基于链置换反应的DNA等温扩增技术应用进展

DNA等温扩增是在恒定温度下用非热变性的方法解开DNA双链的一种扩增技术。链置换反应指某些具有链置换活性的DNA聚合酶在延伸新链的同时将下游旧链剥离,它已被用于多种体外等温扩增技术,包括链置换扩增、滚环扩增、多重置换扩增、环介导的等温扩增等。其主要应用于DNA测序、全基因组扩增、基因芯片、微生物病原体检测等领域。     

MDA-PCR检测痕量结核分枝杆菌核酸方法的建立

目的 建立基于多重置换扩增及PCR （MDA-PCR）技术检测痕量结核分枝杆菌（M.tb）核酸的方法。方法 制备含有M.tb插入序列IS6110和IS1081的不同稀释浓度的质粒DNA标准品。MDA-PCR分别通过检测质粒DNA标准品和其他细菌标准株基因组DNA来验证该方法的敏感度及特异性。另外，通过对模拟结核性脑膜炎（TBM）患者脑脊液（CSF）标本检测，评价该方法检测临床标本的可行性。结果 MDA-PCR方法对质粒DNA标准品IS6110、IS1081基因的最低检测下限分别为10、25拷贝，其检测敏感度是ST-PCR方法的40～100倍。另外，该方法对5种其他细菌标准株基因组DNA的检测结果均为阴性，无非特异性反应发生。MDA-PCR对模拟TBM患者CSF中M.tb IS6110及IS1081基因的最低检测下限均为1 CFU,其检测敏感度是ST-PCR的10⁴～10⁵倍。结论 MDA-PCR方法可提高对CSF中痕量M.tb核酸的检测效率，为TBM早期诊断提供了一种新的研究策略。     

MDA在PCR-RFLP基因分型中的实用性

目的:评估多重置换扩增(MDA)在聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)基因分型中的实用性.方法:用MDA法对50例样本进行了全基因组扩增,并用扩增后的DNA作为模板,对两个单核苷酸多态性(SNP)进行了PCR-RFLP基因分型.结果:对于所检测的两个SNP,以经MDA扩增的基因组DNA为模板,与未经MDA扩增的基因组DNA为模板进行的PCR-RFLP基因分型,结果完全一致.结论:MDA可用于PCR-RFLP等遗传分析.     

RAPD技术在中药材鉴定中的应用进展

随机扩增多态性DNA（random amplified pclymorphic DNA，RAPD）技术是1990年由Williams等发展起来的一项DNA分子标记技术。RAPD技术是建立在PCR技术的基础上．用一系列（通常数百个）不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链（一般为10bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。     

基于常规引物靶向结核分枝杆菌Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位的恒温扩增

目的 探讨基于特异常规引物（即引物不需折叠成特定二级结构）靶向恒温扩增重复DNA序列的方法，并测试其检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）的可能性。方法 以合成的重复DNA或以抽提的细菌基因组DNA为模板，用Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶进行恒温扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。结果 合成的重复DNA可用其特异常规引物进行恒温扩增。进一步，Mtb H37Rv Ⅱ型分枝杆菌散在重复单位（mycobacterial interspersed repetitive units，MIRUs）可用其特异常规引物对（即Ⅱ_MIRU-F和Ⅱ_MIRU-R）或单引物（即Ⅱ_MIRU-F）进行恒温扩增。相比于非分枝杆菌菌株、非结核分枝杆菌菌株、Mtb复合物菌株和临床分离株，Ⅱ_MIRU-F能够高特异地扩增Mtb菌株。Ⅱ_MIRU-F针对Mtb H37Rv基因组DNA的检测下限较高，且不能特异地区分Mtb阴性痰液样本和Mtb阳性痰液样本。结论 常规引物可恒温扩增重复DNA序列（包括Mtb Ⅱ型MIRUs）；Mtb Ⅱ型MIRUs特异引物Ⅱ_MIRU-F不适合用于痰液样本的检测。     

