mir-338-3p对结直肠癌细胞侵袭迁移能力及SMO蛋白表达的影响

目的：探讨微小RNA-338．3p（miR-338-3p）对人结直肠癌细胞侵袭迁移能力及Smoothened（SMO）蛋白表达的影响。方法：应用实时荧光定量PCR（Real—timePCR）检测四种人结肠癌细胞系Lovo、HT-29、HCT116、SW620中miR-338—3p表达状况,并以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为对照。采取脂质体转染miR-338-3p前体（pre—miR-338．3p）至人结直肠癌细胞系SW620,观察细胞转染前后miR-338—3p的表达变化．Transwell侵袭实验及划痕实验检测转染前后细胞侵袭及迁移能力的改变;以Western—blotting和RT-PCR分析sMO蛋白及mRNA表达状况。结果：检测四种结直肠癌细胞系中miR-338—3p表达水平均较正常对照细胞显著降低,差异具有统计学意义（P〈0．01）;SW620细胞转染pre—miR-338—3p后,miR-338—3p表达水平升高,sMO蛋白表达下降,同时肿瘤细胞侵袭、迁移能力明显增强,与对照组相比差异具有统计学意义（P〈0．01）;但SMOmRNA表达水平在转染前后差异无统计学意义（P〉0．05）。结论：MiR-338—3p可通过抑制结直肠癌细胞系中SMO蛋白表达从而抑制肿瘤细胞侵袭转移。     

miRNA-34c对肺腺癌A549细胞的辐射增敏效应

目的研究肺腺癌A549细胞中miRNA-34e的辐射增敏效应。方法单独转染miRNA．34e序列或单独照射或转染和照射联合处理细胞后,采用MTT比色法检测细胞生长抑制率,流式细胞术检测细胞周期,藻红B染色法观察细胞凋亡率,Westernblot检测p53蛋白的表达。结果转染联合照射处理组的抑制率及凋亡率都较单独转染或单独照射组明显增高（均P〈0．05）,且随miR-34e转染浓度的增加而增高（均P〈0．05）。细胞周期检测结果显示,细胞明显阻滞于G1／G0期（P〈0．05）。联合处理的细胞p53蛋白表达量较单独照射组增加,且呈miRNA．34c浓度依赖性增加（P〈0．05）。结论miRNA-34c对肺腺癌细胞A549有辐射增敏效应,可强化p53蛋白的表达,诱导细胞G1／G0期阻滞和凋亡。     

miR-222下调高糖下小鼠系膜细胞TIMP3表达

目的探讨miR-222是否通过靶向调控TIMP3表达参与糖尿病肾病的发生过程,从而进一步揭示糖尿病肾病的发病机制。方法运用qRT—PCR检测经25mmol／L葡萄糖处理的小鼠系膜细胞（HG组）和对照小鼠系膜细胞（5mmol／L葡萄糖,NG组）中miR-222和TIMP3的表达;将miR-222mimics转染小鼠系膜细胞,以TIMP3siRNA为阳性对照,采用Westernblot检测其对TIMP3蛋白表达水平的影响。结果qRT—PCR检测结果显示,miR-222在经高糖处理的小鼠系膜细胞中的表达相对比正常浓度糖处理的小鼠系膜细胞中明显上调,而TIMP3在经高糖处理的小鼠系膜细胞中mRNA的表达相对比正常浓度糖处理的小鼠系膜细胞中明显下调;Westernblot结果显示,过表达miR-222或干扰TIMP3可抑制TIMP3蛋白的表达（P〈0．05）。结论miR-222可能通过调控TIMP3的表达参与糖尿病肾病的发生发展。     

RNA沉默Pin1表达对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响

目的应用RNA干扰技术沉默Pinl表达后,观察其对乳腺癌细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。方法采用脂质体介导法将Pinl干扰片段PinlsiRNA和对照片段controlsiRNA转染入乳腺癌细胞系MDA—MB一23l后,利用RT—PCR和Westernblot法检测Pinl基因在mRNA和蛋白水平的表达情况,并应用MTT法、Transwell法和AnnexinV—FITC／PI试剂盒及流式细胞仪技术分析检测Pinl对MDA—MB一23l细胞增殖、侵袭和凋亡的影响。结果Pinl在乳腺癌细胞系中高表达。与未处理组及转染对照片段controlsiRNA组相比,沉默Pinl表达后,PinlmRNA（P〈0．05）和蛋白（P〈0．05）表达均明显下降,细胞生长增殖能力[P〉0．05（第1天）,P〈0．01（第2—4天）]减弱,细胞侵袭数目（6．61±0．53,P〈0．05）减少,细胞凋亡率（31．5％±3．06％,P〈0．05）显著增加。结论沉默Pinl表达后可抑制乳腺癌细胞增殖和侵袭,促进乳腺癌细胞凋亡。     

