快速检测肺炎链球菌recA、ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用

目的：建立快速检测肺炎链球菌recA,ply及16SrRNA基因的多重降落PCR方法并应用。方法：设计肺炎链球菌的特异基因recA,ply及其菌属保守序列16SrRNA基因的引物,建立多重降落PCR的反应体系及条件,通过该方法检测13株标准菌株的基因以判定recA、ply、16SrRNA基因的检测特异性;并通过对不同稀释度肺炎链球菌DNA的检测判定该方法的灵敏度。最后,应用多重降落PCR方法检测98份痰标本的肺炎链球菌,并与细胞培养法进行比较。结果：建立的多重降落PCR方法检测肺炎链球菌的特异性达100％,灵敏度达5pg／μL,该方法对98份痰标本中肺炎链球菌的检测结果与细胞培养法一致。结论：成功建立检测肺炎链球菌的多重降落PCR方法,灵敏度高,特异性强,可用于临床标本肺炎链球菌的快速检测。     

威海地区两种海洋弧菌多重降落 PCR体系的建立与应用

目的 分析威海地区食源性疾病中,海洋性弧菌的检出率,并建立一种可以同时检测创伤弧菌及溶藻弧菌的多重降落PCR反应体系.方法 收集怀疑食源性疾病患者粪便标本进行分离培养鉴定并分析,并且针对创伤弧菌的vvhA基因与溶藻弧菌的toxR基因分别设计两对特异性引物,应用Primer-BLAST检测引物特异性.应用该引物建立多重降落PCR,并检测93份粪便标本,其结果与细菌培养法进行比较结果.结果 威海地区怀疑食源性疾病患者粪便标本中共检出海洋性弧菌45例,以副溶血性弧菌为主,随后为创伤性弧菌和溶藻弧菌.所建立的多重降落PCR对致病菌两种基因(vvhA、toxR)DNA的检测下限分别为104 CFU/mL、103 CFU/mL;与细菌培养法相比,灵敏度及总灵敏度均达100％,检测vvhA、toxR基因特异性分别为96.47％ 、95.45％,总特异性达95.95％.结论 我们建立的多重降落PCR检测体系可用于由创伤弧菌和溶藻弧菌引起的食源性感染的快速诊断与流行病学调查.     

复合多聚酶链反应技术在流感嗜血杆菌和b型流感嗜血杆菌联合检测中的意义

目的 探讨复合多聚酶链反应（PCR）技术在流感嗜血杆菌（Hi)和b型流感嗜血杆菌（Hib)联合检测中的意义。方法 应用Hi种特异性引物和Hib型特异性引物混合的复合PCR对实验菌株和83份婴幼儿肺炎急性期痰标本和51份血标本、同期37份健康婴幼儿咽拭子标本及21份临床拟诊细菌性脑膜炎患儿和23份非细菌性脑膜炎患儿的脑脊液标本进行了检测。结果 复合PCR检测可同时鉴别Hib和非b型Hi,对Hib标准菌株检测的敏感性低限为10个菌体;肺炎患儿呼吸道标本的Hib阳性率（22．9％）明显高于健康儿童（0）、非b型Hi阳性率（10．5％）与健康儿童（16．2％）差别无显著性意义;51份血标本Hi阳性6份（11．8％）,均为Hib;21份细菌性脑膜炎脑脊液标本Hi阳性4份（19．0％）,均为Hib;23份非细菌性脑膜炎的脑脊液标本Hi均为阴性。结论 复合PCR可同时检测并鉴别Hib和非b型Hi,对Hib肺炎和肺膜炎具有一定的诊断价值。     

Taqman荧光探针技术检测结核分枝杆菌

目的：比较Taqman荧光探针技术与常规PCR电泳技术检测结核分枝杆菌的灵敏度及特异性，评价Taqman荧光探针技术（Taqman技术）检测临床标本中结菌的应用价值。方法：应用细菌培养法，常规PCR电泳技术与Taqman技术检测300份临床结核病患者痰标本及50份非结核呼吸系统疾病患者痰标本。结果：细菌培养法检测结核阳性率为112/300；常规PCR电泳技术检测结核菌阳性率为169/300，特异性96%；Taqman荧光探针技术检测结核菌阳性率为141/300，特异性100％。结论：Taqman荧光探针技术是一种全新的PCR分子杂交模式，集PCR扩增、荧光探针杂交、荧光检测一体化，在单一管内完成，简便、快速、防污染、敏感性高、特异性强，是结核病辅助诊断的有效方法。     

