GRP78重组表达腺病毒的构建及在HepG2细胞的表达及其相关功能研究

目的:构建葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)重组表达腺病毒pAd-GRP78,并感染HepG2细胞建立能够高表达GRP78的细胞模型,同时在HepG2细胞中研究重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖能力的影响。方法:利用腺病毒穿梭质粒pAd Track-TO4构建载有GRP78基因的穿梭质粒pAd Track-TO4-GRP78载体,并通过基因测序鉴定载体序列正确。将载体用PmeⅠ酶切线性化,与Ad Easy-BJ5183感受态细胞进行基因同源重组。将重组后的腺病毒载体经PacⅠ酶切线性化后,转染到HEK293细胞中进行包裹,根据增强绿色荧光蛋白(enhance green fluorescent protein,EGFP)的表达判断重组腺病毒的包装情况。通过反复离心和低温裂解细胞提取GRP78重组表达腺病毒。以人肝癌HepG2细胞为目标,进行病毒感染。通过qRT-PCR检测GRP78基因表达情况,使用Western blot检测GRP78蛋白的表达。最后感染HepG2细胞,通过MTS比色法检测重组表达GRP78腺病毒对细胞增殖的影响。结果:测序验证pAd Track-TO4-GRP78构建成功,酶切验证重组腺病毒载体pAd-GRP78构建成功。在HEK293细胞中将pAd-GRP78包裹,GPF荧光检测结果表示病毒包装成功。使用pAd-GRP78感染人肝癌HepG2细胞,qRT-PCR检测到细胞中GRP78基因的过表达,Western blot方法检测到GRP78蛋白的高表达。MTS检测结果显示重组表达GRP78腺病毒对HepG2肝癌细胞有促增殖作用。结论:实验成功构建了GRP78重组表达腺病毒,并验证了构建的腺病毒载体可以收集并感染HepG2细胞表达GRP78蛋白。证明了重组表达GRP78腺病毒能够促进肝癌细胞的增殖。为进一步研究GRP78的功能奠定了基础。     

GRP78基因短发夹RNA表达载体的构建和鉴定

目的构建葡萄糖调节蛋白78(GRP78)基因短发夹RNA表达载体并鉴定,为探讨GRP78对胃癌发生发展作用及机制提供前期基础。方法运用核糖核酸(RNA)干扰技术构建靶向干扰GRP78蛋白短发夹RNA(GRP78-shRNA)载体,载体经转化、抽提及测序,用脂质体将GRP78-shRNA载体瞬时转染至SGC-7901胃癌细胞中,应用荧光显微镜、反转录定量PCR(qRT-PCR)及免疫印迹(Western blot)观察GRP78表达情况。结果GRP78-shRNA载体测序显示序列正确;转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞可见绿色荧光;qRT-PCR和Western blot结果显示,转染GRP78-shRNA载体的SGC-7901胃癌细胞中GRP78基因和蛋白表达降低。结论成功构建并鉴定GRP78基因短发夹RNA表达载体。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体，转染入231细胞，利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况；并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞；反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因，下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

内质网伴侣分子GRP78在胆管癌细胞中的作用研究

目的:研究葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)在胆管癌细胞中的表达及其对胆管癌细胞增殖和迁移的影响.方法:体外培养胆管癌细胞QBC939、RBE和HCCC-9810,应用Western blot检测GRP78的表达,用CCK-8比色法和Transwell小室迁移实验检测GRP78对胆管癌细胞增殖和迁移的影响.结果:胆管癌细胞中GRP78呈高表达,且GRP78的高表达不依赖于内质网应激.干扰GRP78表达显著抑制胆管癌细胞的增殖和迁移(P＜0.05).结论:GRP78对胆管癌细胞的增殖和迁移起重要促进作用,GRP78在胆管癌治疗中具有潜在的靶点价值.     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作佑

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞(231)侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

