miR-145抑制口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞增殖活性及其与CDK6的靶向关系

目的 在口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞中验证miR-145靶向CDK6对其细胞增殖活性的影响. 方法 构建pcD-NATM6.2-GW-pre-miR-145重组表达质粒并转染入Tca-8113细胞,以荧光实时定量PCR（qRT-PCR）检测转染后癌细胞miR-145的表达水平.MTT法评价miR-145对Tca-8113细胞增殖活性的影响,并通过双荧光素酶报告基因检测miR-145对候选靶基因CDK6的调控作用,同时采用Western blot法检测miR-145对CDK6蛋白表达水平的影响. 结果 成功构建miR-145真核表达载体,qRT-PCR显示miR-145组中miR-145的表达显著高于内源性表达量（P＜0.001）,说明miR-145在Tca-8113细胞中具有较高的转染效率.MTT法提示miR-145的过表达能够显著抑制Tca-8113细胞的增殖（P＜0.01）,同时双荧光素酶报告基因分析表明,共同转入miR-145与CDK6野生型（CDK6-WT）会显著抑制Tca-8113细胞中的荧光酶表达（P=0.002）;Western blot进一步证实了miR-145的过表达能够抑制内源性CDK6蛋白的表达. 结论 miR-145可能通过直接靶向CDK6来抑制口腔鳞状细胞癌Tca-8113细胞的增殖活性.     

线粒体在埃克替尼诱导涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞凋亡中的作用

目的利用涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞为模型,研究不同浓度埃克替尼( icotinib)对涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞凋亡的影响以及线粒体在 icotinib 诱导ACC-M细胞凋亡中的作用。方法 icotinib 和 P53抑制剂( PFT)分别处理ACC-M细胞,应用噻唑蓝比色法检测细胞活性,利用 Western blot 法检测 P53和胞质内细胞色素 C ( Cyt C)蛋白的表达变化,用Caspase-3凋亡相关蛋白活力检测ACC-M细胞的凋亡情况。结果 icotinib可抑制ACC-M细胞的活性,增加胞质Cyt C蛋白的表达和P53在线粒体的转位并诱导ACC-M细胞凋亡。用PFT预处理后,icotinib诱导ACC-M细胞的凋亡明显下降,线粒体蛋白P53的表达降低,胞质内Cyt C表达减少, Caspase-3凋亡相关蛋白活力下降。结论 icotinib可能通过诱导P53转位到线粒体进而促进ACC-M细胞凋亡。     

miR26a靶向EZH2抑制肝癌HepG2细胞的增殖活性

目的 探讨mi R26a靶向EZH2抑制肝癌Hep G2细胞的增殖活性的影响并探讨其可能的分子机制。方法 设计合成mi R26a mimic,将细胞分为转染试剂对照组(mock)、阴性对照组(control)和mi R26a mimic组,采用Real-time PCR检测转染后细胞中mi R26a的表达水平,MTT检测细胞的增殖能力,流式细胞术检测细胞的凋亡情况,双荧光素酶报告基因系统检测mi R26a与EZH2的靶向关系,Western blot检测各组细胞中EZH2蛋白的表达。结果 MTT分析及流式细胞术的检测证实过表达mi R26a能够抑制肝癌细胞的增殖效应,促进肝癌细胞的凋亡,双荧光素酶报告基因系统以及Western blot的结果均证实mi R26a能够显著下调EZH2在蛋白水平的表达。结论 mi R26a能够显著抑制肝癌Hep G2细胞的增殖活性,并且与EZH2之间存在良好的靶向关系。     

miR-106b及EZH2对HepG2细胞生长的影响及机制

目的探讨miR-106b及核心亚基基因增强子的人同源基因2(EZH2)对HepG2细胞生长的影响及其作用机制。方法 qRT-PCR法检测不同肝癌细胞miR-106b的表达;用miR-106b抑制物(inhibitor)及模拟物(mimic)和siEZH2转染肝癌细胞,CCK8法检测细胞增殖,细胞凋亡用Annexin V-FITC/PI双染法和WB法检测凋亡蛋白-3(Caspase-3),生物信息学分析并用荧光素酶法证实miR-106b是否靶向结合EZH2。结果与永生化的肝细胞LO2相比,miR-106b在肝癌细胞中表达量增加;miR-106b mimic促进HepG2细胞增殖和抑制凋亡;miR-106b inhibitor能导致Caspase-3全长表达量减少和其活性片段表达量增加;siEZH2抑制HepG2细胞增殖和促进其凋亡,并且能导致Caspase-3全长表达量减少及其活性片段表达量增加。荧光素酶结果表明miR-106b并非直接靶向抑制EZH2,miR-106b促进EZH2的表达。结论抑制miR-106b和EZH2的表达都能有效抑制HepG2细胞增殖和促进其凋亡。     