细菌性感染性腹泻常见病原菌的多重PCR检测

目的:建立一种能同时检测细菌性感染性腹泻标本中沙门菌、志贺菌、金黄色葡萄球菌和副溶血性弧菌的多重聚合酶链反应(PCR)检测方法。方法:根据沙门菌的invA基因序列、志贺菌的ipaH基因序列、金黄色葡萄球菌的nuc基因序列、副溶血性弧菌的tdh基因序列设计特异性引物,通过多重PCR反应对样品中上述4种病原茵的目标基因进行扩增,同时优化反应体系。结果:本方法的特异性和灵敏性良好,该方法能检测的灵敏度分别为103.56pg的沙门菌DNA,94.85pg的志贺菌DNA,14.1pg的金黄色葡萄球菌DNA,115.32pg的副溶血性弧菌DNA。结论:该方法特异性和灵敏度高,检测周期短,适用于细菌性感染性腹泻标本中多种致病菌的快速检测,具有较好的应用前景。     

多重荧光定量PCR检测婴幼儿腹泻病毒感染及其临床应用

目的:建立一种能同时检测婴幼儿腹泻粪便中常见病毒的多重荧光定量 PCR技术。方法:根据GenBank上几种病毒基因组保守序列设计引物序列,建立多重荧光定量PCR方法,对所建立的多重荧光定量PCR方法的特异性、灵敏性及重复性进行验证;并以所建立的方法对150例婴幼儿病毒性腹泻患者粪便标本进行检测。结果:所建立的多重荧光定量PCR检测方法具有很好的特异性,灵敏性检测可达102拷贝/mL,检测不同病毒核酸浓度各自的检测 Ct 值标准差均较小,变异系数均低于1.0%,具有较好的重复性;检测150 份粪便标本,多重荧光定量 PCR 的检出率为36%,胶体金方法检出率为38.67%,两者比较差别无统计学意义（χ2= 6.91,P > 0.05）。多重荧光定量 PCR方法中轮状病毒、腺病毒、诺如病毒、星状病毒的检出率分别为12.67%、6.00%、13.33%和4.00%,测序结果与已知病毒株基因都具有高度同源性。结论:所建立的多重荧光定量PCR方法快速、特异、灵敏,可以作为临床病原诊断的一个重要工具且适用于流行病学调查研究。     

多重荧光定量PCR快速检测6种常见下呼吸道感染病原菌

目的:探讨多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)检测6种常见呼吸道病原菌的检测方法。方法:采用BeaconDesigner7.9设计引物和探针建立MRT-PCR法,通过构建质粒标准品分析该方法的最低检出限。对176例临床标本中大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌和鲍曼不动杆菌进行回顾性检测,并用一代基因测序验证。结果:MRT-PCR法检测病原菌的最低检出限达103 copies/mL,大肠埃希菌19例,金黄色葡萄球菌30例,铜绿假单胞菌37例,肺炎克雷伯菌53例,阴沟肠杆菌15例,鲍曼不动杆菌22例,与传统鉴定方法报告病原菌一致,特异性达100%。通过一代基因测序结果完全符合。结论:使用多荧光通道PCR仪,采用多重PCR技术检测痰液标本中6种常见病原菌的基因检测方法,敏感性和特异性高,提高了检测效率。     

三种方法检测结核分枝杆菌的比较

目的比较PCR技术与抗酸染色法、改良罗氏培养法检测结核分枝杆菌的灵敏度和特异性,及在临床诊断中的应用价值。方法对108例临床确诊的结核病患者、90例结核性胸膜炎患者的痰标本和50例非结核患者痰标本应用PCR法、痰涂片抗酸染色法和改良罗氏培养法检测,对3种检测方法的结果进行分析比较。结果抗酸染色法检测结核杆菌阳性率为44.4%,改良罗氏培养法阳性率为57.4%,PCR技术检测阳性率为80.5%。结论 PCR技术是一种快速、敏感性高、特异性强的结核分枝杆菌辅助诊断方法,在临床上有重要应用价值。     