过表达和抑制miR-133a对JEG-3中HLA-G表达的影响

目的 研究微小miR-133a在人绒癌细胞株(JEG-3)中对人类白细胞抗原G(HLA-G)的表达调控作用.方法 用脂质体包裹化学合成的miR-133a前体分子并转染JEG-3,从而过表达及抑制miR-133a,逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)检测转染后miR-133a及HLA-G在mRNA水平的表达情况.Western blot法检测转染miR-133a后细胞中HLA-G蛋白水平的表达.结果 JEG-3细胞中抑制miR-133a后HLA-G在mRNA及蛋白水平均表达增加;在JEG-3细胞中过表达miR-133a后HLA-G在mRNA及蛋白水平均表达下降,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在JEG-3细胞中miR-133a能够负性调控HLA-G的表达,进一步验证了miR-133a与自然流产、子痫前期等疾病的相关性,并为进一步探索相关疾病机制及临床诊治提供了一定的实验基础.     

miR-760靶向CDK8基因对人乳腺癌细胞 MDA-MB-231增殖与迁移的影响

目的探讨miR-760对人乳腺癌细胞中CDK8蛋白表达影响及其在乳腺癌细胞MDA-MB-231中的功能。方法使用实时定量PCR方法检测miR-760在人乳腺癌细胞中的表达;使用脂质体介导的miRNA转染、Western印迹法、MTr法、流式细胞仪技术分别检测转染miR-760前后CDK8蛋白表达差异及其对乳腺癌细胞增殖、迁移等细胞功能和细胞周期的影响。结果人乳腺癌细胞中miR-760表达水平较正常乳腺细胞降低;外源性上调miR-760可有效抑制人乳腺癌细胞株MDA-MB-231CDK8蛋白表达（抑制效率为46．3％,P〈0．05）;人乳腺癌细胞株MDA-MB-231转染miR-760后,其细胞增殖、迁移能力显著降低（P〈0．05）。结论miR-760可能通过靶向CDK8影响人乳腺癌细胞增殖与迁移,在乳腺肿瘤发生发展中起到抑癌基因作用。     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

miR-200c对舌癌Tca8113细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨 miR-200c 对人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞增殖和凋亡的影响。方法将 miR-200c 的模拟物通过脂质体转染到人舌鳞状细胞癌 Tca8113细胞内,通过四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测细胞增殖能力、流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率、Western blot 检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）和 Bcl-2蛋白的表达。结果与对照组相比,miR-200c 模拟物20、40、80 nmol／L 组的 Tca8113细胞生长受到明显抑制,差异有统计学意义（P ＜0．05）,miR-200c 模拟物的浓度越大,作用时间越长,抑制效果越明显（P ＜0．05）;转染 miR-200c 模拟物48 h 后,Tca8113细胞停滞于 G0／G1期,细胞凋亡率显著增加,差异有统计学意义（P ＜0．05）;Western blot 证明20、40、80 nmol／L 组 Bcl-2蛋白表达量明显低于对照组,而 Caspase-3蛋白表达量明显高于对照组（P ＜0．05）。结论miR-200c 过表达可抑制舌癌 Tca8113细胞增殖并诱导细胞凋亡。     

褪黑素对成年大鼠海马神经元络丝蛋白表达的影响

目的：探讨褪黑素对络丝蛋白（reelin）表达的影响。方法：将sD大鼠分为生理盐水对照组和褪黑素组,两组大鼠腹腔分别给予生理盐水或褪黑素后,用Westernblot、免疫组织化学以及实时定量PCR的方法检测海马组织中reelin表达。结果：褪黑素组大鼠海马神经细胞胞膜以及细胞外基质中reelin表达与对照组相比明显增加（P〈0．05）,reelinmRNA的表达量增加（P〈0．05）,Westernblot结果显示给予褪黑素后,大鼠海马lee—lin蛋白表达增加（P〈0．05）。结论：褪黑素可能通过增加reelinmRNA的量促进reelin蛋白的表达。     

