MicroRNA⁃141靶向致癌基因Bmi⁃1抑制胰腺癌细胞的增殖

目的：探讨miR?141调控胰腺癌细胞增殖的机制。方法：采用qRT?PCR检测正常胰腺细胞和4种胰腺癌细胞株中miR?141的表达。从Gene Expression Omnibus数据库（GEO）下载包含36例胰腺癌样本和16例正常样本的GSE71533 miR?141表达文件,分析miR?141在胰腺癌及癌旁的表达差异。Western blot 检测Bmi?1在正常胰腺细胞和4种胰腺癌细胞株中的表达。荧光素酶报告基因检测miR?141和Bm?1之间的靶向关系。通过CCK8、平板克隆形成检测Bmi?1和miR?141对胰腺癌细胞增殖能力的影响。结果：qRT?PCR显示与正常胰腺细胞相比,miR?141在胰腺癌细胞中表达下调;GSE71533数据集分析结果也显示miR?141在胰腺癌组织中下调;Western blot分析结果表明Bmi?1在胰腺癌细胞中高表达,双荧光素酶实验表明miR?141锚定在Bmi?1的3′非编码区,下调Bmi?1可以抑制胰腺癌细胞的增殖;上调miR?141可以降低Bmi?1的蛋白质表达水平,从而抑制胰腺癌细胞中细胞增殖。结论：miR?141通过靶向Bmi?1在胰腺癌中起抑制作用,在胰腺癌诊疗中具有潜在功能。     

11β-羟类固醇脱氢酶1型在小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系NIT-1中的表达

目的 探讨 11β-羟类固醇脱氢酶 1 型(11β-HSD1)在 C57BL/6J 小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系 NIT-1 中的表达及其生物学意义.方法 以11β HSD1 肝脏组织中的表达为阳性参照,RT-PCR 法和 Western blot 法检测小鼠胰腺组织中 11βHSD1 mRNA 和蛋白表达.细胞免疫化学法检测 NIT-1 细胞中 11β-HSD1 的分布与表达,RT-PCR 法和Western blot 法检测 NIT-1 细胞中 11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达.结果 ①在正常 C57BL/6J 小鼠胰腺组织中有 11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达,其表达量均低于肝脏组织(均P<0.01).②细胞免疫化学染色示 NIT-1 细胞胞质见棕黄色染色阳性颗粒,同时 NIT-1 细胞中有11β-HSD1 mRNA 和蛋白表达.结论 小鼠胰腺组织和胰岛β细胞系 NIT-1 中有11β-HSD1 基因表达,为研究糖皮质激素代谢对胰岛细胞功能的影响以及其它潜在的生理功能,提供了一条研究途径.     

Derlin⁃1对非酒精性脂肪肝形成的影响

目的：探讨内质网相关降解蛋白1（endoplasmic reticulum correlative protein 1,Derlin?1）在非酒精性脂肪肝组织中的表达情况及其通过对蛋白激酶R样内质网激酶（protein kinase R?like ER kinase,PERK）,即内质网应激中未折叠蛋白反应感受蛋白的影响,抑制非酒精性脂肪肝（non?alcoholic fatty liver disease,NAFLD）的发生机制。方法：通过免疫组织化学染色及Western bolt技术检测NAFLD小鼠肝脏组织中Derlin?1的表达;在HepG2细胞中利用质粒过表达Derlin?1,以Western blot技术检测其对内质网应激信号通路PERK的影响。结果：Derlin1在NAFLD肝组织中表达明显高于正常肝脏组织;过表达Derlin?1能抑制内质网应激信号通路的激活。结论：Derlin1在NAFLD肝组织的高表达提示其可能通过抑制内质网应激中未折叠蛋白反应感受蛋白PERK,减少内质网应激,阻止肝脏细胞脂肪变。     