实验动物四种病原体多重PCR方法的建立与应用

目的建立快速检测多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的多重PCR方法。方法根据Gen Bank基因设计出特异性引物;经过多重PCR的优化,特异性和敏感性的检测,建立多重PCR体系。应用该PCR体系检测人工感染样本和实验动物的气管分泌物,并与传统方法做对比。结果多重PCR扩增出多杀巴氏杆菌(356 bp)、支气管鲍特杆菌(237 bp)、支原体(266 bp)和肺炎克雷伯杆菌(142 bp)的目的条带。肺炎克雷伯杆菌敏感性为10 pg,多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体敏感性为1 pg,特异性检测未从其他病原菌中检测出目的条带。应用建立的多重PCR体系检测人工感染样本的不同组合,45只实验动物气管检测出15只多杀巴氏杆菌阳性,9只肺支原体阳性,但传统培养方法和血清学方法未检测出阳性标本。结论本文建立的多重PCR方法操作简单、快速、特异性强、灵敏度高,能够实现对多杀巴氏杆菌、支气管鲍特杆菌、支原体和肺炎克雷伯杆菌4种实验动物病原体的快速检测。     

荧光定量PCR法在结核杆菌检测中的价值

目的探讨荧光定量PCR法检测技术在结核病诊断中的价值。方法采用荧光定量PCR法和抗酸染色法同时检测231例结核患者体液标本(121例痰标本、67例胸腹水及43例尿液标本),对检测结果进行比较。结果荧光定量PCR法的检测灵敏度为102Copy/ml,是抗酸染色法方法检测灵敏度100倍,且对除结核杆菌外的其他呼吸道病原体检测结果均为阴性。本研究痰标本、胸腹水标本及尿液标本的荧光定量PCR法阳性率均要高于抗酸染色法阳性率,比较差异均有显著性(﹤0.01)。结论荧光定量PCR方法检测结核杆菌具有特异性强、灵敏度高、简便、快速的特点,明显优于抗酸染色法,可作为结核病诊断的常规方法。     

荧光PCR熔解曲线法对痰样本结核分枝杆菌耐药性检测价值及耐药特征分析

目的：评估荧光PCR熔解曲线法（熔解曲线法）检测肺结核患者涂阳痰样本结核分枝杆菌（MTB）对一线抗结核药物耐药性价值及耐药特征分析。方法：收集涂阳且培养阳性肺结核患者痰样本和相应MTB菌株各142例,采用熔解曲线法检测痰样本MTB对抗结核药物链霉素（SM）、异烟肼（INH）、利福平（RFP）、乙胺丁醇（EMB）耐药情况,同时采用液体药敏法对相应MTB菌株耐药性检测,对两种检测结果行方法学比较。结果：以液体药敏法为标准,熔解曲线法检测痰样本MTB对4种抗结核药物耐药性结果差异无统计学意义（P>0.05）,熔解曲线法检测SM、INH、RFP、EMB耐药性的敏感度分别为：78.57% (11/14),70.00% (14/20),100.00% (12/12),71.43% (5/7);特异度分别为：92.97%(119/128),96.72%(118/122),97.69%(127/130),100%(135/135);两者符合率分别为：91.55%(130/142),92.96%(132/142),97.89%(139/142),98.59%(140/142);Kappa值分别为：0.601,0.696,0.877,0.826。结论：与传统液体药敏检测相比,熔解曲线法检测痰样本MTB对抗结核药物SM、INH、RFP、EMB的耐药性效能一致,特异度和符合率均较高。该法对结核患者涂阳痰样本MTB耐药性检测有较好临床参考价值。     

