rAAV2／GFP转染DCs效率随细胞诱导分化时间的延长而增高，且转染未成熟DCs的效率高于转染成熟DCs。     

不同病毒载体感染内耳组织的比较研究

目的 通过血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒感染大鼠内耳组织的比较研究,筛选出更适合内耳基因治疗的病毒载体.方法 一定体积的血清5型重组腺病毒液和血清2型重组腺相关病毒液经圆窗膜注入鼓阶外淋巴液,通过荧光共聚焦显微镜、免疫组化、Western免疫印迹及听性脑干反应等方法 对两种载体所携带报告基因的表达部位、表达时程以及两种病毒本身对内耳组织细胞生活状态的影响加以比较.结果 血清5型重组腺病毒和血清2型重组腺相关病毒所携带的增强型绿色荧光蛋白报告基因均可在前庭膜、血管纹、基底膜、盖膜、螺旋神经节区及转染对侧耳表达.rAAV2携带的EGFP蛋白第14天表达开始明显增多,第60天仍可检测到高表达.rAd5携带的EGFP蛋白在耳蜗组织内的表达高峰维持在第1～21天,在30天时表达明显减弱.结论 腺病毒的优势在于其基因表达的迅速和高效,而腺相关病毒载体以其长的表达时程,低组织细胞毒性在内耳基因转染中表现出独特的优势.     

慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白转导兔角膜上皮细胞的体外实验研究

目的 观察慢病毒载体(lentiviral vectors, LVs)用于兔角膜上皮细胞基因转染的有效性.方法 兔角膜上皮细胞的原代及传代培养并做细胞鉴定;慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白(lenti-EGFP)以不同的感染复数(multiplicity of infection, MOI=0、1、10、50、100、500)转染实验细胞,寻找最佳转染剂量;于转染后24、48、72、96 h运用倒置荧光显微镜观察不同MOI下增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein, EGFP)的表达并计算细胞转染率;RT-PCR 方法检测EGFP基因的表达情况.结果 EGFP于转染48 h即开始有表达,随着转染时间的延长其表达增强.MOI=1、10、50、100时,角膜上皮细胞转染率随着感染复数的增加而增加,分别为(4.5±0.6)%、(30.4±0.9)%、(51.9±1.4)%、(75.4±0.7)%,各组间差异显著(P<0.05);MOI在100与500时,转染率差异不显著(P>0.05),即最适感染复数为100.RT-PCR结果提示转染细胞组EGFP基因有表达.结论 慢病毒载体能够有效转染离体兔角膜上皮细胞.     

1型及2型腺相关病毒对视网膜细胞转导效率的比较研究

目的探讨不同血清型的重组腺相关病毒(rAAV)对视网膜细胞的转导效率、基因表达水平以及感染细胞类型的差异,为眼底病基因治疗选择适当的载体提供实验依据。方法采用携带绿色荧光蛋白报告基因的血清型1型(rAAV2/1-EGFP)和2型(rAAV2-EGFP)rAAV感染体外培养的RPE细胞株、原代培养的SD大鼠视网膜神经细胞和原代培养的成人RPE细胞,通过荧光显微镜和流式细胞仪观察和检测EGFP荧光出现的时间、阳性率及荧光强度。分别将二种不同血清型的rAAV注射到SD大鼠视网膜下间隙,通过荧光体视镜观察眼底出现EGFP荧光的时间、范围、强度和分布特点等。最后通过眼组织切片和免疫组织化学染色观察被AAV感染的视网膜细胞的类型,以及是否有炎症反应和免疫反应。结果流式细胞仪检测rAAV2-EGFP转导体外培养的RPE细胞株后第7、14天时EGFP阳性率分别为13.5%±1.7%和15.6%±0.8%,平均亮度为2.75±0.12和3.80±0.72;rAAV2/1-EGFP转导RPE细胞株后第7和14天时EGFP阳性率分别为1.1%±0.5%和2.0%±0.4%,平均亮度为1.12±0.09和1.75±0.20。rAAV2-EGFP感染活体视网膜后7、14、28、75d和4个月时,视网膜内EGFP荧光面积分别为(5389±211)μm2、(9832±364)μm2、(14454±446)μm2、(20528±648)μm2和(20264±683)μm2;rAAV2/1-EGFP感染活体视网膜后在相同时间点测得EGFP荧光面积分别为(9666±348)μm2、(12160±439)μm2、(19794±621)μm2、(26172±923)μm2、(26022±965)μm2。每相同时间点的两组数据间差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论2型rAAV能有效转导体外培养的视网膜细胞和活体视网膜细胞;但在活体视网膜内1型rAAV是一种比2型AAV更为有效的基因传递载体。     