基于水凝胶的基因组DNA固定法研究

目的：通过对人基因组DNA固定化的研究,探讨特异性高的单点共价固定方法,实现对人基因组DNA的反复利用。
方法：选取Mirzabekov等发明的DNA-水凝胶共聚化学法作为基因组DNA固定方法,使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,以(CH2)6-NH2氨基末端修饰的PCR产物及甲酸随机断裂修饰的pGEM-T-HLA-G质粒为模板,使用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其固定效率,并通过PCR法检测该固定方法的热稳定性。将该法初步应用于人类基因组DNA的固定和反复利用,对基因组DNA扩增的片段进行测序,排除突变可能。
结果：使用甲基丙烯酰胺凝胶作为固相支持载体,实现了对质粒DNA以及人基因组DNA的固定和反复使用,该方法可以经受16轮的PCR扩增（每轮36个循环）。测序结果证实基因组DNA的扩增片段未发生突变。
结论：甲基丙烯酰胺凝胶法固定DNA的热稳定性好,特异性高,可用于全基因组测序及SNP检测。     

低模板量DNA的分型方法及其相关问题

随着法医DNA分析技术的发展,越来越多低模板量DNA的生物检材被提取,并要求进行STR分型。在此对快速发展的各种低模板量DNA STR分型方法如增加聚合酶链反应(PCR)循环数、纯化PCR扩增产物、激光捕获显微切割和PCR扩增前的全基因组扩增等予以介绍,并就LT-DNA法庭科学应用中存在的相关问题予以论述。     

基因组简并寡核苷酸引物聚合酶链反应的影响因素

目的:对影响现有微量基因组扩增方法--简并寡核苷酸引物聚合酶链反应(degenerate oligonucleotideprimed PCR,DOP-PCR)的因素进行探讨.方法:针对现有DOP-PCR扩增过程中存在的影响产物产量和特异性的因素进行分析,分别从不同的DNA模板来源、模板梯度稀释与否以及DOP-PCR扩增产物是否采用低熔点胶回收去除干扰分析的小片段等方面进行研究,最后以特异性基因(FTCD和CBS)PCR扩增的结果作为评价指标,了解上述因素对DOP-PCR扩增的影响.结果:以小鼠单个卵细胞基因组为模板与以肝基因组DNA为模板相比,在产量上前者明显低于后者,特异性上两者相当.小鼠肝基因组DNA梯度稀释作为模板进行扩增的结果没有明显差异.与未经低熔点胶回收的DOP-PCR产物相比,经低熔点胶回收的DOP-PCR产物在常规PCR扩增反应中得到的产物特异性更好.结论:应用DOP-PCR方法进行扩增时,小鼠单个卵细胞可以用来进行DOP-PCR的扩增从而用于对特异性基因的检测,但是在扩增产量方面需要进一步的改进或优化.对现有DOP-PCR反应进行产物低熔点胶回收纯化,能够增加产物的特异性,效果满意.     

乙型肝炎病毒基因生物信息学分析及特异片段的制备

目的制备HBV基因分型芯片模板。方法通过不同基因型HBV全基因组的序列比对,选取6个碱基位点作为分型位点,应用重叠区扩增基因拼接法(SOEing法)对C型HBV片段进行点突变。结果在所选位点上成功引入点突变。结论SOEing法是一种简便引入点突变的方法,可以应用此法制备HBV基因分型检测基因所需的模板DNA。     

链置换扩增(SDA)压电DNA传感器

目的：构建链置换扩增（SDA）压电DNA传感器，研究其响应特性，方法：（1）将SDA与压电DNA传感器结合，建SDA压电DNA传感器结合技术。（2）以结构菌IS6110片段为检测对象，研究SDA压电DNA传感器的响应特性，结果：（1）SDA压电DNA传感器的响应信号达到500Hz左右；（2）SDA压电DNA传感器出现频率下降的时间长度（响应时间）与加入的检测核酸的浓度相关；（3）不同浓度检测核酸（靶核酸）导致的频率下降绝对值差别不大。结论：SDA压电DNA传感器能直接检测基因组DNA；其响应时间与检测物（靶核酸）的加入量相关，可以用作定量依据。     

淋病奈瑟菌porA基因实时荧光环介导等温扩增方法的建立

目的 运用实时荧光环介导等温扩增技术(LAMP)建立一种快速准确检测淋球菌的方法,以期用于淋病的早期临床诊断.方法 以淋球菌porA为靶基因,设计保守性和特异性良好的引物,以淋球菌标准菌株基因组DNA为模板,进行LAMP扩增,用23种其他在生殖系统中存在的微生物验证其灵敏度和特异性.结果 实时荧光LAMP法可检测到1 pg/μl(103CFU/ml)淋球菌基因组DNA,稳定性良好,其针对23种其他在生殖系统中存在的微生物均不能扩增,porA引物对淋球菌高度特异,阳性结果15 min可快速检出.结论 成功建立了检测淋球菌porA的LAMP技术,为淋球菌的快速检测提供了新的手段,有望成为淋球菌常规检测的简便方法.     