Akt1信号通路在胃癌组织中的表达及意义

目的：探讨Akt1信号通路在胃癌组织中的表达及意义。方法采用RT－PCR和Western blot技术分别检测60例胃癌组织及25例正常胃组织中Akt1 mRNA及蛋白的表达情况。结果 Akt1 mRNA和蛋白在胃癌组织中的相对表达量均显著高于正常胃组织（P＜0.01）。 Akt1 mRNA和蛋白在胃癌组织中的表达与患者的性别、年龄无关（P＞0.05）,而与胃癌的分化程度、TNM分期、浸润深度、淋巴结转移情况相关（P＜0.05）。 Akt1 mRNA与蛋白在胃癌组织中的表达呈正相关（r＝0.634,P＝0.000）。结论 Akt1信号通路参与胃癌的发生、发展、浸润转移,在胃癌的癌变过程中起着重要作用。     

去泛素化酶YOD1调控肝脏脂代谢的初步研究

目的：探索去泛素化酶YOD1在肝脏营养代谢中发挥的作用。方法：通过Q?PCR检测高脂饮食C57BL/6小鼠、db/db小鼠肝脏中以及油酸（oleic acid,OA）处理后的Hepa1?6细胞内,YOD1的表达情况。在C57BL/6小鼠中,通过Q?PCR法检测YOD1的组织分布及不同营养状态下的表达情况。对Hepa1?6细胞中给予OA处理,通过甘油三酯试剂盒检测细胞内甘油三脂含量,并利用油红染色观察细胞内脂滴。经Q?PCR和蛋白免疫印迹法检测细胞内相关基因的mRNA及蛋白水平。结果：短期高脂饮食后,肝脏中YOD1的mRNA水平显著下降。而与对照组db/+小鼠相比,db/db小鼠肝脏中YOD1的mRNA水平无变化。但是,经OA处理后,Hepa1?6细胞内的YOD1的mRNA水平明显减少。另外,YOD1主要表达于肝脏中。小鼠禁食后,肝脏YOD1的mRNA水平显著增加,而再喂食后显著下降。此外,过表达YOD1的Hepa1?6细胞中OA诱导的脂质堆积明显减少,且SREBP?1c的剪切被抑制。结论：本研究初步发现,去泛素化酶YOD1的表达水平受营养状态调控,并通过抑制SREBP?1c的剪切影响肝细胞的脂代谢。     

ANLN在肝内胆管癌中的表达及对胆管癌细胞增殖的影响

目的：探讨ANLN基因在肝内胆管癌组织中的表达情况以及在胆管癌细胞增殖中的作用及机制。方法：收集手术切除的 40例肝内胆管癌患者癌组织及癌旁组织,采用RT?PCR、Western blot以及免疫组化的方法检测组织中ANLN mRNA和蛋白表达水平,比较ANLN在肝内胆管癌组织与癌旁组织中的表达差异,分析其与肿瘤分期及肿瘤大小的关系。使用小干扰RNA建立ANLN低表达HUCCT1细胞系,行CCK8、平板克隆以及流式细胞检测观察ANLN对胆管癌细胞体外增殖能力的影响。行String软件预测与ANLN相关的蛋白,行RT?PCR、Western blot方法检测两者间的相关性以及周期蛋白CyclinD1表达差异。结果：Western blot 和RT?PCR显示 ANLN在肝内胆管癌组织中高表达。临床数据分析显示ANLN的表达与肝内胆管癌患者的肿瘤大小及TNM分期密切相关,并且ANLN表达高的患者预后较差。利用小干扰RNA（siRNA）下调 ANLN能有效抑制胆管癌细胞的增殖能力。Western blot实验证明下调ANLN导致周期蛋白 Cyclin D1、Cyclin A表达明显减少。String预测ANLN与TPX2相关,经Western blot和RT?PCR得到验证。结论：ANLN可能通过TPX2调节肝内胆管癌细胞的增殖能力,促进肝内胆管癌的发展,这可为肝内胆管癌的治疗提供新靶点。     