miR-132通过降低HMGA2的表达抑制骨肉瘤细胞迁移、侵袭及上皮间质转化

目的：研究微小RNA-132（miR-132）对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响及其机制。方法：利用实时定量PCR（qRT-PCR）检测骨肉瘤细胞系U2OS和HOS及人成骨细胞系hFOB1.19中miR-132的表达水平。分别向HOS及U2OS细胞转染miR-132模拟物和抑制物,以过表达或敲低细胞内miR-132的表达,利用qRT-PCR验证转染效率。采用Transwell实验、qRT-PCR及Western blot检测过表达和敲低miR-132对骨肉瘤细胞迁移、侵袭及上皮间质转化的影响。通过对Targetscan网站进行检索并利用荧光素酶报告基因实验探究HMGA2为miR-132的靶基因。qRT-PCR和Western blot检测miR-132对HMGA2表达的调控作用。结果：与人成骨细胞系hFOB1.19相比,miR-132在骨肉瘤细胞中的表达水平显著降低（P＜0.05）;向U2OS细胞转染miR-132模拟物后,细胞miR-132的表达水平显著增加（P＜0.01）;过表达miR-132后,U2OS细胞的迁移和侵袭能力显著降低,E-cadherin表达增加,Vimentin表达降低（P＜0.05）;向HOS细胞转染miR-132抑制物后,细胞miR-132的表达水平显著降低（P＜0.01）;敲低miR-132后,HOS细胞的迁移和侵袭能力显著增强,E-cadherin表达降低,Vimentin表达增加（P＜0.05）;生物信息学检索及荧光素酶报告基因证明HMGA2基因为miR-132的靶基因。过表达miR-132可明显降低骨肉瘤细胞中HMGA2的表达,而敲低miR-132可明显增加骨肉瘤细胞中HMGA2的表达（P＜0.05）。结论：miR-132在骨肉瘤细胞中低表达,miR-132可通过抑制HMGA2的表达抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭及上皮间质转化。     

微小RNA-21对宫颈癌HeLa细胞程序性细胞死亡4蛋白表达及细胞增殖的影响

［摘要］目的: 探讨微小RNA-21(miR-21)对宫颈癌HeLa细胞中程序性细胞死亡4(programmed cell death, PDCD4)基因表达及细胞增殖的影响,为应用miR-21对宫颈癌进行基因治疗提供一定的依据。方法: 用脂质体转染的方法,将pre-miR-21、pre-miR-21阴性对照、anti-miR-21、anti-miR-21阴性对照瞬时转染HeLa细胞。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测miR-21相对表达量;MTT法检测宫颈癌HeLa细胞增殖的变化;蛋白质印迹法检测PDCD4蛋白表达情况;荧光素酶报告基因法验证miR-21的靶位点。 结果: pre-miR-21上调miR-21的表达,抑制PDCD4蛋白表达,促进HeLa细胞增殖;而anti-miR-21下调miR-21的表达,增加PDCD4蛋白的表达,抑制HeLa细胞增殖。pMIR-Luc-PDCD4-3′UTR与pre-miR-21共转染后,荧光素酶活性下降,而与anti-miR-21共转染后,荧光素酶活性升高。 结论: PDCD4基因是miR-21的靶基因;miR-21通过调节PDCD4基因的表达调控细胞增殖。     