短片段重复序列复合扩增技术在亲子鉴定中的运用

多位点复合扩增短片段重复序列（Short Tandem Repeat,STR）技术是运用最为广泛的人类遗传认定系统,其原因有以下几个方面：（1）可以对部分降解的或陈旧性生物标本中的DNA进行特异性扩增;（2）与DNA指纹技术、AMP-PLP技术和RFLP技术相比,STR技术仅需要1～5 ng的模板DNA;（3）可在同一PCR扩增管中加入3对以上的STR引物,在同一条件下进行扩增;（4）扩增结果易于分析,不需要放射性标记;（5）结果分析时,由于采用了等位基因Ladder,简化了结果的分析步骤,实现了结果分析的标准化,使得不同实验室的认定结果有了可比性,同时也为结果分析的自动化奠定了基础.于1998年初开始把这项技术运用于实际案例中,现将运用情况报告如下.     

滚环扩增原理及其在医药领域的应用

滚环扩增（rolling circle amplification，RCA）是新近发展起来的一种恒温核酸扩增方法。这种方法不仅可以直接扩增DNA和RNA，还可以实现对靶核酸的信号放大，灵敏度达到一个拷贝的核酸分子，因此在核酸检测中具有很大的应用价值和潜力。本文结合了滚环扩增技术在医药领域中的最新研究进展，介绍了滚环扩增的原理及其在医药领域中的应用。     

孕妇外周血血浆胎儿DNA的检测

目的：建立可靠有效的检测孕妇血浆胎儿DNA的方法,探讨其在非创伤性产前诊断中的价值。方法：采用引物引伸预扩增（PEP）法及巢式PCR技术对65例孕妇外周血血浆DNA进行正常男性SRY基因检测。结果：单用巢式PCR技术和联合应用PEP,PCR技术对怀男胎的孕妇血中SRY基因检出率分别为65．2％（30／46）和89．1％（41／46）,两组差异有极显著性,对怀女胎孕妇血中SRY基因的未检出率为78．9％（15／19）和94．7％（18／19）,两组差异无显著性。结论：应用PEP法可对胎儿DNA进行全基因组扩增使DNA模板量增加,并使继后的PCR技术检测SRY基因的敏感性明显提高,PEP法是解决母血中胎儿细胞数量太少的途径之一,孕妇血浆中胎儿DNA可成为非创伤性产前诊断的胎儿物质来源。     

检测痕量DNA CYP17基因MspA1I多态性方法探讨

目的建立一种有效的检测痕量DNA细胞色素P45017α酶基因MspA1I多态性的方法。方法利用自行设计引物扩增短DNA片段(208bp)，替代扩增长DNA片段(459bp)的Garey法，检测痕量模板DNA的CYP17基因多态性。结果得到了稳定的、重复性良好的目的DNA片段，使MspA1I多态性分型简便，易行。结论提示可将扩增的短DNA片段替代长DNA片段的原理和方法推广应用于其他痕量DNA多态性分型。     

LAMP与FQ—PCR技术检测HBVDNA的特异性和灵敏度比较

目的 采用环介导等温扩增反应（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技术与实时荧光定量 PCR（real-time fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR）技术检测 HBV DNA,并对 LAMP 方法的反应条件进行优化,比较两种方法检测 HBV DNA 的灵敏度及特异性。方法 选取经医院确诊的乙肝患者的血清,提取血清中的 HBV DNA 作为扩增模板,同时,对 LAMP 方法的各种条件进行优化,并分别采用 LAMP 和 FQ-PCR 两种方法对同一 HBV DNA 模板做 10 倍梯度稀释的标本进行 HBV DNA 的检测,比较其灵敏度;且分别用两种方法对乳头瘤病毒（HPV）、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 在相同条件下进行实验,观察两种方法在检测中是否出现假阳性结果,以确定两种方法的特异性。结果 对同一 HBV DNA 模板进行 10 倍梯度稀释后,FQ-PCR 技术在待测血清标本（2.38×107copy/ml）被稀释到 10-5,就难以进行准确检测了,而 LAMP 方法在待测血清标本被稀释到 10-7时,仍然能够获得较好的扩增结果;对 HPV、EB 病毒、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及正常人血清基因组 DNA 进行 LAMP 和 FQ-PCR 检测,结果均为阴性。结论 采用 LAMP方法可以成功、快速、高效、特异的扩增 HBV DNA,与 FQ-PCR 方法比较,都能特异地检测 HBV DNA,但 LAMP 方法具有更高的灵敏性,操作更为简单、方便,而且不需要昂贵的仪器,更适合基层检测机构的推广使用。     