辛伐他汀对骨髓基质干细胞成骨分化晚期骨钙素表达的影响

目的通过辛伐他汀体外干预成骨分化晚期的骨髓基质干细胞,观察骨钙素（osteocalcin,OCN）在mRNA和蛋白水平的表达,探讨辛伐他汀促进成骨分化作用及机制。方法取4周龄大鼠股骨和胫骨骨髓腔内的干细胞体外培养,传一代后并向成骨细胞诱导分化,取第五代细胞分别加入lOl7M浓度的辛伐他汀或等量溶剂干预,于加药后48h提取细胞RNA及蛋白,采用Realtime PCR和Westernblot法检测0CN的表达,同时收集细胞培养液上清,ELISA法检测0CN浓度;1周后采用yonKossa染色观察细胞外基质矿化能力。结果①RealtimePCR：实验组0CN的mRNA表达水平显著高于对照组（P〈0．05）;②Westernblot：实验组OcN的蛋白表达水平显著高于对照组（P〈0．05）;③ELISA：实验组细胞培养上清中0CN浓度显著高于对照组（P〈0．05）;④VonKossa染色：实验组细胞外基质矿化能力强于对照组。结论辛伐他汀可以刺激大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化晚期0CN在rnRNA和蛋白水平的表达。     

miR-26a靶向EZH2抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的增殖活性

目的 探讨miR-26a对涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞增殖能力的影响及其与EZH2的靶向关系. 方法 构建pcD-NATM6.2-pre-miR-26a、pmirGLO-EZH2野生型（pmirGLO-EZH2-WT）和突变型（pmirGLO-EZH2-MT）重组质粒,并采用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测pre-miR-26a在ACC-M细胞中的转染效率,并与未处理组（control组）进行比较.同时采用MTT法分析miR-26a过表达对ACC-M细胞增殖活性的影响,并采用双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot检测miR-26a与EZH2的靶向关系. 结果 将测序结果采用NCBI BLAST进行序列比对,结果显示pre-miR-26a、EZH2-WT和EZH2-MT重组质粒均构建成功,无碱基缺失或突变.qRT-PCR显示转染pre-miR-26a的ACC-M细胞其miR-26a的表达显著高于未处理组（P＜0.001）.MTT分析显示miR-26过表达可以明显抑制ACC-M细胞的增殖活性（P＜0.05）.此外,双荧光素酶报告基因系统（P=0.001）、qRT-PCR和Western blot均证实miR-26a能够显著下调EZH2的mRNA（P=0.001）和蛋白的表达（P=0.006）. 结论 miR-26a能够显著抑制涎腺腺样囊性癌ACC-M细胞的增殖活性,并且与EZH2之间存在良好的靶向关系.     

Caveolin-1与绒毛膜癌侵袭力之间的关系

目的:探讨小窝蛋白-1(caveolin-1,CAV-1)的表达与绒毛膜癌高侵袭力之间的相关性,并了解RNA干扰沉默CAV-1基因对高侵袭力绒毛膜癌JEG-3细胞侵袭力的抑制作用.方法:(1)应用Matrigel体外侵袭试验和噻唑盐比色实验[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumro-mide,MTT]检测绒毛膜癌JEG-3细胞和JAR细胞之间侵袭能力和增殖能力的差异;(2)应用半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transeriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测CAV-1 mRNA在人正常早孕绒毛组织、不同侵袭力人绒毛膜癌细胞株JEG-3及JAR表达的差异;(3)将CAV-1小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染至高侵袭力绒毛膜癌JEG-3细胞后,采用RT-PCR检测转染后JEG-3细胞CAV-1 mRNA表达的变化,并应用Matrigel体外侵袭试验和MTT法检测JEG-3细胞侵袭和增殖能力的变化.结果:(1)JEG-3细胞的侵袭能力显著高于JAR细胞(P<0.05),但JEG-3和JAR细胞之间增殖能力的差异无统计学意义(P>0.05);(2)RT-PCR结果显示在人正常早孕绒毛组织、高侵袭性JEG-3细胞以及低侵袭性JAR细胞中均可检测到GAV-1 mRNA,将上述三者中CAV-1 mRNA的表达量进行两两比较,发现人绒毛膜癌细胞株中CAV-1 mRNA的表达明显高于人正常早孕绒毛组织,而具有高侵袭性JEG-3细胞中CAV-1 mRNA的表达明显高于JAR细胞,差异具有统计学意义(P<0.05),相关性分析显示CAV-1表达水平与绒毛膜癌细胞侵袭力呈正相关(r=0.86,P<0.05);(3)CAV-1 siRNA可有效抑制CAV-1 mRNA的表达,并削弱绒毛膜癌细胞的侵袭和增殖能力.结论:CAV-1基因表达可显著增强绒毛膜癌细胞的侵袭潜能,CAV-1 siRNA可抑制绒毛膜癌细胞的侵袭和增殖能力.     

