固化DNA纳米胶体金探针杂交目视化比色检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的实验研究

目的 建立以纳米金颗粒为载体的DNA探针杂交方法,快速、特异地检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)特异性mecA基因.方法 采用直径为60nm的胶体金纳米颗粒与巯基修饰的2条mecA基因寡核苷酸探针共价结合,制备成固化的DNA 金纳米探针.将金纳米探针与其互补的mecA基因靶序列在液相中杂交,通过调节2条探针的比例和不同的检测方法对杂交反应条件和产物检测进行优化.结果 金纳米探针呈稳定的酒红色,与互补的靶序列DNA进行液相杂交后颜色呈现明显的蓝色变化.当2条探针不对称加入时颜色变化更明显.采用反向色谱反应盘检测反应产物也可获得满意的效果.产物离心后检测灵敏度可达2.36 fmol/L.结论 固化纳米胶体金探针杂交技术具有快速简便的特点,有望为MRSA的快速检测提供一种新的方法.     

纳米金颗粒质量放大压电DNA传感器频移信号的研究

目的探讨纳米金颗粒质量放大压电DNA传感器频移信号的可行性,以进一步提高检测灵敏度。方法将巯基化的单链DNA探针固定于压电DNA传感器石英晶体金膜表面,封闭后加入合成的生物素化的互补靶DNA与之进行杂交反应,最后用5nm粒径的链亲和素标记的胶体金追加标记于杂交后的生物素化的靶DNA上,以增加石英晶振金膜表面的质量负载,从而降低石英晶振的响应频率,进一步放大频移信号。结果检测终浓度为10-8mol/L的阳性靶序列时杂交反应前后频移为(12.7±5.5)Hz,加入终浓度为9%的纳米金颗粒放大后总频移为(126±2.6)Hz,后者显著高于前者(P<0.01)。另外,对不同终浓度的阳性靶序列检测后发现,频移与其终浓度的lg值之间具有显著的线性关系,相关系数为0.974,而且最低检出限达到了10-12mol/L。结论实验结果表明该方法可以显著放大压电DNA传感器的频移信号,从而进一步提高压电DNA传感器检测的灵敏度。     

纳米金标记法在HIV检测中的应用

目的 制备金纳米颗粒人类获得性免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)基因探针,研究其在检测HIV中的应用.方法 采用枸橼酸还原金氯酸法制备Au纳米颗粒.Au纳米颗粒通过Au-S共价键与烷烃硫醇修饰的寡核苷酸结合制备检测探针.检测探针通过与靶序列在液相中杂交,形成Au纳米颗粒聚集体,采用电镜观察结果.结果 制备的Au纳米颗粒粒径为(12±5)nm,分散良好,在520nm有最大吸收峰,经寡核苷酸修饰后,最大吸收峰改变为524 nm.液相杂交后采用电镜观察可检测低至1 fmol/L的合成靶序列.结论 Au纳米颗粒HIV cDNA基因探针,通过液相杂交技术检测HIV cDNA,可以缩短检测窗口期,做到早期诊断和预防.     

纳米金增敏 cTnI 金标免疫层析试验研究

目的：研究一种纳米金增强心肌肌钙蛋白I（cTnI）金标免疫层析试验灵敏度的试验方法。方法以血清cTnI金标免疫层析试验为基础,以改性溶液做预处理,盐酸羟胺还原氯金酸制备纳米金颗粒,使金标抗原抗体反应复合物的颗粒增大,金标处颜色加深,显色信号增强,提高检测灵敏度,并以此做批内和日间重复性检测。结果盐酸羟胺还原氯金酸增敏cTnI金标免疫层析试验,较增敏前检测灵敏度提高16倍,在10～15 min内可完成,批内和日间重复性较好,试验结果快速、稳定、可靠。结论盐酸羟胺还原氯金酸制备纳米金颗粒在一定改性溶液环境下,对人血清cTnI金标免疫层析试验有一定增敏效果,重复性较好,结果稳定可靠,可为适时、快速、灵敏的现场检测方法提供一定技术支持。     

