金纳米微粒DNA芯片检测EGFR基因突变

目的:研制以金纳米微粒标记和银染色信号放大技术为基础的DNA芯片,用于快速检测表皮生长因子受体(EGFR)基因突变。方法:氨基修饰的寡核苷酸探针固定于醛基化玻璃片基制备DNA芯片,5′-生物素标记引物用于PCR扩增EGFR基因第18、19、20、21外显子片段,杂交后含互补序列的PCR产物结合于芯片,金纳米微粒借助表面包被的链亲和素识别标记于PCR产物5′-端的生物素而与之结合,再经银染色法放大杂交信号,依据芯片杂交结果判读EGFR基因突变,并用DNA直接测序法进行验证。结果:所制备的DNA芯片可快速检测肿瘤组织标本中EGFR基因突变,检测敏感性达到10-9 mol/L,可检出标本中5%的基因突变。结论:所制备的DNA芯片具有高特异性和敏感性,且操作简便,适用于临床肿瘤组织标本基因突变的快速检测。     

应用"酶生物信号放大系统"放大DNA压电传感器检测信号的研究

目的 研究"酶生物信号放大系统"用于放大DNA压电传感器检测信号的可行性和有效性.方法 在压电石英基片金膜上固定标有biotin的金黄色葡萄球菌oligo探针,加入HRP和底物DAB生成附着于金膜的不可溶沉淀,观察频率对沉淀的响应.在金膜上固定金黄色葡萄球菌oligo探针后与标有biotin的靶序列杂交,加入HRP和底物DAB.比较直接检测杂交时频率变化值和酶系统放大后信号频率变化值.结果 该系统生成的沉淀可显著降低谐振频率.经酶系统放大后检测信号频率变化值显著高于直接检测信号频率变化值.结论 酶生物信号放大系统可有效地放大DNA传感器检测信号,降低非特异信号的产生.     

2种不同类型的核酸探针对压电基因传感器阵列检测特异性的影响

目的探讨用PNA作为探针与普通的DNA探针相比对压电传感器基因杂交的优越性.方法用生物素-亲和素法分别将PNA、DNA两种探针固定在基因传感器的金膜表面,分别与完全匹配、1个碱基错配、2个碱基错配的互补靶序列进行杂交,观察2种不同的探针与靶序列反应所引起的频率变化及所用的时间.结果相对于DNA探针,PNA探针识别碱基错配的能力明显高,且杂交时间更短.结论 PNA与靶序列DNA结合有高度的特异性,选用PNA作探针,可提高压电基因传感器检测的特异性.     

链置换扩增(SDA)压电DNA传感器

目的：构建链置换扩增（SDA）压电DNA传感器，研究其响应特性，方法：（1）将SDA与压电DNA传感器结合，建SDA压电DNA传感器结合技术。（2）以结构菌IS6110片段为检测对象，研究SDA压电DNA传感器的响应特性，结果：（1）SDA压电DNA传感器的响应信号达到500Hz左右；（2）SDA压电DNA传感器出现频率下降的时间长度（响应时间）与加入的检测核酸的浓度相关；（3）不同浓度检测核酸（靶核酸）导致的频率下降绝对值差别不大。结论：SDA压电DNA传感器能直接检测基因组DNA；其响应时间与检测物（靶核酸）的加入量相关，可以用作定量依据。     

纳米金比色芯片检测和鉴定病原微生物

目的：建立一种简单、快速的比色芯片判断PCR产物存在与否的方法。方法：在多重PCR过程中掺入生物素化的dUTP(biotin-16-dUTP)制备生物素化的靶序列，与相应的生物芯片杂交后，用链霉亲和素-纳米金结合银染的方法鉴定4种不同大肠杆菌血清型。同时，为了与链霉亲和素-藻红蛋白染色方法进行比较，用这两种方法检测了大肠杆菌血清型O157：H7的rfbE扩增产物。结果：纳米金比色芯片检测结果与琼脂糖凝胶电泳的结果一致，芯片杂交的纳米金标记与荧光标记检测的结果相当。结论：纳米金比色芯片能够对4种不同的大肠杆菌血清型进行准确鉴定，而且不需复杂的仪器，适合现场检测监控环境中的微生物。     