rAAV介导的靶向HIF-1α小干扰RNA在乏氧条件下对MiaPaCa2细胞Glut-1表达的影响

目的：以重组腺相关病毒（rAAV）为载体介导以HIF-1α为靶点的小干扰RNA,在厌氧培养条件下作用于MiaPaCa2人胰腺癌细胞．观察其对糖代谢反应关键酶--葡萄糖转运体-1（Glut-1）表达的影响。方法：构建rAAV介导的以HIF-1α为靶基因的RNA干扰表达载体,即rAAV-siHIF。将rAAV-hrGFP、rAAV-siHIF-1α分别转染对数生长的MiaPaCa2人胰腺癌细胞,在乏氧条件下进行培养,应用Real-Time PCR、RT-PCR、Western Blot法观察其对MiaPaCa2细胞HIF-1α mRNA、蛋白以及Glut-1 mRNA、蛋白表达的影响。结果：Real-Time PCR和Western Blot检测发现。rAAV-siHIF-1α能够抑制MiaPaCa2细胞HIF-1α mRNA和蛋白的表达。RT-PCR和Western Blot检测发现,rAAV-siHIF-1α能抑制MiaPaCa2细胞Glut-1 mRNA和蛋白的表达。结论：rAAV-siHIF-1α能抑制MiaPaCa2人胰腺癌细胞糖代谢关键酶Glut-1表达的作用。     

SP1基因在sublytic C5b⁃9促大鼠肾小球系膜细胞增殖中的作用

目的：检查特异性蛋白1（specificity protein 1,SP1）在Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠肾组织中和亚溶解型C5b?9（sublytic C5b?9）刺激的大鼠肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells,GMCs）中的表达情况,并探讨SP1表达上调对sublytic C5b?9促大鼠GMCs增殖的作用。方法：复制大鼠Thy?1N模型,同时用sublytic C5b?9刺激体外培养的大鼠GMCs,分别用real?time PCR和Western blot检查Thy?1N大鼠肾组织（体内）和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs（体外）中SP1基因的mRNA和蛋白表达水平及其表达时相。与此同时,构建SP1基因的表达质粒（pEGFP?N1/SP1?His）和发夹状小干扰RNA质粒（SP1 shRNA,shSP1）。将上述质粒分别转染大鼠GMCs（同时设对照质粒转染组）,再给予或不给予sublytic C5b?9刺激。用real?time PCR和Western blot检查SP1表达量,并行CCK?8实验检查GMCs的增殖情况。结果：在Thy?1N大鼠肾组织和sublytic C5b?9刺激的大鼠GMCs中,SP1 mRNA和蛋白表达水平均显著上调,且其体内外表达时相较为一致。体外过表达SP1可显著促进GMCs增殖,而沉默SP1可明显抑制sublytic C5b?9诱导的GMCs增殖反应。结论：Sublytic C5b?9刺激大鼠GMCs后能通过上调SP1表达促进GMCs增殖。     

牛蒡子对糖尿病大鼠肾组织基质细胞衍生因子1表达的影响

目的:研究牛蒡子对糖尿病大鼠肾脏基质细胞衍生因子1(SDF-1)表达的影响。方法:建立糖尿病大鼠模型,利用荧光实时定量PCR和Western blot检测经牛蒡子治疗后糖尿病大鼠肾脏组织中SDF-1mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:荧光实时定量PCR结果显示糖尿病大鼠组肾脏组织中SDF-1mRNA(1.499±0.03)明显较正常大鼠组(1.231±0.02)升高,而牛蒡子治疗组大鼠肾脏SDF-1的mRNA(1.27±0.01)较糖尿病大鼠组明显降低,组间比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示牛蒡子治疗组大鼠肾脏中SDF-1蛋白的相对表达量为0.93±0.22,明显低于糖尿病模型组1.60±0.21(P<0.05),与正常组大鼠肾脏表达量接近(0.80±0.13)。结论:牛蒡子能够下调糖尿病大鼠肾脏组织中SDF-1的表达。     