金电极上自组装DNA传感器的研究

目的:在金电极表面自组装DNA,制备DNA传感器.方法:以双层组装技术,先进行-SH化合物自组装,得到自组装单分子层,再在SAM上吸附固定DNA,制备DNA修饰电极,用电化学分析法对其组装过程及活性进行表征.结果:基于构建的新型电极,表明双层膜组装方法是组装DNA分子的有效手段,可进一步研究DNA的电化学特性及与其他分子的相互作用.结论:该电极显示良好灵敏度和稳定性.     

聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体制备及体外实验研究

目的 制备聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体并研究其理化性质的表征参数和体外转染效率.方法 通过化学还原法制备聚乙烯亚胺修饰的纳米金基因载体,用绿色荧光蛋白质粒(pAcGFP-N1)做报告基因,纳米基因载体可通过静电吸附的方式结合质粒DNA.用紫外分光光度计检测其吸收光谱,用透射电镜观察其形态特征,激光粒度分析仪测定其粒度分布、表面电位(Zeta电位),1％琼脂糖凝胶电泳检测该基因载体与质粒DNA的结合稳定性,CCK-8实验检测聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体及DNA-纳米金复合物对HEK293细胞的细胞毒性作用,通过荧光显微镜观察聚乙烯亚胺纳米基因载体介导pAcGFP-N1在体外培养的HEK293细胞中的表达,并分析其转染效率.结果 聚乙烯亚胺还原氯金酸可以得到带正电荷的纳米颗粒,呈单分散球形分布,其粒径为(12.3 ±3.3)nm.在pH =7.2时,Zeta电位为+(29.7±5.1)mV.1％琼脂糖凝胶电泳结果表明,当纳米金/质粒DNA≥0.5时,质粒DNA可完全结合到纳米金表面.体外转染实验表明,聚乙烯亚胺修饰纳米金基因载体能介导pAcGFP-N1转染HEK293细胞并在细胞中表达绿色荧光蛋白,其转染效率可达25％.结论 聚乙烯亚胺修饰纳米金是一种新型非病毒基因载体,具有转染效率高、对细胞毒性小等优势.     

刺激响应变形纳米载药体系的构建及性能研究

目的 构建肿瘤微环境响应释放的可变形金纳米颗粒载药体系。方法 利用直径5、13nm两种尺寸的金纳米颗粒、pH敏感的三链体脱氧核糖核酸(triplex DNA)以及抗肿瘤药物多柔比星(doxorubicin hydrochloride, DOX),通过冷冻法组装出载药聚集体结构并对该体系的有效性进行表征。结果 所组装的聚集体中有75%的颗粒的粒径（直径）在50~80nm,大小适宜,易于被细胞内吞,可有效载带药物,在pH=4.5时,载药聚集体发生解体,89.6%的颗粒直径为18~32nm,释放出相较于中性条件下3倍浓度的DOX（P<0.01）并对肿瘤细胞有明显杀伤效果。结论 此可变形的金纳米载药聚集体结构成功的完成药物的载带与释放,达到了可控释药,降低正常组织损伤的目的,为新一代刺激响应型纳米载带系统地构建提供了新思路。     

HBV共价闭合环状DNA功能化纳米颗粒制备及鉴定

目的 制备HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)功能化磁性纳米颗粒,为进一步建立富集分离和检测cccDNA方法奠定基础. 方法 通过亲和素修饰纳米颗粒表面,利用亲和素与生物素的亲和作用,将亲和素修饰的纳米颗粒与生物素标记的cccDNA特异性探针偶联,制备cccDNA功能化纳米颗粒,最后用cccDNA探针完全互补的荧光标记序列与功能化纳米颗粒反应,鉴定其特性. 结果 亲和素修饰的纳米颗粒能结合生物素最大量为1 205 ng/mg;通过与亲和素作用,生物素标记cccDNA特异性探针固定在磁性纳米微粒表面,其最大结合生物素标记探针量为3.2×10-9 mol/mg;cccDNA功能化纳米颗粒可捕获与其互补的荧光标记寡核苷酸序列,其最大捕获量为2.0×10-9mol/mg,并能通过变性释放出保持生物学活性游离的荧光标记寡核苷酸序列. 结论 成功构建的cccDNA功能化纳米微粒能有效捕获与其互补的序列,其捕获量能达到cccDNA的分离提取要求.     

