PHA RMA COKINETICS OF CUPRIC－BIS（SALICYLALDEHYDE－2－FURA NTHIOCA RBOXY－HYDRAZONATE） DICHLORIDE（CSFTCH） IN RABBITS

ＰＨＡＲＭＡＣＯＫＩＮＥＴＩＣＳＯＦＣＵＰＲＩＣ－ＢＩＳ（ＳＡＬＩＣＹＬＡＬＤＥＨＹＤＥ－２－ＦＵＲＡＮＴＨＩＯＣＡＲＢＯＸＹ－ＨＹＤＲＡＺＯＮＡＴＥ）ＤＩＣＨＬＯＲＩＤＥ（ＣＳＦＴＣＨ）ＩＮＲＡＢＢＩＴＳ￥ＧａｏＹｕｎｓｈｅｎｇ；ＺｈｕＹｕｙｕｎ（...     

EXPRESSION OF TGF－β_1，PDGF AND IGF－1 mRNA IN LUNG OF BLEOMYCIN－A_5－INDUCED PULMONARY FIBROSIS IN RATS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＧＦ－β１，ＰＤＧＦＡＮＤＩＧＦ－１ｍＲＮＡＩＮＬＵＮＧＯＦＢＬＥＯＭＹＣＩＮ－Ａ５－ＩＮＤＵＣＥＤＰＵＬＭＯＮＡＲＹＦＩＢＲＯＳＩＳＩＮＲＡＴＳＬｉＨａｉｃｈａｏ李海潮，ＨｅＢｉｎｇ何冰，ＱｕｅＣｈｅｎｇｌｉ阙呈立ａｎｄＷ...     

INCREASED EXPRESSION OF PDGF AND C－MYC GENES IN LUNGS AND PULMONARY ARTERIES OF PULMONARY HYPERTENSIVE RATS INDUCED BY HYPOXI

ＩＮＣＲＥＡＳＥＤＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＰＤＧＦＡＮＤＣ－ＭＹＣＧＥＮＥＳＩＮＬＵＮＧＳＡＮＤＰＵＬＭＯＮＡＲＹＡＲＴＥＲＩＥＳＯＦＰＵＬＭＯＮＡＲＹＨＹＰＥＲＴＥＮＳＩＶＥＲＡＴＳＩＮＤＵＣＥＤＢＹＨＹＰＯＸＩＡ￥ＣａｉＹｉｎｇｎｉａｎ；（蔡英年...     

ANDROGEN REPRESSION OF CYTOKERATIN GENE EXPRESSION DURING RAT PROSTATE DIFFERENTIATION：EVIDENCE FOR AN EPITHELIAL STEM CELL－A

ＡＮＤＲＯＧＥＮＲＥＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＣＹＴＯＫＥＲＡＴＩＮＧＥＮＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＤＵＲＩＮＧＲＡＴＰＲＯＳＴＡＴＥＤＩＦＦＥＲＥＮＴＩＡＴＩＯＮ：ＥＶＩＤＥＮＣＥＦＯＲＡＮＥＰＩＴＨＥＬＩＡＬＳＴＥＭＣＥＬＬ－ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤＭＡＲＫＥ...     

DIFFEKENTIAL CALCIUM－BINDING ABILITY OF FREE AND BOUND PROTEINS－SUGGESTIONOFAN0VELPROTEINS／C4B－BINDINGPKOTE

ＤＩＦＦＥＫＥＮＴＩＡＬＣＡＬＣＩＵＭ－ＢＩＮＤＩＮＧＡＢＩＬＩＴＹＯＦＦＲＥＥＡＮＤＢＯＵＮＤＰＲＯＴＥＩＮＳ－ＳＵＧＧＥＳＴＩＯＮＯＦＡＮ０ＶＥＬＰＲＯＴＥＩＮＳ／Ｃ４Ｂ－ＢＩＮＤＩＮＧＰＫＯＴＥＩＮ－ＢＩＮＤ－ＩＮＧＦＡＣＴＯＲＩＮＨＵＭＡＮＰ...     