短发夹状RNA对GRP78基因在结直肠癌RKO细胞中表达的抑制作用

目的探讨短发夹状RNA对糖调节蛋白78(GRP78)在结直肠癌RKO细胞中表达抑制作用。方法以脂质体Lipofectamine2000介导GRP78短发卡状RNA(shRNA-GRP78)质粒表达载体转染RKO细胞,G418筛选得到稳定表达株,半定量RT-PCR和Westernblooting方法检测GRP78mRNA和蛋白水平变化。结果转染成功并筛选出稳定表达RKO细胞株。与对照组相比,shRNA-GRP78转染RKO细胞GRP78的mRNA及蛋白水平均显著下降(t=7.079、7.510,P<0.05)。结论 shRNA-GRP78能明显抑制RKO细胞GRP78mRNA及蛋白的表达,为进一步在体内外研究GRP78在结直肠癌中的作用奠定了基础。     

腺相关病毒主要调控蛋白Rep78的表达及其与HBV-X基因启动子的体外结合

目的对腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)Rep78蛋白对乙肝病毒X启动子(HBV-X promoter)的可能作用进行初步研究。方法利用pMAL-Rep78(含有Rep78全长基因的表达质粒)在大肠杆菌中表达并纯化得到带有AAVRep78蛋白的MBP-rep78融合蛋白;通过SDS-电泳及免疫印迹(Western blot)鉴定蛋白表达。合成地高辛标记的X启动子3段探针;以非放射性凝胶电泳阻滞实验(EMSA)检测Rep78与HBV-X启动子的结合。结果得到纯化的MBP-rep78融合蛋白;EMSA结果显示Rep78蛋白在体外能够与HBV-X启动子DNA结合,并有剂量依赖关系。结论AAVRep78可以与HBV-X启动子结合。     

稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J的建立

目的设计并构建编码大鼠葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的短发夹样RNA(shRNA)慢病毒载体,用以建立稳定沉默GRP78基因的大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。方法设计并合成3条编码大鼠GRP78mRNA的shRNA质粒表达载体,用三质粒包装系统包装成慢病毒,并以相应慢病毒转导大鼠胰腺腺泡细胞株AR42J。经流式细胞分选术(FCAS)筛选出绿色荧光蛋白(GFP)阳性细胞,采用real-time PCR及Western blot方法检测GRP78基因的mRNA和蛋白表达。结果测序证实,成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3。慢病毒转导AR42J细胞后,经荧光显微镜和FCAS证实转导效率>85%。经real-time PCR验证,与未处理组相比,LVshGRP78-1、LVshGRP78-2和LVshGRP78-3处理组对GRP78mRNA表达的沉默效率分别为69.4%±1.42%、74.7%±1.69%和86.6%±1.73%(P<0.05),含无义序列的阴性质粒LV-Non Target对照组与未处理组相比,GRP78mRNA的表达差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示各组GRP78蛋白表达与mRNA表达趋势一致。结论成功构建了编码GRP78的shRNA慢病毒载体,建立了稳定沉默GRP78基因的胰腺腺泡细胞株AR42J,为探讨GRP78基因在急性胰腺炎发病机制中的作用提供了新的细胞模型。     

葡萄糖调节蛋白78在胰腺导管腺癌中的表达及其临床意义

目的探讨在胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma,PDCA）中葡萄糖调节蛋白78（glucose regulated protein78,GRP78）的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学技术分析30例胰腺癌组织和对应的癌旁组织中GRP78蛋白的表达水平,并分析GRP78的表达与患者临床病理资料的关系。结果免疫组化结果显示GRP78在癌组织中表达明显高于癌旁组织（73．3％ vs 23．3％,P〈0．05）。单因素分析发现GRP78高表达的患者预后较差（P=0．009）。Western blot显示GRP78在中低分化癌细胞中的表达明显高于高分化癌细胞（P〈0．05）。结论GRP78在胰腺癌组织中高表达,可能参与胰腺癌的发生发展,GRP78高表达可能有助于判断胰腺癌患者的预后。     