miR-27a-3p调控XIAP表达对急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨微小RNA(miR)-27a-3p对急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)Jurkat细胞增殖和凋亡的影响及其机制.方法 将体外培养的T-ALL Jurkat细胞分为未转染组(未处理)、miR-NC组(转染阴性对照miR-NC)和miR-27a-3p组(转染miR-27a-3p模拟物),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中miR-27a-3p表达水平,噻唑蓝(M T T)法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测细胞中B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)和X染色体连锁的凋亡抑制基因(XIAP)蛋白表达水平,比色法检测细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3活性,双荧光素酶报告基因(DLR)实验检测miR-27a-3p和XIAP的靶向关系.结果 与未转染组或miR-NC组比较,miR-27a-3p组细胞中miR-27a-3p表达水平、细胞凋亡率、细胞中Bax表达水平和caspase-3活性均明显升高,而细胞增殖活力和细胞中Bcl-2、XIA P蛋白表达水平均明显降低(P<0.05);miR-NC组和未转染组上述各指标比较差异均无统计学意义(P>0.05).DLR实验证实miR-27a-3p可与XIAP靶向结合.结论 miR-27a-3p可抑制T-ALL Jurkat细胞增殖并诱导细胞凋亡,其作用机制可能与靶向调控XIA P表达有关.     

miR-26a抑制胃癌AGS细胞生长的分子机制

目的 检测miR-26a在胃癌组织的表达改变,明确miR-26a调控胃癌细胞生长的分子机制。方法 运用qRT-PCR检测71例胃癌及相应癌旁正常组织中miR-26a的表达改变;将miR-26a模拟物转染胃癌细胞AGS,采用Western blot检测其对MTDH蛋白表达水平的影响;然后采用MTT法检测高表达miR-26a对AGS细胞生长增殖的影响。结果 qRT-PCR检测结果显示,miR-26a在71例胃癌组织中表达下调0.44倍;Western blot结果显示,过表达miR-26a或干扰MTDH可抑制MTDH蛋白的表达。MTT检测发现,转染MTDH siRNA和miR-26a模拟物组AGS细胞从48 h起OD值分别为（0.158±0.006）、（0.201±0.006）,与对照组细胞相比（0.515±0.032）、（0.479±0.028）,差异均有统计学意义（P〈0.05）。结论 miR-26a通过靶向调控MTDH的表达而抑制胃癌细胞的生长。     

RNA干扰iNOS基因对腺样囊性癌细胞增殖活性的影响

目的：采用RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术下调腺样囊性癌细胞株ACC-M中iNOS的表达,探讨其对肿瘤细胞增殖活性的影响。方法：采用siRNA干扰技术下调iNOS表达,RT-PCR法测定细胞内iNOS mRNA的表达;MTT法测定ACC-M细胞增殖活性的变化。结果：与对照组比较,iNOS的siRNA能有效地抑制实验组ACC-M细胞中iNOS的表达（P〈0.05）,并且实验组细胞的体外增殖活性降低（〈0.05）。结论：RNA干扰iNOS可以降低腺样囊性癌的增殖活性。     

miR-26a-5p影响肝癌细胞迁移和侵袭的机制研究

目的探讨微小RNA-26a-5p（miR-26a-5p）对腹水来源的高转移人肝癌细胞系SK-HEP-1生物学行为的影响及机制。方法采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测比较人正常肝细胞LO2及不同人肝癌细胞系（HepG2、BEL-7402、SMMC-7721、MHCC97H和SK-HEP-1）中miR-26a-5p和IL-6mRNA的表达水平。选择低表达水平的SK-HEP-1细胞转染miR-26a-5p模拟物,采用qRT-PCR法和ELISA法检测转染后细胞中miR-26a-5p、IL-6mRNA的表达水平和IL-6的分泌情况。划痕和Transwell实验检测miR-26a-5p对SK-HEP-1细胞转移和侵袭能力的影响。双荧光素酶报告基因检测miR-26a-5p与IL-63''-非编码区（UTR）的靶向结合关系。Westernblot法检测miR-26a-5p对SK-HEP-1细胞中信号转导和转录激活因子3（STAT3）蛋白磷酸化和上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达变化。采用qRT-PCR法检测miR-26a-5p对EMT相关基因表达水平的影响。结果与LO2相比,人肝癌细胞中miR-26a-5p相对表达量明显下调,IL-6mRNA相对表达量明显上调,其中SK-HEP-1中相对表达量差异最为显著。miR-26a-5p模拟物转染SK-HEP-1细胞后,miR-26a-5p相对表达量显著增高,IL-6mRNA和蛋白相对表达量显著下调。双荧光素酶报告基因实验证实miR-26a-5p与IL-63''-UTR存在序列特异性靶向结合关系。与空白对照组和模拟物对照组相比,miR-26a-5p模拟物明显抑制SK-HEP-1细胞迁移和侵袭的能力,同时显著降低IL-6下游信号STAT3蛋白的磷酸化水平,升高E-钙黏蛋白相对表达量和降低波形蛋白相对表达量。与模拟物对照组相比,miR-26a-5p模拟物显著改变EMT相关基因表达。结论miR-26a-5p通过靶向抑制IL-6mRNA,下调STAT3磷酸化,调控肝癌EMT标志物的基因和蛋白水平的表达,从而逆转肝癌细胞SK-HEP-1迁移和侵袭。     