PROTECTIVE EFFECT OF GERMANIUM-AMINO ACID ON RAT MYOCARDIAL CELLS IN CULTURE TO OXYGEN AND GLUCOSE DEPRIVATION

ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥＥＦＦＥＣＴＯＦＧＥＲＭＡＮＩＵＭ－ＡＭＩＮＯＡＣＩＤＯＮＲＡＴＭＹＯＣＡＲＤＩＡＬＣＥＬＬＳＩＮＣＵＬＴＵＲＥＴＯＯＸＹＧＥＮＡＮＤＧＬＵＣＯＳＥ　ＤＥＰＲＩＶＡＴＩＯＮＬｉｎＨｕａ（林华），ＷｅｉＰｉｊｉｎｇ（魏丕敬），ＧｕＰ...     

THE EXPRESSION OF C－erbB－1 AND C－erbB－2ONCOGENES IN BASAL CELL CARCINOMA ANDSQUAMOUS CELL CARCINOMA OF SKIN

ＴＨＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＣ－ｅｒｂＢ－１ＡＮＤＣ－ｅｒｂＢ－２ＯＮＣＯＧＥＮＥＳＩＮＢＡＳＡＬＣＥＬＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＡＮＤＳＱＵＡＭＯＵＳＣＥＬＬＣＡＲＣＩＮＯＭＡＯＦＳＫＩＮＬｉｕＢａｏｊｕｎ；（刘宝军），ＺｈａｎｇＨａｉｔａｏ；（张海涛...     

EXPRESSION OF HLA－CLASS Ⅱ GENES OF IDDM PATIENTS ON THE SURFACE OF THE LTK~－ CELLS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＨＬＡ－ＣＬＡＳＳⅡＧＥＮＥＳＯＦＩＤＤＭＰＡＴＩＥＮＴＳＯＮＴＨＥＳＵＲＦＡＣＥＯＦＴＨＥＬＴＫ~－ＣＥＬＬＳ￥ＷａｎｇＨｅｎｇ（王姮）ａｎｄＳｕｎＱｉ（孙琦）（ＰＵＭＣＨｏｓｐｉｔａｌ，ＣＡＭＳ＆ＰＵＭＣ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１?..     

TANDEM REPEATING OF THE EXPRESSION CARTRIDGE──A NOVEL STRATEGY TO ENHANCE THE EXPRESSION EFFICIENCY OF CLONED GENE IN ESCHERI

ＴＡＮＤＥＭＲＥＰＥＡＴＩＮＧＯＦＴＨＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＣＡＲＴＲＩＤＧＥ──ＡＮＯＶＥＬＳＴＲＡＴＥＧＹＴＯＥＮＨＡＮＣＥＴＨＥＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹＯＦＣＬＯＮＥＤＧＥＮＥＩＮＥＳＣＨＥＲＩＣＨＩＡＣＯＬＩＬｉｎＹｉｎｇ（林...     

EXPRESSION OF TISSUE－TYPE PLASMINOGENACTIVATOR IN SMOOTH MUSCLE CELLS OF INJUREDILIAC ARTERIES IN RABBITS

ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮＯＦＴＩＳＳＵＥ－ＴＹＰＥＰＬＡＳＭＩＮＯＧＥＮＡＣＴＩＶＡＴＯＲＩＮＳＭＯＯＴＨＭＵＳＣＬＥＣＥＬＬＳＯＦＩＮＪＵＲＥＤＩＬＩＡＣ　ＡＲＴＥＲＩＥＳＩＮＲＡＢＢＩＴＳＭａＸｉａｏｌｉ；（马晓莉），ＨｕａｎｇＷｅｎｙｉｎｇ；（黄文...     