凋亡抑制蛋白c⁃FLIP（L）调控肺纤维化过程的机制

目的：明确凋亡抑制蛋白c?FLIP（L）在肺纤维化过程中的作用,探究其异常表达参与肺纤维化发病的分子机制。方法：构建博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型,对正常鼠与模型鼠的肺组织切片进行HE和Masson染色观察病理变化,并采用免疫组化分析c?FLIP（L）及上皮?间质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）标志分子E?cadherin的表达。构建表达c?FLIP（L）的稳定细胞株,qRT?PCR检测EMT标志分子E?cadherin、N?cadherin及Vimentin的mRNA表达。采用转化生长因子（transforming growth factor,TGF）?β1诱导细胞发生EMT,通过Smad报告基因检测和Western blot分析c?FLIP对TGF?β1诱导EMT发生的影响。结果：c?FLIP（L）表达水平在肺纤维化组织中明显升高,与E?cadherin表达呈负相关性。C?FLIP（L）能促进肺上皮细胞的EMT表型,并促进TGF?β1诱导的Smad信号通路激活,而敲减c?FLIP（L）表达能阻滞TGF?β1诱导的EMT进程。结论：c?FLIP（L）在肺纤维化过程中高表达能促进EMT发生,是肺纤维化病程发展的促进因素之一。     

血管紧张素Ⅱ1型受体mRNA和蛋白在人胰腺癌组织中的表达

目的：探讨血管紧张素Ⅱ1型受体（angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R)mRNA和蛋白在人胰腺癌组织中的表达。方法：标本取向8例手术切除的胰腺癌、癌旁组织及3例正常胰腺组织，RT－PCR方法检测人胰腺癌及正常胰腺组织中AT1R mRNA的表达；免疫组织化学方法与聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）检测人胰腺癌组织中蛋白的表达。结果：AT1R mRNA和蛋白在人胰腺癌组织中均有表达。RT－PCR显示AT1R mRNA在人胰腺癌组织与人正常胰腺组织中的阳性表达率分别为87．5％（7／8）和0（0／3），免疫组织化学染色显示AT1R蛋白在人胰腺癌组织中的阳性表达率为62．5％（5／8），明显高于癌旁组织的12．5％（1／8），差异有高度显著性（P＜0．01）；SDS－PAGE蛋白电泳也证实胰腺癌组织有AT1R蛋白的存在，而在人正常胰腺组织中则未见AT1R蛋白的阳性表达。结论：AT1R在人胰腺癌的生长中具有重要作用，抑制AT1R可能是一种有效的治疗策略。     

培养神经元细胞中E3B1基因的表达变化与轴突生长抑制的关系

目的检测E3B1基因在培养神经元轴突生长抑制前后的表达变化及意义。方法应用RT—PCR和Western blot检测培养神经元轴突生长抑制前后E3B1 mRNA和蛋白的表达，应用免疫细胞化学检测培养神经元Ⅲ型β-微管蛋白的表达。结果与正常培养的神经元相比，轴突抑制物共培养的神经元细胞Ⅲ型β-微管蛋白表达明显降低（P〈0．01），E3B1 mRNA和蛋白的表达均显著升高（P〈0．01）。结论E3B1基因的表达变化与神经元细胞轴突的生长抑制有密切关系。     

钙离子结合蛋白S100A16对胃癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨钙结合蛋白S100A16在胃癌组织和细胞中的表达,及其对胃癌细胞SGC?7901增殖、迁移、侵袭能力的影响。方法：应用免疫组织化学染色法检测S100A16在胃癌和相应癌旁组织中的差异表达。应用Western blot检测正常胃上皮细胞GES?1以及胃癌细胞MGC?803和SGC?7901中S100A16的表达水平。将S100A16高表达质粒和干扰质粒分别转染至人胃癌细胞株SGC?7901中,用Western blot检测各组细胞中S100A16的表达。采用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B,SRB）比色法和克隆形成实验检测细胞的增殖能力。采用划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。结果：在胃癌组织及胃癌细胞中,S100A16的表达量明显高于相应癌旁组织及正常胃上皮细胞。SRB染色和克隆形成实验显示,过表达S100A16会增加SGC?7901细胞的增殖能力,敲低S100A16后增殖能力降低。划痕实验Transwell实验显示,过表达S100A16会增加SGC?7901细胞的迁移和侵袭能力,敲低S100A16则会降低。免疫共沉淀实验显示在胃癌细胞SGC?7901中,S100A16与YBX?1存在结合。结论：胃癌组织及细胞中S100A16的表达明显上调,S100A16在胃癌中的异常表达可能是由于与YBX?1的相互结合,进而促进胃癌细胞增殖、迁移、侵袭从而影响胃癌的发生发展。     