免疫PCR检测HIV-1 p24的实验研究

目的 以HIV-1 p24为检测对象,建立以金磁微粒为固相载体的免疫PCR检测技术.方法 以鼠抗HIV-1 p24单克隆抗体作为捕获抗体,包被金磁微粒,以生物素化的羊抗p24多克隆抗体作为检测抗体.报告DNA为甘蓝型油菜肉桂酰辅酶A还原酶基因的一个片段,用生物素标记的引物通过PCR扩增预先制备,通过链亲和素的桥联标记生物素化的多抗,被两抗体夹心捕获的人重组HIV-1 p24抗原通过PCR扩增报告DNA的方式予以检测.并且优化了免疫PCR的检测条件,对检测灵敏度进行了分析.结果 为降低非特异性扩增,链亲和素和用于标记的DNA的浓度分别控制在0.1mg/L和10ng/L.免疫PCR检测的灵敏度为0.1ng/L,比ELISA法检测的灵敏度高1.5×104倍.结论 金磁微粒为载体的免疫PCR检测HIV-1 p24抗原是一种灵敏度较高的检测方法.     

链延伸反应提高压电基因传感器的灵敏度的实验研究

目的　利用链延伸反应的原理延长引物链以提高压电基因传感器表面的质量负载 ,从而提高传感器的灵敏度。方法　基因传感器阵列表面分别固定上金黄色葡萄球菌mecA及femA两种探针片段 ,待杂交上相应的靶序列片段后 ,加入Klenow酶 ,室温下 (2 0℃左右 )进行链延伸反应 8h。结果　 50nmol L单链mecA在杂交反应及链延伸反应的过程中 ,频率的下降值分别为 (99.2± 8.5)Hz、(1 92 .9± 1 3 .3 )Hz。而femA则分别下降了 (1 42 .4± 1 1 .2 )Hz、(2 2 2 .6± 1 6.6)Hz。mecA、femA在链延伸反应前的检测灵敏度为 0 .5nmol L ,但经链延伸反应后检测灵敏度提高到了 0 .0 5nmol L。结论　链延伸反应有效地提高了压电基因传感器的灵敏度 ,可用于微量DNA的检测、核酸同源性分析等方面     

生物素标记探针检测外周血白细胞端粒长度的应用研究

目的建立生物素标记测定端粒DNA长度的方法,探讨其法医学应用价值．方法基因组DNA经RsaⅠ和HinfⅠ限制性内切酶消化,0.8％琼脂糖凝胶电泳,Southern印迹转移,以5′末端生物素标记寡核苷酸（TFAGGG）3为探针进行杂交,化学发光检测DNA谱带,与DNA标准分子量比较计算端粒长度．结果通过严格控制印迹转移条件、探针的工作浓度、杂交温度等主要影响因素,获得了比较好的杂交条带．结论生物素标记探针检测端粒DNA长度方法稳定、可靠,无放射污染,杂交信号明显．     

压电石英晶体传感器检测单链DNA的研究

目的：对石英晶体传感器检测单链DNA的可行性进行论证，并对其DNA固定方法进行研究。方法：利用聚乙烯亚胺(PEI)黏附和戊二醛(Glu)交联法，将单链DNA探针固定在基频为10MHz的AT切型石英晶体的镀金表面，制成压电石英晶体DNA传感器，用该DNA传感器进行互补单链DNA定量定性检测，并用1．2mol/L NaOH和1．2mol/L HCl对杂交后的传感器进行了再生。结果:在50-400ng/ml的范围内，响应信号与检测浓度成线性相关，并具有良好的特异性。杂交后的DNA传感器能反复再利用。结论：石英晶体传感器可以用于DNA的杂交检测。     

DNA的生物素标记

非放射性标记探针的应用,对于推广基因诊断技术有重要意义。本文研究酶促和光促两法进行生物素标记DNA。以碱性磷酸酶偶联体系检测两法得到的生物素探针及其分子杂交产物,显色灵敏度近1pg,杂交灵敏度达5pg,而5～10×10~5倍的无关DNA没有或痕量非特异性显色。表明此两种生物素标记探针以及所使用的分子杂交和显色体系皆可用于病毒或真核基因的分析和检测。     