葡萄糖调节蛋白78对人舌癌细胞侵袭的影响及其机制

目的：探讨葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78，Grp78)对人舌癌细胞系Tca-8113侵袭的影响及其分子机制。方法应用pcDNA3.1(+)-Grp78重组质粒转染舌癌细胞系Tca-8113筛选得到稳定表达Grp78的克隆(78C6)，再应用siRNA-Grp78转染78C6敲除Grp78表达，应用Transwell实验分析其侵袭能力，免疫荧光和细胞伸展实验检测细胞骨架排列和细胞伸展情况，GST-pulldown技术对Rac1和RhoA活性进行分析，Western blot检测Rac1、RhoA、MMP-9和MMP-2的表达。结果 Transwell实验结果显示，特异性上调Grp78表达明显促进舌癌细胞的侵袭，并且这种促进作用可以被siRNA-Grp78转染抑制，差异有统计学意义(P＜0.05)。进一步的研究发现，与对照组相比，Grp78高表达可以促进舌癌细胞Tca-8113的伸展和极性形成，差异有统计学意义(P＜0.05)。细胞骨架染色结果表明特异性上调Grp78后，细胞骨架微丝主要分布于细胞边缘，而这种作用可以被siRNA-Grp78转染抑制，导致细胞皮质部位出现明显的应力纤维。GST-pulldown结果表明，与对照组相比，Grp78高表达使Rac1的活性水平增高，RhoA活性降低，而siRNA-Grp78转染的细胞中Rac1活性降低，RhoA活性升高。Western blot研究显示，与对照组相比，Tca-8113/Grp78细胞中MMP-2和MMP-9表达增高(P＜0.05)， siRNA-Grp78转染的细胞中MMP-2和MMP-9表达降低(P＜0.05)，而RhoA和Rac1的表达前后无变化。结论 Grp78通过激活Rac1抑制RhoA活性及上调MMP-2和MMP-9表达来促进舌癌Tca-8113细胞的侵袭。     

Butein增强mH2A靶向GRP78蛋白通过MAPK信号通路 调控黑色素瘤的生物学行为

目的：探讨组蛋白变异体macroH2A(mH2A)和Butein共同作用GRP78蛋白通过丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activation protein kinase,MAPK)信号通路调控黑色素瘤的生物学行为。方法：采用免疫组织化学检测黑色 素瘤和癌旁正常组织中mH2A和葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein of 78,GRP78)的表达情况;分析临床资料 与mH2A和GRP78表达的关系;免疫共沉淀实验检测GRP78和mH2A蛋白的相互作用;Western印迹检测mH2A和GRP78 的相关作用及Butein与mH2A之间的作用。Transwell试验检测mH2A的表达对黑色素瘤细胞侵袭能力的影响;划痕试 验检测mH2A的表达对黑色素瘤细胞迁移能力的影响;Western印迹检测沉默mH2A后细胞外信号调节激酶1(ERK1) 和MAPK/ERK激酶(MEK)蛋白的表达。结果：与癌旁正常组织相比,黑色素瘤组织中mH2A和GRP78表达明显降低 (P<0.05);Butein可以增强mH2A的表达水平(P<0.05),mH2A可以调节GRP78蛋白的表达(P<0.05);沉默mH2A促进黑色素 瘤A375细胞的侵袭迁移能力,上调MEK和ERK1蛋白的表达。结论： Butein可以增强mH2A靶向GRP78蛋白通过MAPK信 号通路抑制黑色素瘤细胞的迁移和侵袭行为。     

