无菌体液细菌培养的新方法探讨

目的:探讨无菌体液培养的最佳方法。方法:对278份无菌体液标本用双相液体培养基法和直接接种法培养分离细菌。结果:双相液体培养基检测278份标本,40份培养出细菌,阳性率为14.4%,直接接种法培养19份标本培养出细菌,阳性率为6.8%,经SPSS11.5软件处理,χ2检验,P﹤0.01,结果差异有显著性。结论:用双相液体培养基法培养无菌体液标本,可明显提高细菌检出率,是较好好的方法。     

病原性真菌PCR检测方法的建立

目的：建立一种快速、灵敏和特异的病原性真菌的检测方法。方法：选取真菌18S rRNA保守区的一对寡核苷酸序列作为通用引物,对10种真菌、3种常见细菌及80例临床标本进行PCR扩增。结果：所试10种真菌均能扩增出一条约400bp的DNA片段,而3种细菌则无此扩增条带。通过对80例临床标本的检测,证实PCR法和常规培养法结果基本一致。此外,对白色念珠菌检测的最低限为10pg的DNA。结论：PCR方法检测临床常见真菌有较高的灵敏性与特异性,有助于临床真菌感染性疾病的诊断与治疗。     

无菌体液细菌培养的新方法探讨

目的:探讨无菌体液培养的最佳方法.方法:对278份无菌体液标本用双相液体培养基法和直接接种法培养分离细菌.结果:双相液体培养基检测278份标本,40份培养出细菌,阳性率为14.4%,直接接种法培养19份标本培养出细菌,阳性率为6.8%,经SPSS 11.5软件处理,χ2检验,P＜0.01,差异有非常显著性.结论:用双相液体培养基法培养无菌体液标本,可明显提高细菌检出率,是较好的方法.     

应用PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡

目的探讨PCR技术快速诊断感染性角膜溃疡的临床应用。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA和细菌16srRNA基因保守区各自的一对寡核苷酸序列为通用引物，对临床拟诊为感染性角膜溃疡的标本进行PCR检测，并与培养方法进行对比。结果在310bp处出现DNA扩增带者为真菌感染；520bp处出现DNA扩增带者为细菌感染；310bp和520bp处同时出现DNA扩增带者为真菌和细菌混合感染。32例临床标本培养阳性率为59．38％，而经PCR扩增阳性率为78．13％。结论应用PCR技术检测感染性角膜溃疡速度快、阳性率高，有助于角膜溃疡的病原学快速诊断。     

核酸扩增-液相杂交法检测沙眼衣原体DNA

目的：探讨用核酸扩增（PCR）－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA的效果。方法：用PCR－液相杂交法对616份临床标本进行了沙眼衣原体检测，并与培养法比较，对与培养法结果不相符合的标本及部分阴性标本进行连接酶链反应（LCR）复检。结果：PCR－液相杂交相法检测沙眼衣原体特异性良好。灵敏度达到0.1fg，临床标本沙眼衣原体DNA阳性检出率为27.6％，显著高于培养法的6.3%（P＜0.001）。以培养法为标准，此法的灵敏度为100％。以LCR法为标准，此法的灵敏度为97.2％,特异度为80.7%，2者具有较好的相符性。结论：PCR－液相杂交法检测沙眼衣原体DNA操作简便，特异性强，灵敏度高，适合临床应用。     

多重聚合酶链反应快速诊断感染性眼内炎的研究

目的：探讨多重聚合酶链反应（MPCR）快速诊断细菌性、真菌性眼内炎及混合感染的价值。方法：MPCR法检测常见致病性细菌和真菌菌株，并检测38例患者41只眼（双眼3例，单眼35例）眼内液标本，与细菌和真菌培养结果比较。结果：MPCR法5h即可检测出标本中微量细菌和真菌，41份标本MPCR检测阳性34份（82．9％），其中细菌阳性26份，真菌阳性6份，细菌和真菌均为阳性2份，MPCR阳性率明显高于细菌或真菌培养（X^2=9．60，P〈0．05）。结论：MPCR速度快、敏感性和特异性高，有助于细菌性和真菌性眼内炎的快速明确诊断。     

聚合酶链反应诊断新型隐球菌脑膜脑炎50例

目的 探讨聚合酶链反(PCR) 新型隐球菌脑膜脑炎快速诊断的临床标准。方法 应用聚合酶链反应检测50例临床脑脊液标本中的新型隐球菌，同时用直接涂片墨汁复杂、真菌培养进行对比检测。结果 在50例患者临床脑脊液标本中，PCR检测阳性11例；直接涂片墨汁复染阳性7例阳性；真菌培养阳性9例。结论 用PCR方法具有简便、快速、特异、敏感的特点，从脑脊液标本中直接检测新型隐球菌，提供病原学诊断依据，对新型隐球菌脑膜脑炎的快速诊断具有重要的临床意义。     