适配子型压电石英晶体传感器探针固定方法的研究

目的 比较金膜表面两种探针固定法的优劣,选择适配子型压电传感器探针固定的最佳方法.方法 用巯基固定法及生物素-亲和素固定法将针对人IgE的适配子探针固定在压电传感器的金膜表面,对不同浓度IgE引起的频率变化进行检测.结果 与巯基法相比,生物素-亲和素法固定探针压电传感器频率下降更为明显,检出限低,线性范围宽,0.1～2.5 mg/L浓度范围内IgE浓度与频率变化呈明显的线性相关,相关系数0.994 5.结论 在压电基因传感器探针固定中效果良好的巯基法在适配子探针固定中并不适用,生物素-亲和素法在适配子压电传感器探针固定中有明显优势.     

压电石英晶体传感器检测血浆纤维蛋白原方法的研究及应用

目的建立一种压电石英晶体传感器检测血浆纤维蛋白原(Fib)的方法.方法采用AT切向、基频10MHz的银膜石英晶体作为压电元件;观察血浆凝集过程中晶体振荡频率的变化,确定血浆凝集反应的起点和终点.结果 (1)检测池加入凝血酶原待频率稳定后,血浆标本加入反应体系后,晶体振荡快速下降,由于反应中形成的纤维蛋白原凝块的质量、体积与晶体接触的面积以及血清产生的量不同,造成频率瞬时的上升、下降,或频率稳定,直至反应结束频率平稳,加样后频率下降的起点为血浆凝集反应的起点,频率上升、下降,稳定的起始点为反应的终点,计算两点的时间即为反应时间,查标准曲线得纤维蛋白原的含量.(2)该方法的检测结果与STAGO磁珠检测法的相关性好(r＝0.957).结论压电石英晶体传感器检测血浆纤维蛋白原是一种实时在线检测的方法,在线观测凝集反应的终点,反应的起点和终点的判别方便、可靠、准确.且操作简单,快速,成本低廉,是一种敏感性高、重复性好的方法,并可用于临床检测.     

压电石英晶体甲胎蛋白免疫传感器的实验研究

目的　构建一种新型压电甲胎蛋白 (AFP)免疫传感器。方法　AT切向、基频 10MHz的石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定组成检测池 ,抗人AFP单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体敏感膜 ,构成压电AFP免疫传感器。结果　构建的压电AFP免疫传感器对AFP的响应特性良好 ,其线性检测范围为 2 0～ 10 0 0ng ml ,癌胚抗原(CEA)、前列腺特异抗原 (PSA)、人绒毛膜促性腺激素 (hCG)等对AFP的检测基本无干扰 ;传感器可再生后重复使用 5次 ;68例临床标本检测结果与放射免疫检测法符合 ,两种方法的相关系数为 0 92 ,P <0 0 1。结论　研制的压电AFP免疫传感器是一种灵敏度高、特异性好、不需标记、操作简单、省时、能重复使用和实时在线检测AFP的新方法 ,对比实验表明其检测结果准确 ,能用于临床实验诊断 ,具有临床推广价值。     

压电C肽免疫传感器的实验研究

目的：构建一种新型压电C肽免疫传感器，方法：AT切向，基频10MHz的石英晶体用金属夹具和乳胶套圈固定形成检测池，抗人C肽单克隆抗体采用巯基化方法固定在金膜电极表面制成抗体敏感膜，构成压电C肽免疫传感器。结果：构建的压电C肽免疫传感器C肽的响应特性良好，其线性检测范围为0．375－12．0ng/ml，胰岛素，胰岛素原对C肽的检测基本无干扰，传感器可再生后重复使用5次，58例临床标本检测结果与放射免疫检测法符合（P＞0．05），两种方法的相关系数为0．94。结论：研制的压电C肽免疫传感器具有灵敏度高，特异性好，不需标记，操作简单，省时，能实时在线检测和重复使用等优点，对比实验表明其检测结果准确，能用于临床实验诊断，具有临床推广价值。     

内毒素定量检测仪的研究

目的 利用压电晶体在液相环境中阻尼效应(非质量效应),研究能定量、高灵敏度、低检测限、快速的内毒素生物传感检测系统.方法 通过对石英晶体传感探头表面的光滑处理和亲水性处理得到性能(消除质量负载影响、提高液固偶合效应)更好的传感器探头,提高测量的稳定性和重复性,降低测量的检测下限.利用CPLD器件和LabView软件将整个测量系统做成一种微型的自动化的内毒素检测系统,实现测量数据的自动采集、分析和结果显示.结果 不同浓度的内毒素与频移最终稳定值存在良好的线性关系.结论 通过建立的频移数据,能够准确、方便地得到内毒素浓度.     