金属纳米团簇荧光探针联合新型纳米材料在核酸检测领域中的应用现状

核酸检测技术在临床诊断、基因治疗和生物医学发展中发挥着重要的作用。金属纳米团簇(MNCs)荧光探针是一种具有极大应用潜力的荧光探针，最常用的有银纳米团簇(Ag NCs)荧光探针和铜纳米团簇(Cu NCs)荧光探针，可用于检测DNA和miRNA。新型纳米材料，如氧化石墨烯、纳米碳氧化物、金纳米颗粒、二硫化钨纳米片能够猝灭多种荧光团的荧光信号。利用新型纳米材料对单链DNA和双链DNA的吸附能力具有巨大差异的特性，可设计出“turn on”型检测平台。此外，将新型纳米材料如二氧化硅纳米颗粒、磁性微球等，与MNCs荧光探针联用时，可获得荧光放大效应。本文总结了近年来在核酸检测方面MNCs荧光探针与纳米材料联用的各种检测平台，分析这些MNCs荧光探针检测平台的设计原理、荧光行为及检测能力等，为疾病诊断和病理研究的分子工具提供参考。     

脑脊液中微量的可溶型晚期糖基化终末产物受体检测方法建立与初步应用

目的 利用电化学和纳米金颗粒相结合的技术检测脑脊液中的可溶型晚期糖基化终末产物受体(Srage)表达水平.方法 依次利用肝素和特异性抗体的层析柱纯化Srage蛋白,把纯化的蛋白作为标准品检测电化学和纳米金颗粒相结合技术的准确性和灵敏度,建立稳定的检测方法后,检查脑脊液中Srage的表达.结果 重组Srage蛋白经2次纯化后,纯度超过95%.利用电化学和纳米金颗粒相结合的技术检测标准品的标准曲线,其R2值达到了0.96.利用其检测脑脊液样本证明Srage确实在脑脊液中表达,其表达量在Pg水平.结论 Srage存在于脑脊液中,电化学和纳米金颗粒相结合的技术可作为更灵敏的检测方法应用于临床及科研中.     

The detection of HBV DNA with gold nanoparticle gene probes

Objective:Gold nanoparticle Hepatitis B virus (HBV) DNA probes were prepared, and their application for HBV DNA measurement was studied. Methods:Alkanethiol modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA gene probes, through covalent binding of Au-S. By using a fluorescence-based method, the number of thiol-derivatized, single-stranded oligonucleotides and their hybridization efficiency with complementary oligonucleotides in solution was determined. With the aid of Au nanoparticle-supported mercapto-modified oligonucleotides serving as detection probes, and oligonucleotides immobilized on a nylon membrane surface acting as capturing probes,HBV DNA was detected visually by sandwich hybridization based on highly sensitive aggregation and silver staining. The modified nanoparticle HBV DNA gene probes were also used to detect the HBV DNA extracted from serum in patients with hepatitis B. Results:Compared with bare Au nanoparticles, oligonucleotide modified nanoparticles had a higher stability in NaCl solution or under high temperature environment and the absorbance peak of modified Au nanoparticles shifted from 520nm to 524nm. For Au nanoparticles, the maximal oligonucleotide surface coverage of hexaethiol 30-mer oligonucleotide was (132 ± 10) oligonucleotides per nanoparticle, and the percentage of hybridization strands on nanoparticles was (22 ± 3% ). Based on a two-probe sandwich hybridization/nanoparticle amplification/silver staining enhancement method, Au nanoparticle gene probes could detect as low as 10-11 mol/L composite HBV DNA molecules on a nylon membrane and the PCR products of HBV DNA visually. As made evident by transmission electron microscopy, the nanoparticles assembled into large network aggregates when nanoparticle HBV DNA gene probes were applied to detect HBV DNA molecules in liquid. Conclusion:Our results showed that successfully prepared Au nanoparticle HBV DNA gene probes could be used to detect HBV DNA directly. The detection-visuallized method has many advantages, including high sensitivity,simple operation and low cost. This technique has potential applications in many fields, especially in multi-gene detection chips.     