荧光定量PCR在结核分枝杆菌快速诊断中的研究

目的 在痰液标本中,探讨荧光定量PCR技术快速检测结核分枝杆菌应用的诊断价值。方法 选取210例初诊的疑似结核病患者的痰液标本,分别进行痰涂片、MGIT960液体培养以及荧光定量PCR的检测,其中103例标本还进行了Xpert MTB/RIF检测,通过比较来分析荧光定量PCR在检测结核分枝杆菌方面的敏感度和特异性。结果 荧光定量PCR方法从痰液中检出结核分枝杆菌的阳性率高达28%,显著高于痰涂片15.2%的检出率,并且与结核培养的30.9%检出率相接近。以MGIT960液体培养为金标准,荧光定量PCR方法检测痰液标本中的结核分枝杆菌的敏感度和特异度分别为67.7%、 89.7%,阳性预测值和阴性预测值分别为74.6%和86.1%,两者之间差异没有统计学意义。将荧光定量PCR方法与Xpert MTB/RIF诊断方法相比较,分析发现荧光定量PCR方法的敏感度和特异度分别为85.9%、94.9%,阳性预测值和阴性预测值分别为96.5%和80.4%,两者之间差异没有统计学意义。结论 荧光定量PCR方法在检测结核分枝杆菌时具有较好的敏感度和特异度,效果优于传统的痰涂片方法,并且与Xpert MTB/RIF方法具有较好的一致性。荧光定量PCR检测成本较低,且结果准确,在快速检测结核菌方面具有比较好的应用前景。     

淋病奈瑟氏菌三种检测方法的结果比较

目的：分析评价聚合酶链反应（PCR）、细菌培养、直接涂片染色3种方法检测淋病奈瑟氏菌（neisseria gonorrboeae,NG）的应用效果。方法：分别采用PCR检测法、细菌培养法、直接涂片染色法分别对366份女性阴道分泌物以及325份男性尿道分泌物进行检测,并对三种方法的阳性检测结果进行比较分析。结果：PCR检测180份女性阴道分泌物标本,NG-DNA阳性率为21.67%,150份男性尿道分泌物,NG-DNA阳性率为44.67%,经统计学处理,男女之间差异有统计学意义（P〈0.001）;细菌培养：108份女性阴道分泌物进行细菌培养,NG的检出率为16.64%,95份男性尿道分泌物进行细菌培养,NG的检出率为22.85%;直接涂片Gram染色：80份男性尿道分泌物进行Gram染色,NG的检出率为21.49%,78份女性阴道分泌物,NG的检出率为10.79%。3种检测方法经统计学处理,差异具有统计学意义（P〈0.01）。结论：PCR检测法特异性强,灵敏度高,可作为慢性淋病检测的首选方法。细菌培养检出率次之,直接涂片Gram染色的检出率最低。直接涂片Gram染色的检出率虽较低,但特异性高,在基层医院无PCR设备及细菌培养条件者可首选,是一种经济实用、简便易行的检测方法。     

LAMP与RT-PCR法检测痰结核分枝杆菌的效果比较

目的 比较环介导等温扩增技术(LAMP)和实时荧光PCR技术(RT-PCR)检测结核分枝杆菌的效果.方法 可疑肺结核患者痰标本118份,分别采用痰涂片镜检、罗氏固体培养基培养、LAMP、RT-PCR方法进行结核分枝杆菌检查.结果 结核分枝杆菌阳性检出率痰涂片镜检38%、罗氏固体培养基培养41%、LAMP 45%、RT-PCR 55%,4种方法阳性检出率比较差异有统计学意义(P＜0.05);以常规罗氏固体培养法为标准,LAMP法的灵敏性和特异性分别为92.0%(46/50)和86.8%(59/68),与罗氏培养法比较差异无统计学意义(P＞0.05),一致性强(Kappa=0.777);PCR法的灵敏性和特异性分别为86.0%(43/50)和66.2%(45/68),与罗氏培养法比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 RT-PCR检测法阳性率最高,但特异性低;LAMP法灵敏性和特异性较高,与传统培养法一致性好,操作简便易行、快速准确.     