腺病毒介导的P~(53)基因对涎腺腺样囊性癌细胞系生长的影响

目的研究P53基因对涎腺腺样囊性癌细胞系生长的影响。方法以人涎腺腺样囊性癌细胞系SACC-83、SACC-LM、ACC-2、ACC-M和NACC为实验对象,将载有人野生型P53cDNA的重组腺病毒(Ad5CMV-P53)感染涎腺腺样囊性癌细胞系,观察Ad5CMV-P53对涎腺腺样囊性癌细胞生长的影响。结果5种涎腺腺样囊性癌细胞系转染Ad5CMV-P53病毒后,均可以诱导其发生凋亡,使细胞系生长受到明显的抑制。结论Ad5CMV-P53介导的野生型P53基因,可能是一种有效的治疗涎腺腺样囊性癌的辅助手段。     

Stat3 mRNA靶向MicroRNA重组质粒的构建及其在HepG2肝癌细胞系中的表达

目的构建并筛选靶向信号转导和转录激活因子3（Stat3mRNA）的微小RNA（MicroRNA）表达质粒。观察其在肝癌细胞系HepG2中对Stat3表达的影响。方法针对人Stat3mRNA设计3条MicroRNA序列,经退火成互补双链,将双链DNA插入线性质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR质粒中,分别构建重组表达质粒pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3等3组质粒,并测序鉴定。脂质体法转染重组质粒至人肝癌HepG2细胞中,观察转染效果。RT-PCR和Western blot分别检测Stat3mRNA和蛋白的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,MTT法检测细胞增殖能力。结果成功构建靶向Stat3的MicroRNA重组质粒,经测序证实插入的DNA片段的序列与设计序列完全一致,转染人肝癌HepG2细胞后,荧光显微镜下可观察到带有绿色荧光的HepG2细胞。流式细胞仪检测3组质粒的转染效率分别为：76%、73%和63%。RT-PCR分析pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1、2、3的抑制率分别为：73.5%、47.2%和39.6%,下调Stat3蛋白的比例分别为：89.1%、71.6%、67.3%。其中pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-1的下调效应最明显。MiR-1质粒转染组的细胞凋亡率升高,增殖受抑制,与阴性对照质粒组和未转染组比较,差异均有高度统计学意义（均P〈0.01）。结论成功构建了靶向Stat3的MicroRNA表达质粒,其对肝癌HepG2细胞Stat3的表达及增殖有显著抑制。     

醋酸棉酚对人腺样囊性癌ACC-M细胞P16基因甲基化及mRNA表达的影响及其意义

目的 研究醋酸棉酚（gossypol acetic acid,GAA）对体外培养的人腺样囊性癌ACC-M细胞P16基因甲基化及mRNA表达的影响,初步探讨醋酸棉酚的抗肿瘤作用机制.方法 （1）应用甲基化特异性PCR （MSP）检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后P16基因甲基化状态的改变情况; （2）应用实时荧光定量法（RFQ-PCR）检测ACC-M细胞在GAA作用48、72 h后P16基因mRNA的表达变化.结果 （1） MSP检测结果显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48、72 h后,P16甲基化条带的平均灰度值低于对照组（P＜0.05）; （2） RFQ-PCR检测显示：分别以19、10 μmol/L的GAA作用ACC-M细胞48、72 h后细胞中P16mRNA的表达水平高于对照组（P＜0.05）.结论 GAA可降低P16基因的甲基化水平,且能增强P16基因mRNA表达,这可能是GAA抗肿瘤作用的机制之一.     