Detection of HBV and HCV Coinfection by TEM with Au Nanoparticle Gene Probes

Gold(Au) nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes were prepared and were used to detect HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection directly by transmission electron microscopy(TEM).PCR identifying HBV and HCV in serum of patients with HBV and HCV coinfection was established.Alkanethiol-modified oligonucleotide was bound with self-made Au nanoparticles to form nanoparticle HBV DNA or HCV cDNA gene probes through covalent binding of Au-S.HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection was added to the detection system composed of nanoparticle HBV DNA and(or) HCV cDNA gene probes.The results showed that HBV DNA and HCV RNA could be specifically amplified by PCR.The zones of DNA amplification appeared in 431 bp and 323 bp respectively.When HBV DNA and HCV RNA extracted from positive serum of patients with HBV and HCV coinfection were added to the detection system,TEM displayed the nanoparticles self-assembled into large network aggregates.It was concluded that the detection of HBV and HCV coinfection by TEM was convenient and efficient with high specificity and sensitivity.     

金纳米微粒DNA芯片检测EGFR基因突变

目的:研制以金纳米微粒标记和银染色信号放大技术为基础的DNA芯片,用于快速检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。方法:氨基修饰的寡核苷酸探针固定于醛基化玻璃片基制备DNA芯片,5′-生物素标记引物用于PCR扩增EGFR基因第18、19、20、21外显子片段,杂交后含互补序列的PCR产物结合于芯片,金纳米微粒借助表面包被的链亲和素识别标记于PCR产物5′-端的生物素而与之结合,再经银染色法放大杂交信号,依据芯片杂交结果判读EGFR基因突变,并用DNA直接测序法进行验证。结果:所制备的DNA芯片可快速检测肿瘤组织标本中EGFR基因突变,检测敏感性达到10-9 mol/L,可检出标本中5%的基因突变。结论:所制备的DNA芯片具有高特异性和敏感性,且操作简便,适用于临床肿瘤组织标本基因突变的快速检测。     

电泳印迹和分子杂交技术在肝内HBV DNA研究中的应用

应用DNA电泳转移、生物素探针Southern杂交及不同探针重复杂交等3项新技术研究肝炎肝癌的肝内HBV DNA分子状态。经过方法学比较以电泳印迹取代毛细渗吸法对65例肝炎肝癌病人的101份肝内组织DNA进行尼龙膜快速转移和HBV DNA杂交,结果检出HBV DNA分子状态里整合型15份、游离型31份、整合型合并游离型30份。其中12例乙型肝炎标本为经生物素探针杂交检测,结果全部检出游离型HBV DNA。还有3例乙型肝炎标本和2例其它肝炎标本为经重复杂交检测,即先用~(32)P探针杂交继去探针再用生物素探针杂交,结果乙型肝炎标本两次杂交HBV DNA都阳性,其它肝炎标本两次均阴性。阳性者表现为3.2kb和2.3kb电泳位置呈现杂交带,代表HBV之松弛环状和超螺旋状结构。由于两种探针各含不同序列,故结果可对待检基因进行初步序列分析。本实验表明,上述3项技术对临床医学研究有广泛的应用价值。     