人GFP-AWP1融合基因载体的构建及其在293细胞中的表达

目的 克隆、构建绿色荧光蛋白(GFP)-AWP1(associated with protein kinase C related kinase 1,AWP1)表达载体,观察AWP1在293细胞中表达和定位。方法 采用逆转录PCR(RT-PCR)法从人ECV304内皮细胞中扩增AWP1cDNA编码区,并将其重组于GFP表达载体pEGFP-C2中。经酶切、序列鉴定分析后,将该重组质粒通过DOTAP脂质体介导,转染293细胞。荧光显微镜观察AWP1在细胞内的表达和分布。结果 GFP-AWP1融合基因表达载体经酶切鉴定和测序分析确认构建成功,并在293细胞中获得了高效表达。荧光显微镜下,在不携带外源基因的空载体pEGFP-C2转染的对照组293细胞,绿色荧光均匀分布于整个细胞中;在重组质粒pEGFP-C2/AWP1转染的293细胞,绿色荧光弥散分布于细胞质内。结论 成功构建GFP-AWP1融合基因表达载体并表达于293细胞胞质中。     

Construction of GFP-AWP1 fusion gene vector and its expression in 293 cells]

OBJECTIVE: To construct green fluorescent protein (GFP)-AWP1 (a novel human protein associated with protein kinase C-related kinase 1) fusion gene vector for observing the expression and localization of AWP1 in 293 cells. METHODS: The coding region in AWP1 cDNA was amplified by RT-PCR from human endothelial cell line ECV304 and recombined into pEGFP-C2 plasmid expressing GFP. After identification with restriction endonucleases and sequence analysis, the recombinant plasmid was transfected into 293 cells with the cationic liposome DOTAP as the transfection reagent. The expression and localization of AWP1 were observed under a fluorescence microscope. RESULTS: Restriction endonuclease assay and sequence analysis verified the successful construction of the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1, and GFP-AWP1 fusion protein was highly efficiently expressed in 293 cells. Under fluorescent microscope, green fluorescence was seen homogeneously distributed in the entire cell body of the cells transfected by the empty vector pEGFP-C2, but diffusely in the cytoplasm of the cells transfected by the recombinant vector pEGFP-C2/AWP1. CONCLUSION: GFP-AWP1 fusion gene vector is successfully constructed and the fusion protein expressed in the cytoplasm of 293 cells.     

survivin基因启动子的克隆及其在人喉癌Hep-2细胞中的特异性表达

目的:构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,利用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)检测该启动子在Hep-2细胞中的特异表达活性。方法:PCR扩增survivin启动子,置换pShuttle载体中的CMV启动子,构建质粒pSurp;分别双酶切pShuttle、pSurp和pEGFP-C1载体,构建分别携带survivin启动子和巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体pCMV-EGFP和pSurp-EGFP;脂质体法转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果:成功扩增survivin基因启动子,构建了survivin基因启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,用其转染两种细胞后,荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有表达。结论:成功克隆survivin启动子,其在Hep-2细胞具有较强的肿瘤特异性启动活性,为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。