微小RNA-21对宫颈癌HeLa细胞程序性细胞死亡4蛋白表达及细胞增殖的影响

［摘要］目的: 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌HeLa细胞中程序性细胞死亡4(programmed cell death, PDCD4)基因表达及细胞增殖的影响,为应用miR-21对宫颈癌进行基因治疗提供一定的依据。方法: 用脂质体转染的方法,将pre-miR-21、pre-miR-21阴性对照、anti-miR-21、anti-miR-21阴性对照瞬时转染HeLa细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-21相对表达量;MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化;蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达情况;荧光素酶报告基因法验证miR-21的靶位点。 结果: pre-miR-21上调miR-21的表达,抑制PDCD4蛋白表达,促进HeLa细胞增殖;而anti-miR-21下调miR-21的表达,增加PDCD4蛋白的表达,抑制HeLa细胞增殖。pMIR-Luc-PDCD4-3′UTR与pre-miR-21共转染后,荧光素酶活性下降,而与anti-miR-21共转染后,荧光素酶活性升高。 结论: PDCD4基因是miR-21的靶基因;miR-21通过调节PDCD4基因的表达调控细胞增殖。     

IL-6通过调控miR-152/PIK3R3通路促进胃癌细胞的增殖和上皮-间质转化

目的：探索白细胞介素(interleukin,IL)-6在胃癌中的作用及相关的分子机制。方法：50 ng/mL IL-6刺激 胃癌细胞MGC-803后,利用MTT法检测细胞增殖、划痕实验检测细胞迁移的变化,RT-qPCR实验检测E-钙黏蛋白 (E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、锌指转录因子Snail1和miR-152在mRNA水平的表达, Western印迹检测E-cadherin,N-cadherin,vimentin,Snail1在蛋白水平的表达;IL-6与miR-152模拟物(miR-152 mimics)单 独处理或者共同处理MGC-803细胞后,RT-qPCR检测PIK3R3在mRNA水平的表达,Western印迹检测PIK3R3、蛋白激 酶B(Akt)和磷酸化-Akt(p-Akt)在蛋白水平的表达。结果：外源性IL-6明显促进MGC-803细胞的增殖与迁移(P<0.05),降 低E-cadherin蛋白和mRNA和miR-152 mRNA的表达(P<0.01),增加N-cadherin,vimentin,Snail1,PIK3R3蛋白和mRNA及 p-Akt蛋白的表达(P<0.05)。转染miR-152 mimics后明显降低了PIK3R3和p-Akt蛋白水平的表达(P<0.01)。同时,过表达miR-152 能够降低IL-6诱导的PIK3R3及p-Akt的表达水平(P<0.01)。各组中Akt的表达均无明显变化(P>0.05)。结论：IL-6可能是通过 下调miR-152表达,诱导PIK3R3表达,激活PI3K/Akt信号通路,从而促进胃癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化。     

miR-152和miR-448靶向于Rictor并抑制结直肠癌细胞增殖

目的筛选靶向于Rictor mRNA表达的miRNAs并研究其在结直肠癌中的调控作用。方法采用软件预测筛选可能靶向 于Rictor mRNA表达的miRNAs,用所预测的miRNAs转染KM12SM细胞株,利用qRT-qPCR和Western blotting进一步确定对 Rictor表达具显著调控作用的miRNAs。在此基础上,利用双荧光素酶报告系统进一步确定可结合到Rictor mRNA的3’UTR区 对其转录后进行调节的miRNAs。利用细胞存活检测和克隆形成实验进一步确证所筛选miRNAs对细胞存活和克隆形成的影 响。结果miR-152 和miR-448 对Rictor 表达均具显著抑制作用（P<0.01,P<0.05）,且miR-152 和miR-448 可结合到Rictor mRNA的3’UTR区,显著抑制荧光素酶活性（P<0.01,P<0.05）,对其进行转录后进行调节,miR-152和miR-448过表达均可显著 抑制结直肠癌细胞株KM12SM的生长和增殖。结论miR-152和miR-448可能通过靶向于Rictor mRNA进而抑制其蛋白表达, 最终负调控结直肠癌的生长和克隆形成。     