DNA为模板的纳米银簇探针检测肿瘤细胞高表达microRNA-21

目的:设计由DNA模板引导制备的纳米银簇探针,实现对肿瘤细胞中高表达的microRNA-21的定性和定量检测。方法:利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、圆二色谱以及高分辨电镜表征技术,探究DNA引导合成纳米银簇的性质。通过计算血清回收率,验证探针对microRNA-21的检测效率。结果:以DNA为模板合成的纳米银簇探针能成功检测肿瘤细胞高表达的microRNA-21。结论:建立了microRNA-21的检测方法,并为临床检测肿瘤标志物提供了思路。     

用于HIV诊断的Oligo基因芯片研制

目的研制快速筛查诊断HIV病毒的Oligo芯片.方法以HIV-1B亚型U26942全基因组序列为靶序列,利用 DNA Club、Oligo 6.0、BLAST、Alignment等生物信息学软件,设计高度特异、长度均一、具近似熔解温度(Tm)的Oligo探针,并制备成Oligo芯片.B(U26942)、C(U46016)、F(AF075703)、G(AF061640)四种亚型质粒分别经RD-梯度PCR与随机特异性引物PCR,经荧光标记后与芯片杂交,扫描芯片后进行统计学分析.结果与结论获得22条60 mer探针,Oligo芯片特异性、敏感性及稳定性好,为进一步应用提供了条件.     

B19微小病毒70-mer寡核苷酸探针的设计

目的　设计B19微小病毒诊断基因芯片的寡核苷酸探针。方法　以微小病毒B19为例 ,利用BLAST软件对其序列进行比对并获得特异序列 ;利用软件Oligo 6设计特异性高、Tm值接近、长度均一的寡核苷酸探针。 结果　获得 12条 70 mer寡核苷酸探针 ,用于芯片打印及病毒检测。结论　利用BLAST系统和生物学软件Oligo 6可简便而有效地设计诊断芯片探针     

使用顺势疗法药物商陆的母酊剂从硝酸银中快速绿色合成纳米银颗粒

目的：研究顺势疗法药物商陆的母酊剂是否能够从硝酸银沉淀出纳米银颗粒,并通过检测这些纳米银颗粒的生物学活性确定其生物学特征。方法：将100mg硝酸银加入20mL超纯水中,并用力搅动使其混匀,再加入5mL顺势疗法药物商陆的母酊剂（商陆根的乙醇提取物）,再用力搅动使其混匀。300K温度下沉降迅速开始,10min后溶液中出现呈浅黄绿色的纳米银颗粒的胶质。胶质溶液经5 000×g离心后分离出纳米银颗粒。对这些纳米银颗粒进行光谱学分析、颗粒测量、电动电位测量,并使用原子力显微镜对其进行形态学观察。使用圆二色光谱分光光度法以小牛胸腺 DNA 作为靶点检测药物-DNA 相互作用和熔化温度。纳米银颗粒的生物活性以人肺癌 A549细胞株、大肠杆菌和酵母菌为实验模型进行检测。结果：顺势疗法药物商陆的母酊剂能够依据环境条件沉淀纳米银颗粒。纳米银颗粒的大小为91nm,多分散性系数为0.119,电动电位为-15.6mV。这种纳米银颗粒具有抗肿瘤和抗细菌活性,但没有显示出抗真菌活性。结论：本研究所采用的生物合成纳米银颗粒的方法无毒且具有良好的成本效益,可以作为一种有益于环境保护的新方法加以开发利用。而顺势疗法药物的母酊剂之所以具有治疗某些疾病或缓解疾病症状的作用,可能也是因为其具有纳米颗粒沉降的作用。     

黄热病病毒检测基因芯片的研究制备

目的制备黄热病病毒寡核苷酸检测芯片。方法根据黄热病病毒基因组序列,并应用生物信息学软件设计出22条寡核苷酸探针用于制备基因芯片。克隆于质粒上的黄热病病毒全长基因经限制性显示技术完成扩增并标记,杂交清洗后对芯片进行扫描和数据分析。结果大部分黄热病病毒寡核苷酸探针检测出阳性信号,阴性对照和空白对照检出阴性信号。结论基因芯片技术为黄热病病毒检测提供了一种早期、快速、可靠的方法。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。