胃癌中葡萄糖调节蛋白78和葡萄糖调节蛋白94表达的临床意义及与预后的相关性

目的确定葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP78）和葡萄糖调节蛋白94（glucose-regulated protein 94,GRP94）与胃癌（gastric cancer,GC）临床病理特征及预后的相关性。方法应用Western blotting和免疫组织化学方法检测GC和切缘组织中GRP78和GRP94的表达;Kaplan-Meier或卡方检验GRP78、GRP94和临床病理资料与GC术后整体生存期相关性。结果 GRP78和GRP94蛋白主要表达于胃癌细胞的胞质及胞膜,其阳性表达与淋巴结转移、TNM分期呈负相关,与分化程度正相关（P〈0.05）;GRP78、GRP94高表达及低表达GC患者术后平均生存时间分别为（23.51±2.32）个月和（37.54±3.24）个月、（21.31±1.46）个月和（40.02±2.19）个月,5年整体生存率分别为21.23%和41.42%、20.73%和43.86%（log-rank test,P〈0.01）,TNM分期、GRP78和GRP94是影响GC预后的独立因素。结论 GRP78和GRP94高表达可能是GC预后不良的分子标志物之一。     

蛋白激酶CK2B的相互作用蛋白筛选

目的研究与蛋白激酶CK2B发生相互作用的蛋白。方法应用酵母双杂交系统,以人蛋白激酶CK2B为诱饵,筛选成人肝cDNA文库,利用生物信息学分析,一对一酵母回复性杂交等提供的信息,筛除假阳性。结果经过酵母双杂交共获得211个克隆,经过验证分析,最终确定12个相互作用蛋白,其中3个是已知的,9个是新发现的相互作用。结论获得的9个新的相互作用蛋白可能揭示CK2新的作用机制。     

bFGF对NIH3T3细胞TPK,PKC,ERK活性的影响

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对NIH3T3细胞酪氨酸蛋白激酶(TPK)、蛋白激酶C(PKC)及胞外调节蛋白激酶(ERK)活性的影响,探讨其信号转导机制.方法:分别加入bFGF及PKC抑制剂H-7、MEK1抑制剂PD98059孵育细胞,利用[γ-32P]ATP掺入外源性底物的方法测定活性.结果:bFGF可使细胞膜TPK、细胞质PKC及ERK活性明显升高.H-7 bFGF、PD98059 bFGF组与只加bFGF组比较TPK活性保持不变,而PKC及ERK活性均下降.结论:TPK、PKC、ERK介导bFGF的信号转导.ERK与PKC是TPK受体下游的两个分支,PKC与ERK可以互相激活.     

人体甲状腺癌组织中蛋白激酶C和蛋白激酶A活性水平的测定

目的研究蛋白激酶C(protein KinaseC,PKC)和蛋白激酶A(protein kinaseA,PKA)在甲状腺癌发生过程中的作用.方法利用酶的放射分析方法测定手术切除经病理证实的18例甲状腺癌患者和17例甲状腺癌患者手术切除的肿瘤组织中PKC和PKA活性水平.结果甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为7.280±2.380和7.397±4.065,PKA活性水平为1.716±0.923.甲状腺癌组织中胞膜和胞浆PKC活性分别为0.515±0.676和0.347±0.332,PKA活性水平为0.646±0.324.胞浆部分PKC与PKA活性比值甲状腺癌组织为4.3;甲状腺癌组织为0.53.结论PKC与PKA均参入甲状腺癌细胞的增殖过程.     

淫羊藿苷介导MAPK信号通路促进间充质干细胞株C3H10T1／2成骨分化的体外研究

目的：探索补肾中药淫羊藿有效成分淫羊藿苷对间充质干细胞株C3H10T1／2的促成骨分化作用,及该作用与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路的相关性。方法：体外培养间充质干细胞株C3H10T1／2,给予淫羊藿苷（0、10^-7、10^-6、10^-5和10^-4mol／L）联合成骨诱导液干预26d后,碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）染色观察成骨分化情况。10^-5mol／L淫羊藿苷干预C3H10T1／2细胞2、8、24与48h后,实时荧光定量聚合酶链式反应法（polymerase chain reaction,PCR）检测p38、细胞外调节蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase,p42／44）mRNA的表达。10^-5mol／L淫羊藿苷干预C3H10T1／2细胞10、30、60和120min后,蛋白质印迹法检测p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated proteinkinase,p38）、p42和p44,以及翼式转录因子氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase,JNK）及其磷酸化产物的蛋白表达情况。结果：10^-5mol／L淫羊藿苷联合成骨诱导液的促进C3H10T1／2细胞成骨分化能力最强。PCR结果显示,淫羊藿苷作用2h后p38基因表达显著下调（P〈0．01）;p42和p44mRNA水平在淫羊藿苷干预2h后均显著下调（P〈0．01）,而在淫羊藿苷干预48h后表达均上调（P〈0．05,P〈0．01）;其他时间点各通路基因表达情况均无显著变化（P〉0．05）。10^-5mol／L淫羊藿苷作用10min后,磷酸化p42／44蛋白表达减弱,磷酸化p38蛋白表达增强,并持续到30min,但对JNK蛋白的表达无明显影响。结论：淫羊藿苷促进间充质干细胞株C3H10T1／2向成骨细胞分化,其作用可能与激活p38和抑制ERK蛋白的表达有关。     