TaqMan 探针荧光定量PCR支原体快速检测方法的建立及应用

目的： 在支原体16SrRNA的种属特异性区域设计一对引物及其相应的Taqman探针,建立荧光定量PCR方法,检测细胞培养物中支原体。方法：选择16srRNA支原体种属特异性区域作为扩增区,设计支原体通用引物,PCR扩增片段的预期大小为288 bp。回收PCR扩增产物,连接pMD-18T载体,转化JM109大肠杆菌,涂布Amp+琼脂平板,挑取阳性克隆进行PCR鉴定后提取质粒。构建荧光定量PCR绝对定量的标准品,设计荧光定量引物、探针,采用矩阵法对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用十倍稀释法检验灵敏度并与普通PCR法及培养法进行比较;对支原体及其他5种革兰氏阳性杆菌进行特异性检验;对培养法、普通PCR法及荧光定量PCR法检测样本的灵敏度进行比较。结果：支原体PCR产物大小约为288 bp,质粒质量浓度为13.9 mg/L,A260/Ａ280 (Ratio)为1
.780,质粒溶液浓度为4.25×109拷贝/ μL。10 μmol/L的引物浓度和10 μmol/L-1探针浓度为最佳反应浓度,双温循环及60℃退火温度为最佳的循环条件。检测灵敏度为4.250×101 拷贝。拷贝数与Ct值之间的线性关系表达式：Ct= －2.916×log拷贝数+40.02。特异性检验中5种革兰氏阳性杆菌样本检测均为阴性,支原体样本为阳性,表明特异性好。准确性检测中变异系数小,表明稳定性好。组内及组间相同浓度样本检测具有相同的Ct值,表明重现性好。样本检验中,荧光定量PCR检测出的阳性样本高于普通PCR及培养法。结论：支原体荧光定量PCR法检测细胞样本及临床样本中支原体快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好。     

不同检测方法在骨结核诊断中的应用效果比较

目的:比较利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术(Xpert MTB/RIF,简称"Xpert")、荧光PCR熔解曲线法及液体培养方法在骨结核诊断中的应用效果。方法:收集2017年1月至2018年12月期间166例疑似骨结核患者的脓液标本,分别进行分枝杆菌液体培养(MGIT960培养)、Xpert与荧光PCR熔解曲线法检测。以临床综合诊断为标准,对3种检测方法的敏感度和特异度进行比较分析;以液体药敏为金标准,评价Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测结核分枝杆菌利福平耐药的敏感度和特异度。结果:Xpert检测的敏感度分别高于荧光PCR熔解曲线法和MGIT960培养法,荧光PCR熔解曲线法的敏感度高于MGIT960培养法,差异有统计学意义(P<0.05);以MGIT960培养为标准,Xpert的敏感度高于荧光PCR熔解曲线法,差异有统计学意义(P<0.05);Xpert与荧光PCR熔解曲线法的特异度比较,差异无统计学意义(P>0.05);以液体药敏为金标准,Xpert和荧光PCR熔解曲线法检测利福平的敏感度和特异度均为80.0%和100%,两种方法与金标准进行一致性检验Kappa值均为0.872。结论:Xpert和荧光PCR熔解曲线法在骨结核诊断中的敏感性和特异度均优于液体培养方法,两种方法各有千秋,可根据实际情况选择。     

传统培养法和PCR法在分枝杆菌菌种鉴定中的对比研究

目的:对结核分枝杆菌复合群菌种鉴定的传统方法与PCR法进行对比研究,为临床应用提供科学依据。方法:将临床确诊结核病患者的317份痰标本做罗氏培养,分别用传统培养法和PCR法进行鉴别菌种,随机抽出一部分进行测序(金标准),用金标进一步鉴定两种结果的可靠性。结果:传统培养法敏感度、特异度、符合率分别为55.68%、58.33%、54.00%,而PCR法检测的敏感度、特异度、符合率分别为98.86%、50.00%、93.00%,明显优于传统培养法,两者检测的总符合率为53.00%,检测结果间差异有显著性(x~2=918.64,P=0.00)。结论:传统培养法检测分支杆菌菌种的结果不符合临床检验要求,且所需时间长,而PCR法方便、快速,可以较准确地确定分支杆菌菌种。