压电石英晶体微阵列免疫传感器检测IgG的实验研究

目的 构建一种新型压电石英晶体人免疫球蛋白(IgG)的免疫微阵列传感器。方法 抗IgG单克隆抗体采用蛋白A(SPA)法固定在AT切向、基频10MHz的石英晶体微阵列金膜电极表面制成抗体敏感膜，构成压电石英晶体IgG免疫微阵列传感器。结果 构建的IgG压电石英晶体免疫微阵列传感器对IgG的响应特性良好，其检测下线为0．5mIU／ml。结论 研制的压电石英晶体IgG免疫微阵列传感器具有灵敏度高、特异性好、成本低廉、操作简单、快速，能在线实时检测等优点，可用于临床实验诊断。     

石英谐振传感器液相稳定平台构建及检测HCMV的实验研究

目的 建立石英谐振压电基因传感器检测系统液相稳定平台并应用该检测系统实时检测链置换扩增(Strand displacement amplification，SDA)反应。方法 ①观察以金属夹具式和粘胶式两种检测池连接方式构成的传感器在液相中的频率稳定性；②以巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)为检测对象，建立SDA反应系统；③传感器检测系统对HCMVSDA反应进行实时检测。结果 ①新型金属夹具式可调节及可换式传感器检测池可实现传感器在液相中的频率稳定性；②SDA反应可引起压电基因传感器的频率持续下降；③在一定范围内核酸杂交所引起的频率下降幅度随加入的靶序列浓度提高而增大。结论 成功构建压电基因传感器液相检测稳定平台并实现对SDA反应的实时检测；该系统可直接检测基因组DNA并可广泛应用于病原微生物的临床检测。     

核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌的实验研究

目的 构建一种用于检测金黄色葡萄球菌的核酸外切酶-压电石英DNA传感器新方法,同时对其重要影响因素进行探讨.方法 采用λ核酸外切酶处理金黄色葡萄球菌PCR产物,EB染色、电泳后于紫外灯下进行观察,对杂交温度、杂交时间和杂交响应性能等因素进行实验研究,进一步将构建的核酸外切酶-压电石英DNA传感器法用于金黄色葡萄球菌检测,并对其灵敏度和特异性进行研究.结果 λ核酸外切酶-压电石英DNA传感器法最适杂交温度为35℃,最适杂交时间为60 min,响应性能显著大于普通压电DNA传感器(P＜0.01),可以检测到1.0×104CFU/ml的金黄色葡萄球菌,特异性好.结论 利用核酸外切酶-压电石英DNA传感器检测金黄色葡萄球菌,具有杂交效率高、技术难度低、频率响应性能高等优点,有较好的应用前景.     

压电基因传感器芯片技术在快速检测人乳头瘤病毒中的应用

目的　快速检出尖锐湿疣组织中人乳头瘤病毒（HPV）并分型.方法　利用基因芯片（Gene chip）与压电传感器（Piezoelectric biosensor）相结合的技术,通过HPV6、11、16、18四种型特异寡核苷酸探针建立一种快速检测HPV并分型的方法.并与常规的PCR和斑点杂交方法比较.结果　取复发型尖锐湿疣及相应的原发病例组织标本各22份,用压电基因传感器芯片技术检测结果为：原发型组织标本全部为阳性结果,其中 HPV6: 17(77.3%), HPV11: 3(13.6%), HPV16: 2(9.1%), HPV18:未检出；复发型组织标本中除第18例标本为阴性结果外,其余21份为阳性结果,其中HPV6: 15（68.2%）,HPV11: 2(9.1%), HPV16: 4(18.2%), HPV18:未检出.用PCR方法检测结果全部阳性,PCR扩增的产物经斑点杂交分型结果与其基本一致.结论　压电基因传感器芯片技术具有准确、快速、灵敏的优点.