构建靶向杀伤白血病细胞的新型重组白细胞介素6D24-PE40KDEL融合蛋白

目的　构建能高度特异地靶向杀伤高表达白细胞介素 6受体 (IL 6R)白血病细胞的新型重组IL6 PE4 0KDEL(绿脓杆菌外毒素 )融合蛋白。方法　通过定点诱变将绿脓杆菌外毒素PE4 0基因羧基端最后 5个氨基酸REDLK替换成内质网蛋白滞留序列 (KDEL) ,采用重叠延伸的基因融合技术将N 末端缺失 2 4个氨基酸的人IL6 (IL6D2 4 )cDNA与PE4 0KDEL基因进行重组融合构建 ,利用HB10 1/pBV2 2 0表达系统实现该新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL外毒素融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达 ,经MonoQ柱层析纯化后 ,以四甲基偶氮唑类似物 (MTS)法检测IL6D2 4 PE4 0KDEL的靶向杀伤活性。结果　构建的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到 4 0 %左右 ;经包涵体分离、复性、变性及纯化所得该融合蛋白纯度 >95 % ;纯化的融合蛋白能与IL6抗体及绿脓杆菌外毒素A(PEA)抗体发生特异性结合 ;IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL6R的U937细胞 ,IC5 0约为 2 5 0ng/ml,而对不表达IL6R的人T淋巴白血病细胞系则无杀伤作用。结论　成功构建了具有靶向杀伤高表达IL6R白血病细胞的新型重组IL6D2 4 PE4 0KDEL融合蛋白 ,为深入地探索利用IL6 /IL6R系统介导靶向治疗高表达IL6R白血病奠定了坚实的基础。     

IL-18-PE38重组免疫毒素的原核表达及其鉴定

目的构建绿脓杆菌外毒素PE38融合鼠IL-18基因的原核表达载体并鉴定其表达。方法首先采用RT-PCR获得小鼠IL-18基因，再通过适当的酶切及连接反应，构建小鼠IL-18与PE38融合基因的原核表达载体PRKL-IL-18PE38，重组载体经限制性内切酶、PCR及DNA序列测定等证实连接片段的正确性后，再转染感受态大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达，表达产物用SDS-PAGE和蛋白免疫印迹法分别测定其相对分子质量及特异性。结果酶切分析、PCR鉴定和DNA测序等证实，IL-18-PE38免疫毒素的原核表达载体被成功构建，重组载体在大肠杆菌中获得了稳定的表达，表达产物的相对分子质量与预期值一致，且所表达蛋白可被抗IL-1818的特异性抗体所识别。结论IL-18-PE38融合基因原核表达载体的获得，为进一步研究其对Th1细胞的靶向细胞毒性及临床应用奠定了基础。     

IL-2-PE66~(4Glu)融合蛋白生物学活性测定

ＩＬ－２－ＰＥ６６４Ｇｌｕ是由白介素２同改构的绿脓杆菌外毒素通过基因融合构成的嵌合蛋白。我们研究了它对ＣｏｎＡ诱导的小鼠脾母细胞和ＰＨＡ激活的人外周血淋巴细胞的细胞毒活性，结果显示其半数抑制剂量（ＬＤ５０）分别是５０ｎｇ／ｍｌ和２０ｎｇ／ｍｌ，而对ＩＬ－２Ｒ细胞则无明显的作用；同时，探讨了ＩＬ－２的浓度、ＭＴＴ浓度及作用时间对实验结果的影响     

白细胞介素2-重组毒素对活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应

利用ＰＣＲ－Ｃｌｏｎｉｎｇ技术和ＤＮＡ重组技术,构建了两类ＩＬ－２－ＰＥ４０＇嵌合基因的表达载体,分别由ＩＰＴＧ和温度（４２℃）诱导表达。在对表达产物进行了酶切位点和片段大小、电泳迁移率、分子量的初步鉴定后,又对融合蛋白的白细胞介素２（ＩＬ－２）和ＰＥ４０＇组分的抗原性进行了ＥＬＩＳＡ鉴定。从菌体蛋白中初步分离纯化了重组毒素,并测定其对细胞表面表达ＩＬ－２受体的活化Ｔ淋巴细胞的靶向杀伤效应及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果表明,ＩＬ－２－ＰＥ４０＇融合蛋白确实对ＩＬ－２Ｒ＋细胞具有明显的靶向杀伤效应并呈剂量依赖关系,与对照组相比,随着保温时间的延长（６、２４、４８ｈ）,杀伤效应趋于增强（Ｐ＜０．０５）。混合淋巴细胞培养结果显示,该融合蛋白对单相和双相反应均有不同程度的免疫抑制作用（Ｐ＜０．０１）。     