干扰PTEN基因表达对人宫颈癌细胞系HeLa细胞周期的影响及相关机制研究

目的：研究干扰PTEN表达对HeLa细胞细胞周期分布的影响并探索其相关机制。方法：以人宫颈癌细胞系HeLa为实验对象,利用慢病毒转染技术导入PTEN?特异性短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA）干扰PTEN表达,采用实时荧光定量PCR和Western blot技术检测转染前后PTEN及细胞周期蛋白Cyclin B1 mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞周期分布变化,蛋白酶体抑制剂MG?132处理细胞后利用Western blot检测Cyclin B1蛋白稳定性变化。结果：PTEN shRNA作用HeLa细胞后,PTEN mRNA及蛋白表达水平较对照组显著降低;下调PTEN表达后,细胞周期中G2/M期细胞比例与对照组相比明显增加,Cyclin B1蛋白表达水平下降,但Cyclin B1 mRNA水平与对照组相比无明显差异。MG?132处理细胞后,PTEN干扰组中Cyclin B1蛋白表达与未处理组相比明显增加。结论：在HeLa细胞中干扰PTEN表达会导致细胞周期阻滞于G2/M期,这可能与细胞周期相关蛋白Cyclin B1表达水平降低有关。     

体外培养人眼小梁细胞血红素氧合酶-1的表达及其抗氧化损伤作用

目的探讨体外培养人眼小梁细胞是否存在血红素氧合酶-1（HO-1）的表达及其抗氧化损伤作用。方法体外培养人眼小梁细胞，应用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）检测小梁细胞中HO-1 mRNA的表达，免疫组织化学和Western blot方法对HO-1蛋白进行检测。向细胞培养液中加入H2O2，RT—PCR和Western blot检测小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的变化。分别预先加入HO-1诱导剂氯化血红素（Hemin）和抑制剂锌原卟啉Ⅸ（ZnPP—Ⅸ）1h后，通过MTT法检测小粱细胞在400μmol／L H2O2作用时的存活率。结果人眼小梁细胞存在HO-1 mRNA和蛋白。H2O2对小梁细胞HO-1 mRNA和蛋白的诱导呈浓度依赖性。Hemin可浓度依赖性地提高小梁细胞在H2O2作用时的存活率，HO-1抑制剂ZnPP—Ⅸ则浓度依赖性地降低小梁细胞在H2O2作用时的存活率。结论人眼小梁细胞存在HO—1，并可被H2O2所诱导。HO-1表达升高可提高小梁细胞抗氧化损伤的能力。     

miR⁃590⁃3p对甲状腺乳头状癌的抑制作用研究

目的：探究miR?590?3p在甲状腺乳头状癌进展中的作用。方法：利用RT?PCR检测甲状腺乳头状癌患者标本及其细胞系中miR?590?3p的表达。利用CCK?8、EdU、划痕、Transwell实验以及细胞流式技术检测miR?590?3p对细胞相关功能的影响。Western blot检测上皮细胞?间充质转化（epithelial?mesenchymal transition,EMT）途径相关蛋白表达量的变化。结果：在甲状腺乳头状癌组织及细胞系中miR?590?3p的表达量明显低于癌旁组织和正常甲状腺滤泡上皮细胞。与对照组相比,干扰miR?590?3p明显提升TPC?1细胞的增殖活性（P < 0.01）,过表达miR?590?3p则降低K?1细胞的增殖活性（P < 0.01）。干扰miR?590?3p可增加TPC?1细胞的迁移与侵袭能力,抑制细胞凋亡（P < 0.01）,过表达miR?590?3p则降低K?1细胞的迁移与侵袭能力,促进细胞凋亡（P < 0.01）。同时可以抑制EMT相关蛋白的表达。结论：miR?590?3p在甲状腺乳头状癌的发生发展中发挥抑癌基因的作用,可能为甲状腺乳头状癌的治疗提供帮助。     