PCR法检测细菌23S rDNA在感染性疾病快速诊断中的应用研究

目的　研究建立快速检测细菌DNA的方法。方法　设计一对共同引物 ,应用聚合酶链反应 (PCR)法 ,扩增细菌核糖体 2 3S亚单位基因 2 3SrDNA。对 2 3种临床常见致病菌、培养物及临床病例标本采用该方法进行检测 ,并与常规细菌培养法比较。结果　该方法可检测细菌下限为 2 5CFU ,与真菌、乙肝病毒等无交叉反应。对纯菌及培养物均可检出一条明显DNA条带 ,革兰阴性细菌约 35 0bp ,革兰阳性细菌约 4 0 0bp。临床标本 2 3SrDNA检出率明显高于常规培养方法 (P <0 0 1)。结论　应用所设计的共同引物 ,检测细菌 2 3SrDNA ,敏感性和特异性好 ,比常规培养法快速、准确。     

热带假丝酵母菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及临床应用初步评价

目的建立、优化快速检测临床标本中热带假丝酵母菌的实时荧光定量PCR方法 ,并对其临床应用进行初步评价。方法用自行设计的高效引物、探针检测5种临床标本中的热带假丝酵母菌,对该方法的敏感性、特异性进行评价,并与真菌培养法进行比较。结果检测临床标本中热带假丝酵母菌的灵敏度可达10 copies/ml,与人类基因组、细菌及其他真菌无交叉阳性反应。与真菌培养法的检测一致性好(Kappa值为0.916,P<0.01)。结论实时荧光定量PCR检测热带假丝酵母菌灵敏度高、特异性强,可直接用于各种临床标本中热带假丝酵母菌的检测,而且可大大缩短报告时间,为临床诊断提供可靠依据。     

用PCR技术直接检测白色念珠菌DNA的实验研究

目的建立和评价直接用PCR从血标本中检测白色念珠菌核酸的方法。方法用红、白细胞裂解液、破壁酶和真菌DNA提取盒直接处理血标本,得到的微量靶DNA用白色念珠菌种特异性引物进行扩增。结果在白色念珠菌制备的人血标本中检测出靶DNA,其敏感性达10个孢子/ml以下,从处理标本到报告结果仅需6h。结论用PCR法可特异、敏感地从血标本中直接检测白色念珠菌核酸,有助于临床快速诊断深部白色念珠菌感染。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应（PCR）合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16S rRNA的通用探针，并用生物素标记DNA探针，分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针，肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交，细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA，100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌，其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异，具有较高的应用价值．可应用于临床检测。     

DNA探针杂交快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌

目的 建立一种早期快速检测肺炎链球菌和流感嗜血杆菌的分子生物学方法。方法 采用聚合酶链反应(PCR)合成肺炎链球菌和流感嗜血杆菌特异的DNA探针和细菌16SrRNA的通用探针,并用生物素标记DNA探针,分别与细菌、病毒和真菌DNA杂交。并将该方法评价临床样本的检测。结果 聚合酶链反应分别扩增出263、351、370bp三种DNA探针,肺炎链球菌和流感嗜血杆菌只与其对应的探针杂交,细菌通用探针和病毒、真菌间无交叉反应。该法可检测出1ng细菌DNA,100份痰标本利用该方法检测出11份肺炎链球菌和8份流感嗜血杆菌,其阳性率高于痰培养。结论 该方法简便、快速、特异,具有较高的应用价值,可应用于临床检测。     

宏基因组学二代测序在不明原因发热患者病原体检测中的应用

目的：分析宏基因组学二代测序（mNGS）技术在不明原因发热患者病原检测中的应用价值。方法：选择不明原因发热51例患者,留取可疑部位标本送传统细菌培养,同时外送进行病原mNGS检测。比较细菌培养与mNGS病原二代测序结果,统计病原微生物检出敏感性、特异性、诊断效能等。结果：51例患者中传统培养共检出细菌8例（含结核分枝杆菌1例）,真菌4例,病原mNGS在30份标本中鉴定出60个病原体,其中细菌22例（含结核分枝杆菌4例）、真菌12例,mNGS检出的病原体数量和种类明显多于传统培养。病原mNGS检测阳性率41.18%（21/51）,高于传统培养阳性率23.53%（12/51）,差异有统计学意义（P=0.012）。病原mNGS检测细菌、真菌的灵敏度,特异性,阳性预测值,阴性预测值和约登指数分别为91.67％,74.36%、52.38%、96.67%、0.6603,将mNGS检测到的病毒、支原体计算在内,检测阳性率从传统培养的23.53％（12/51）增至60.78％（31/51）。结论：mNGS用于临床病原学检测较传统培养更敏感,有助于不明原因发热患者的诊断和抗菌药物的合理使用。     