PKC和TPK在血小板激活中的作用

目的为了研究蛋白激酶（PKC）和酪氨酸蛋白激酶（TPK）在血小板激活中的作用。方法用卟啉酸肉豆蔻乙酸酯（PMA）,凝血酶,前列腺素E1（PGE1）和环磷酸腺苷（db－cAMP）,在含二磷酸腺苷（ADP）清除剂的缓冲剂中去激发经阿司匹林切断,32P－NaH2PO4标记冲洗后的牛血小板。40KD（PKC的底物）的磷酸化程度随PMA或凝血酶的浓度而增加。同样26KD、38KD的磷酸也是如此。由于PMA诱导的血小板聚集的同时伴随PKC活化。PGE（腺苷环化酶激活物）不能抑制由50nmol/1PMA诱导的血小板聚集,db-cAMP,腺苷不能抑制PKC引起的蛋白磷酸化。结果在碱处理的聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGEgel）中发现40KD和57KD多肽比其他多肽更有抗碱力。40KD和57KD多肽的磷酸氨基酸分析指出含有磷酸丝氨酸、磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸。结论在PMA、凝血酶激活的血小板中,PKC、TPK都发生激活作用,40KD废物是PKC的底物又是TPK的底物,PKC和TPK在血小板聚集中起着重要调节作用。     

Parathyroid hormone-mitogen-activated protein kinase axis exerts fibrogenic effect of connective tissue growth factor on human renal proximal tubular cells

Background Enhanced and prolonged expression of connective tissue growth factor （CTGF） is associated with kidney fibrosis. Parathyroid hormone （PTH） is involved in the genesis of disturbed calcium/phosphate metabolism and ostitis fibrosa in renal failure. PTH activated mitogen-activated protein kinase （MAPK） signaling pathway is present in renal tubular cells. The aim of this study was to identify the mechanism how the signal is transduced to result in extracellular signal-regulated protein kinase （ERK） activation, leading to upregulation of CTGF.Methods The levels of CTGF mRNA and protein in human kidney proximal tubular cells （HK-2） treated with PTH in the presence or absence of the MAPK inhibitor PD98059 were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction （RT-PCR） and immunoblotting assay. The activation of the CTGF promoter in HK-2 cells was determined by the dual-luciferase assay. The effects of the protein kinase A （PKA） activator 8-Br-cAMP and protein kinase C （PKC） activator phorbol 12-myristate 13-acetate （PMA） on MAPK phosphorylation, and the effects of the PKA inhibitor H89 and PKC inhibitor calphostin C on MAPK phosphorylation and CTGF expression were detected by immunoblotting assay.Results PD98059 inhibited the PTH stimulated expression of CTGF, which strongly suggested that the MAPK signaling pathway plays an important role in the PTH-induced CTGF upregulation in renal tubular cells. A PKA activator as well as PKC activators induced MAPK phosphorylation, and both PKA and PKC inhibitors antagonized PTH-induced MAPK phosphorylation and CTGF expression.Conclusion CTGF expression is upregulated by PTH through a PKC/PKA-ERK-dependent pathway.