缬沙坦对糖尿病小鼠肾小球组织Notch通路活化及足细胞丢失的影响

目的探讨应用缬沙坦对糖尿病小鼠肾小球组织中Notch通路活化及足细胞丢失的影响。方法建立糖尿病小鼠模型给予缬沙坦治疗,观察小鼠肾小球细胞凋亡及足细胞脱落情况,采用Western blot检测Notch胞内域1(Notch intracellular domain 1,NICD1)、Hesl、Heyl、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表达情况,Real-time PCR检测Hesl和Heyl mRNA表达情况。结果缬沙坦可降低糖尿病小鼠肾小球细胞凋亡及足细胞脱落,减少糖尿病小鼠肾小球组织中NICDl、Hesl、Heyl、Bax、cleaved caspase-3的表达,增加Bcl-2表达(P<0.05)。结论缬沙坦可通过抑制糖尿病小鼠肾小球组织中Notch通路的活化,减少足细胞凋亡和脱落。     

c-myc基因与辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤的关联性分析

目的：研究辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤c-myc基因表达的变化,为阐明辐射致癌机制提供理论依据。方法：采用X射线（剂量率0.287 Gy?min-1,总剂量7 Gy）照射BALB/c小鼠,建立小鼠胸腺淋巴瘤模型,6个月后处死小鼠,取辐射诱发小鼠胸腺淋巴瘤和正常胸腺,分别提取总RNA、合成cDNA和提取总蛋白,采用实时定量PCR方法和Western blotting方法分别检测辐射诱发胸腺淋巴瘤和正常胸腺组织c-myc基因mRNA和蛋白表达。结果：经实时定量PCR检测,胸腺淋巴瘤和正常胸腺组织c-myc基因mRNA相对表达量分别为9.16±4.66和1.16±0.54,两组比较差异有显著性（P<0.01）;Western blotting检测结果显示,胸腺淋巴瘤c-myc基因蛋白表达较正常胸腺组织明显增高。结论：c-myc基因与辐射诱发
小鼠胸腺淋巴瘤有关联,可能是辐射致癌的易感基因。     

沉默GCN5或SOX9基因对Thy⁃1肾炎大鼠肾组织中TGF⁃β1生成的影响

目的：研究沉默大鼠肾组织中通用控制核苷酸合成5（general control nonderepressible 5,GCN5）基因、性别决定区Y框蛋白9（SRY related HMG box?9,SOX9）基因对Thy?1肾炎（Thy?1 nephritis,Thy?1N）大鼠肾组织内转化生长因子?β1（transforming growth factor?β1,TGF?β1）生成的影响。方法：分别用慢病毒（lentivirus,LV）包装GCN5和SOX9发夹状小干扰RNA（shRNA）,即制备LV?shGCN5和LV?shSOX9重组病毒。然后行大鼠肾动脉灌注术将LV?shGCN5和LV?shSOX9分别导入大鼠肾脏,再经尾静脉注射兔抗大鼠胸腺细胞抗血清（anti?thymocyte serum,ATS）复制Thy?1N模型。在注射ATS后3 h,取大鼠肾组织,用RT?PCR和Western blot检查各组大鼠肾组织中GCN5和SOX9的mRNA及蛋白表达水平,以验证干扰效果及GCN5、SOX9对TGF?β1产生的影响。结果：利用肾动脉灌注术将LV?shGCN5或LV?shSOX9重组病毒导入大鼠肾组织后,不仅能有效沉默相应的靶基因,而且还能下调TGF?β1的表达。结论：沉默大鼠肾组织中GCN5或SOX9基因后能显著抑制Thy?1N大鼠肾内TGF?β1的生成。