涎腺腺样囊性癌单细胞增殖的实验研究

目的探讨腺样囊性癌肺高转移细胞株（ACC—M）肿瘤干细胞存在的可能性,并为今后关于其肿瘤干细胞生物学特性的研究提供一定的理论依据和实验数据。方法采用单细胞体外培养的方法了解ACC—M的分裂和增殖的特点。结果在单细胞体外培养6d后,ACC—M单细胞只有23．64％的细胞存活,其中仅有8．62％持续分裂、增殖。结论ACC—M肿瘤细胞存在肿瘤干细胞,并不是所有的ACC-M细胞都能克隆增殖,只有一小部分细胞能不断地分裂增殖,大多数细胞最终死亡或凋亡。     

miR-125b-5p调控HK2抑制胆囊癌细胞增殖和糖酵解

  目的  研究miR-125b-5p通过HK2调控人胆囊癌细胞增殖和糖酵解的作用机制。  方法  分别在人胆囊癌细胞GBC-SD中转染NC mimic、miR-125b-5p mimic、miR-125b-5p mimic+pcDNA-NC、miR-125b-5p mimic+pcDNA-HK2。实时荧光定量聚合酶链式反应（Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）检测miR-125b-5p和HK2 mRNA的表达,Western blot检测HK2和LDHA、PDK1的蛋白表达。细胞计数试剂盒-8（cell countingKit-8,CCK-8）检测细胞增殖活力,糖酵解相关试剂盒检测乳酸生成、葡萄糖消耗以及ATP生成。双荧光素酶报告基因实验对miR-125b-5p和HK2的靶向关系进行验证。  结果  miR-125b-5p在胆囊癌细胞系GBC-SD和NOZ（P < 0.001）以及组织（P < 0.01）中表达降低,且在GBC-SD细胞中低于NOZ细胞中。过表达miR-125b-5p可显著抑制GBC-SD细胞的增殖（P < 0.05）、葡萄糖消耗（P < 0.05）、乳酸（P < 0.001）和ATP的生成（P < 0.01）以及LDHA（P < 0.01）、PDK1（P < 0.001）、HK2（P < 0.0001）表达。starBase数据库和双荧光素酶报告基因实验证实miR-125b-5p靶向负调控HK2。过表达miR-125b-5p和HK2组中细胞的增殖（P < 0.01）、葡萄糖摄取（P < 0.05）、乳酸（P < 0.01）和ATP（P < 0.05）的生成以及LDHA（P < 0.05）、PDK1（P < 0.05）、HK2（P < 0.05）表达显著高于仅过表达miR-125b-5p组。  结论  过表达miR-125b-5p靶向HK2,抑制人胆囊癌细胞GBC-SD的增殖和有氧糖酵解。     

miR-34c对Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-B细胞生长和凋亡的影响

目的：研究miR-34c对Ⅱ型子宫内膜癌HEC-1-B细胞的生长及凋亡的影响。方法：用hsa-miR-34cmimics转染HEC-1-B细胞。流式细胞技术测定细胞转染率,实时荧光定量PCR验证转染后miR-34c的表达。CCK-8检测细胞增殖能力的改变。细胞克隆形成实验观察miR-34c对细胞生长的长期抑制。流式细胞技术测细胞凋亡。结果：细胞转染率为81．16％。相对于对照组,转染后实验组miR-34c表达明显增加,细胞增殖、克隆形成能力减弱,凋亡增加（P〈0．05）。结论：miR-34c能明显抑制Ⅱ型子宫内膜癌细胞的增殖,促进细胞凋亡,是Ⅱ型子宫内膜癌的潜在抑癌基因。     

miR-145和miR-497在宫颈癌SiHa细胞中的表达及对增殖的影响

目的 研究miR-145和miR-497在宫颈癌SiHa细胞的表达及对增殖的影响。方法 以宫颈癌SiHa细胞为研究对象,转染pre-miR-145和pre-miR-497,采用实时荧光定量PCR和MTT检测miR-145和miR-497在宫颈癌SiHa细胞中的表达及对增殖的影响。结果 采用实时荧光定量PCR检测miR-145和miR-497在宫颈癌SiHa细胞中的表达,结果显示,实验组中miR-145和miR-497的表达量显著高于blank组(P=0.001),MTT结果显示转染miR-145和miR-497的SiHa细胞其增殖活性明显受到抑制(P＜0.05)。结论 miR-145和miR-497能够显著抑制宫颈癌SiHa细胞的增殖。