新型重组免疫抑制蛋白B7-2-L-PE40KDEL的分子构建与生物活性及结构特性

目的：构建重组B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,特异性杀伤CD28高表达的T细胞,选择性阻断T淋巴细胞活化过程中的B7：CD28／CTLA－4共刺激信号系统,由此诱导免疫耐受,特异性防治移植物抗宿主疾病（GVHD）和宿主抗移植物疾病（HCGD）。方法：采用基因融合序列重叠延伸（SOE）策略,构建新型重组pRSETA-B7-2-L-PE40KDEL外毒素融合蛋白的原核表达载体,实现融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,利用亲和层析等方法进行蛋白质纯化。对该融合蛋白的结构特征诸如等电点、柔性等进行模拟分析。采用MTT法对其特异性杀伤高表达CD28受体的T细胞的活性进行测定。结果：构建并高效表达了B7－2－L－PE40KDEL融合蛋白,所获融合蛋白的纯度大于95％。该融合蛋白的结构特征模拟分析的结果显示,其柔性及抗原性、亲水性表位均未显著改变。活性测定显示,该重组融合蛋白能有效特异性地杀伤高表达CD28的人T淋巴瘤细胞系,而对未来表达CD28的人白血病细胞系则无任何杀伤。结论：具有靶向性免疫抑制活性的新型重组B7－2－L-PE40KDEL毒素融合蛋白的构建、表达对特异性防治GVHD和HVGD可能产生积极的影响。     

抗肝癌单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40的构建及其导向作用的实验研究

目的构建单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40并探讨其导向细胞毒作用.方法采用亚克隆技术,首先将HAb25(scFv)与绿脓杆菌外毒素基因突变子PE40,在ply5载体上构建HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;再将其亚克隆入pBV220原核表达载体中, 转化DH5α宿主菌,温度诱导表达;SDS-PAGE观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化方法;间接免疫荧光染色鉴定HAb25(scFv)-PE40与肝癌细胞结合的特异性;体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择性靶细胞杀伤活性.结果限制性酶切图谱和序列分析证实在ply5载体上成功地构建了HAb25(scFv)-PE40单链免疫毒素基因;该单链免疫毒素基因在pBV220载体中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的43.3%;纯化后的HAb25(scFv)-PE40间接免疫荧光染色显示具有与亲本抗体HAb25相同的抗原结合特性;导向细胞毒实验结果显示HAb25(scFv)-PE40具有明确的选择性靶细胞杀伤活性. 结论已成功构建和高效表达了单链免疫毒素HAb25(scFv)-PE40,该免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性 (P＜0.001),为其进一步的基础和临床应用研究奠定了基础.     

Effects of chimeric molecule of recombinant Dsg3EC1-2 with toxin PE40 on T and B lymphocytes in Pemphigus Vulgaris

Objective:To observe the effects of the recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 on T and B lymphocytes isolated from Pemphigus Vulgaris (PV) patients to further study its biological therapeutic function for PV. Methods :Recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 was first identified, expressed and purified, and then its effects on T and B lymphocytes of PV patients in vitro were detected and quantified by ELISPOT assay and MTT assay. Results :The purity of the expressed protein Dsg3EC1-2PE40 was up to 80%. In ELISPOT assay, with Dsg3EC1-2PE40, the overall number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies among PV patients was only about 60% of the comparable number with Dsg3EC1-2. The proliferation of T cells of PV patients was inhibited markedly by Dsg3EC1-2PE40. There was significant difference between the different groups with Dsg3EC1-2PE40 and Dsg3EC1-2. Conclusion:The recombinant chimeric toxin Dsg3EC1-2PE40 decrease the number of B cells that produce anti-Dsg3 antibodies in PV patients and can inhibit or kill T cells of PV patients in vitro.     