多重降落PCR检测痰标本肺炎链球菌与b型流感嗜血杆菌

目的:建立可同时检测痰标本中肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Sp)与b型流感嗜血杆菌(Hae-mophilus influenzae type b,Hib)的多重降落PCR。方法:以Sp cpsA基因、Hib capⅡ区为靶标设计引物,并用Primer-BLAST在线软件检测其特异性,多重降落PCR检测492份痰标本,并以标准菌株作为对照,结果与细菌培养法进行比较。结果:所建立的多重降落PCR对Sp、Hib的检测下限分别达6.3 pg、0.2 pg;与细菌培养法相比,灵敏度及总灵敏度均达100%,检测Sp、Hib特异性分别为94%、98%,总特异性达92%。结论:所建立的多重降落PCR具有高灵敏度与特异性,可作为Sp、Hib感染的快速诊断与流行病学研究的备选手段。     

Detection of bacterial pathogens in cerebrospinal fluid using restriction fragment length polymorphism

Background: Polymerase chain reaction (PCR) is useful for rapid microbial detection in body fluids with low microbial load. It is easier to use universal or broad range primers for the amplification of conserved stretches of DNA common to all bacteria like 16S rRNA gene, followed by restriction fragment length polymorphism (RFLP) of PCR products.     

建立实时定量PCR检测临床样品中的麻风杆菌DNA

目的探讨建立实时定量PCR检测麻风病的方法,评价该方法对于麻风病的诊断价值。方法用17种可培养的分枝杆菌和4种常见球菌和杆菌检测RT-PCR的特异性,并系列稀释已知量的菌液至10-9以检测RT-PCR的敏感性。临床标本40例,包括TT 2,BT 17,BL 17,LL 1,I 3例。其中取皮损组织26份,常规组织液27份及血液样品34份。结果 RT-PCR最低检测限约为4.9个麻风菌/反应,17种其他分枝杆菌和4种细菌常见球菌和杆菌DNA均未扩增出RLEP片段。检测皮损、组织液和血液三种标本,发现皮损标本中麻风菌量最多;BI值与皮损中麻风菌DNA的Ct值之间存在负性相关,提示RT PCR可作为参考值用于定量患者麻风菌载量。结论用RLEP RT-PCR定量麻风菌细菌负荷,该方法敏感性高、特异性强,具有临床参考价值。     

16S-23S rRNA基因区间细菌鉴定实验研究

目的 :探讨 16 S- 2 3S r RNA基因区间对细菌鉴定的应用。方法 :以 16 S- 2 3S r RNA基因区间为靶序列设计引物 ,采用聚合酶链反应检测标准菌株及临床菌株 DNA。结果 :对 2 7株代表 2 7个菌种的标准菌株进行 PCR扩增 ,分别出现不同的 DNA图谱 ,该图谱能直接或经核酸内切酶处理后用于细菌分类 ,敏感性可达 2 .5 CFU/ml的细菌 ,与人外周血白细胞 DNA和真菌及病毒无交叉。 32株临床细菌标本均扩增出与相应标准菌株一致的图谱。结论 :16 S- 2 3S r RNA基因区间 PCR扩增技术检测细菌 ,具有敏感、特异、快速、准确的优点 ,为临床败血症病原的快速诊断提供了新的方法     

快速检测肺炎链球菌recA、ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的：建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法：设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100％,灵敏度达5pg／μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论：成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。     

PCR检测在真菌性角膜溃疡中的诊断价值

目的探讨聚合酶链反应(PCR)快速检测在真菌性角膜溃疡诊断中的价值。方法以源于医学条件致病性真菌18srRNA基因保守区的一对寡核苷酸序列为通用引物,对临床拟诊为真菌性角膜溃疡的36例标本进行PCR检测,并与培养方法进行对比。结果在400bp处出现DNA扩增带者为阳性。36份临床标本的真菌培养阳性率为58.3%,而经PCR扩增阳性率为86.1%,PCR扩增准确性为72.2%,敏感性为100.0%,特异性为33.3%。结论真菌通用引物进行PCR反应检测真菌性角膜溃疡速度快、阳性率高,有助于真菌性角膜溃疡的快速诊断。