人pre-miR-15a真核表达载体的构建及其对Raji细胞生长的抑制作用

目的 构建人pre-miR-15a真核表达载体,并研究其对Raii细胞的生长抑制作用.方法 将pre-miR-15a与目标载体(PGCSIL-GFP)定向连接,转化细菌感受念细胞,PCR鉴定阳性克隆,并测序.利用脂质体法将该载体转染Raji细胞,实验分为空白对照组、阴性对照质粒组和pre-miR-15a组(n=5).RT-PCR检测Bel-2 mRNA表达,间接免疫荧光法检测Bcl-2蛋白表达,台盼蓝细胞计数法检测细胞增殖活性.结果 PCR 阳性克隆鉴定及测序结果 均与日的序列一致.倒置荧光显微镜下见绿色荧光表达;RT-PCR法示各组间Bcl-2 mRNA表达差异无显著性(P>0.05);间接免疫荧光法示pre-miR-15a组的Bcl-2蛋白表达量较空白对照组和阴性对照质粒组显著降低(P<0.05);台盼蓝拒染法示pre-miR-15a组Raji细胞生长受抑.结论 本实验成功构建了per-miR-15a真核表达载体,且pre-miR-15a可以抑制Raji细胞生长.     

miR-125b调节C3H10T1/2间充质干细胞中Cbfβ的表达

目的研究miR-125b对鼠间充质干细胞株C3H10T1/2中核心结合因子-β(core-binding factor beta,Cbfβ)表达的调节作用。方法将microRNA阴性对照、miR-125b mimic和anti-miR-125b用脂质体转染小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2,Western blot及RT-PCR测定细胞中Cbfβ蛋白及mRNA表达;以PicTar数据库预测的Cbfβ3’-非翻译区上miR-125b靶位点附近约30个碱基为基础合成3组插入序列(阳性对照、野生型序列、突变序列),连接到经HindⅢ、SpeⅠ双酶切后的PmiR-report载体质粒上,然后与miRNA阴性对照和miR-125b mimic共同转染293T细胞,双荧光素酶报告基因检测荧光素酶活性。结果过表达miR-125b抑制Cbfβ蛋白及mRNA表达(P<0.05),转染anti-miR-125b可促进Cbfβ蛋白及mRNA表达(P<0.05);miR-125b抑制Cbfβ3’-非翻译区荧光素活性。结论外源性miR-125b可作用于Cbfβ3’非翻译区从而负性调节C3H10T1/2细胞中Cbfβ的表达。     

MicroRNA-196a 在喉癌组织中的表达及其 对喉癌细胞侵袭和转移的影响

目的 探讨microRNA-196a（miR-196a）在喉癌组织中表达及其对喉癌细胞侵袭和转移的影响。 方法 选取2015 年1 月—2017 年12 月金华市中心医院70 例喉癌手术切除标本的喉癌组织和癌旁组织。将 人喉癌Hep-2 细胞分为空白对照组、阴性对照组及siRNA 组。siRNA 组细胞转染pcDNA/miR-196a,阴性 对照组细胞转染pcDNA/miR-NC,空白对照组不做处理。采用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）测定癌旁 组织和喉癌细胞中miR-196a 水平;Transwell 小室测定喉癌细胞侵袭和迁移能力;Western blotting 检测喉癌 细胞磷脂酰肌醇-3- 激酶（PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-PKB）、Bax 及Bcl-2 蛋白水平;RT-PCR 测定喉 癌细胞PI3K、p-PKB、Bax 及Bcl-2 mRNA 水平。结果 喉癌组织中miR-196a 水平高于癌旁组织（P <0.05）。 与空白对照组和阴性对照组比较,siRNA 组喉癌细胞中miR-196a 水平降低（P <0.05）,细胞侵袭和迁移能 力下降（P <0.05）,PI3K、p-PKB 及Bcl-2 蛋白和mRNA 水平降低（P <0.05）,Bax 蛋白和mRNA 水平升 高（P <0.05）;空白对照组与阴性对照组细胞各指标比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 喉癌组织中 miR-196a 水平升高,沉默miR-196a 可降低喉癌细胞的侵袭和迁移能力,其机制可能与PI3K/PKB 信号通路 有关。