Mdm2基因扩增在贲门癌中的作用及临床病理意义

目的 研究Mdm2基因扩增与贲门癌的关系及其与各种临床病理因素之间的相关性。方法 取新鲜贲门癌组织,用酚氯仿异物醇法提取基因组DNA;用差异聚合酶链反应（differential polymerase chain reaction,dPCR)技术检测mdm2基因扩谱。结果 38例贲门癌组织中7例有mdm2基因扩增（18．2％）,高中分化组的mdm2基因扩增阳性率（33．3％）较低分化组（5．0％）高（P＜0．05）;而mdm2基因扩增与其它临床病理因素之间,如年龄、性别、组织类型和淋巴结转移等均无相关性（P＞0．05）。结论 mdm2基因扩增在贲门癌并非少见,提示mdm2基因扩增可能是导致贲门癌野生型p53功能丧失的重要遗传改变;检测贲门癌mdm2基因扩增对估计该肿瘤的预后可能有所帮助。     

从少量人源粪便中分离隐孢子虫用于全基因组测序的研究

目的 直接从少量人源粪便样本中分离、纯化隐孢子虫卵囊,提取并扩增DNA,使其浓度和纯度符合全基因组测序（WGS）要求。方法 2013年12月-2014年10月收集来自美国佛罗里达州、爱达荷州和缅因州11份少量人源隐孢子虫粪便样本,每份200 mg,使用免疫磁珠分离（IMS）进行纯化卵囊;2014年8-12月收集来自美国农业部52份牛源隐孢子虫粪便样本作为对照,每份2 000 mg,采用饱和蔗糖、氯化铯密度梯度离心法和IMS等方法纯化卵囊。均使用QIAamp DNA Mini试剂盒提取基因组DNA,然后采用REPLI-g MIDI试剂盒进行全基因组扩增（WGA）;最后通过定量PCR(qPCR)对WGA产物进行评估。结果 11份人源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为68.00～257.80 ng/μL。qPCR对隐孢子虫小亚基rRNA基因（SSU rRNA）扩增显示,11个分离株的循环数阈值（Ct）范围为8.92～19.23, Ct值越小表明隐孢子虫基因组DNA浓度越高;其中有6个分离株Ct <15,54.54%的分离株满足WGS要求。52份牛源隐孢子虫WGA产物的DNA浓度为27.2...     

单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术的探讨

目的 对在单细胞水平β地中海贫血诊断膜芯片检测技术进行探讨。方法 采用15个碱基的随机引物对单个细胞的基因组进行引物延伸预扩增(Primer extension preamplification,PEP)，取其产物5μl分别对β地中海贫血的目的基因片段进行巢式或半巢式扩增，然后来用反向斑点杂交(Reverse dot blot,RDB)技术检测β地贫突变型。结果 将这些技术应用于4例已经确定突变基因型的β地贫患者及1例正常女性，检测结果与预料的相符。结论 结合我们的实验结果，提示在单个细胞或微量DNA模板水平运用基因芯片技术进行遗传病检测是可行的，而且将来在胚胎植入前基因诊断和无创性产前诊断领域可能有一定的实用价值。     

应用引物延伸预扩增反应技术检测孕妇血浆中的胎儿DNA

目的：建立一种检测孕妇血浆中胎儿DNA的新方法。方法;对65例5－41孕周的孕妇血浆中胎儿DNA采用引物延伸预扩增（PEP）后行特异性位点聚合酶链反应（PCR）扩增,并用探针微孔板杂交法检测PCR产物。扩增的基因为Y染色体短臂SRY基因,扩增片段的大小分别为351bp和254bp。结果：46例妊娠男性胎儿的孕妇中41例血浆中出现SRY基因扩增带,检出率89．13％;19例妊娠女性胎儿的孕妇中3例（15．79％）为假阳性。本研究孕早、中、晚期的性别符合率分别为100％、90．91％、75％,总符合率86．15％。结论：利用PEP法能解决孕妇外周血中胎儿细胞数量太少达不到常规扩增条件所要求的最低模板量的问题,同时配合探针微孔板杂交法能使诊断结果更准确。