特异性靶向的戊肝嵌合DNA疫苗的构建及免疫效果研究

目的 制备特异性靶向的嵌合DNA疫苗，并探讨其诱导机体产生免疫应答的效果。方法 用基因重组技术构建细胞毒T淋巴细胞抗原4（CTLA4）与戊肝病毒抗原HEVE2嵌合基因的真核表达质粒。同时构建不带CTLA4的pHEVE2作为平行对照质粒，体外转染COS-7细胞，Western blotting法检测细胞培养上清表达并且 物；于BALB/c小鼠皮内注射，每隔2周1次，共免疫3次，100μg/次，于免疫的第3、5和10周ELISA检测抗体效价。结果 获得pHEVE2和pCTLA4-HEVE2嵌合基因真核表达质粒，测序证实各连接点阅读框序列正确；体外转染COS-7细胞，证明真核质粒以分泌形式表达；接种pCTLA4-HEVE2小鼠产生高滴度的特异性抗HEVE2抗体，比接种pHEVE2的对照组高50-100倍；pCTLA4-HEVE2诱导高水平的IgG2a,IgG2bTh1型抗体和IgG1Th2型抗体应答，pHEVE2则以IgG1Th2型抗体应答为主。结论 CTLA4-HEVE2嵌合DNA疫苗有效地增强动物对HEVE2抗原的免疫应答，为进一步研究抗原靶向性的嵌合DNA疫苗奠定基础。     

Ephrin-A1、Ephrin-B1融合蛋白的构建、表达和活性测定

目的 克隆并合成Eph受体的两个主要配体ephrin-A1和ephrin-B1的融合蛋白。方法 利用RT-PCR技术，分别扩增了ephrin-A1、ephrin-B1胞外序列和小鼠IgG2b的Fc序列，将其连接后，插入pAlterMax表达载体，得到两个重组子pAlterMax-ephrin-A1-Fc和pAlterMax-ephrin-B1-Fc，经序列测定，确认无突变产生后转染至293T细胞，使之表达分泌型ephrin-A1-Fc和ephrin-B1-Fe可溶性融合蛋白，并利用蛋白A琼脂糖凝胶纯化。利用免疫沉淀和Westernblot检测了ephrin-A1-Fc和ephrin-B1-Fc的相应受体的活性。结果 Ephrin-A1和ephrin-B1融合蛋白可以成功刺激其相应的Eph受体，使之发生磷酸化。结论 制备得到的两个融合蛋白具有相应的生物活性，为进一步研究Eph受体酪氨酸激酶家族的功能打下了基础。     

人转铁蛋白受体特异性单克隆抗体的研制及其初步鉴定

目的 建立能分泌人转铁蛋白受体(TfR)特异性抗体的杂交瘤细胞株,并对其分泌的抗体进行初步鉴定. 方法 将人肝癌细胞株HepG2分离纯化的TfR蛋白,采用常规法免疫BALB/C小鼠;采用间接ELISA法测定免疫血清抗体效价;采用常规聚乙二醇(PEG)介导法,将免疫小鼠脾脏细胞与小鼠骨髓瘤细胞株SP2/0融合,用含HAT培养基筛选杂交瘤细胞;采用间接ELISA和Cell-ELISA法筛选TfR抗体阳性的杂交瘤细胞;采用有限稀释法进行克隆和多次亚克隆以建立稳定分泌TfR抗体的杂交瘤细胞株;将杂交瘤细胞注射经石蜡油致敏的小鼠腹腔以产腹水抗体,采用硫酸-辛酸法纯化腹水抗体;采用秋水仙素处理,计数细胞染色体数以进行杂交瘤细胞鉴定;采用免疫荧光染色法和Western blot法初步鉴定抗体与细胞表面或细胞总蛋白中TfR的结合. 结果 提取纯化的人TfR蛋白免疫小鼠获得成功,其1∶5 000稀释的血清抗体光吸收值(A490)是对照小鼠血清(1∶200稀释)的16倍以上;细胞融合率为42.22%,其中TfR抗体阳性孔20个,抗体阳性率为13.16%;抗体阳性孔B6和孔E8中杂交瘤细胞经克隆和亚克隆后建立起稳定分泌抗体的细胞株;B6杂交瘤细胞染色体数量位于56~60条之间,应为B细胞和SP2/0细胞融合而来;腹水抗体染色使HepG2细胞表面出现明亮荧光,并且能使HepG2细胞提取的总蛋白电泳图谱在95 000处出现清晰条带,表明该杂交瘤细胞分泌的抗体能特异性结合TfR蛋白.结论 分泌抗人TfR抗体的小鼠杂交瘤细胞株已被筛选和建立;其分泌的抗体能与HepG2细胞的TfR特异性结合.