720例甲基丙二酸血症MMACHC基因c.609G>A突变患者临床特征及随访分析

目的：分析携带MMACHC基因c.609G>A（p.W203X）突变的cblC型甲基丙二酸血症（MMA）患者的临床表现、治疗效果、预后及影响因素。方法：回顾性分析2007至2020年在上海交通大学医学院附属新华医院就诊的720例携带c.609G>A突变的cblC型MMA患者的临床及实验室检查资料。根据基因突变位点不同将患者分为三组,携带c.609G>A纯合突变的患者为A组（172例）;携带c.609G>A与c.482G>A（p.R161Q）、c.80A>G（p.Q27R）及c.394C>T（p.R132X）中任一突变形成的复合杂合突变患者为B组（169例）;携带c.609G>A与上述突变位点以外突变[如c.658_660delAAG（p.K220del）、c.315A>T（p.Y105X）、c.567dupT（p.I190fs^*13）]的复合杂合突变患者为C组（379例）。对不同基因突变位点患者的临床表现,血酰基肉碱、血同型半胱氨酸、尿有机酸水平以及治疗效果进行比较,根据随访结果采用logistic回归分析患者预后的影响因素。结果：720例患者中306例（42.5%）来自新生儿筛查,其中156例发病;414例未进行新生儿筛查的患者中10例因同胞确诊后诊断（临床未发病）,其余404例均为临床发病病例。560例发病患者中,发病年龄中位数为1.2个月（3?d~20岁）。B组发病年龄晚于A组和C组,三组间发病年龄差异有统计学意义（P<0.01）。患者临床症状各异,1岁以内发病患者多表现为呕吐、腹泻、喂养困难及抽搐,1岁以后发病患者多以运动障碍及智力落后为主要表现。肾脏疾病起病的患者均携带c.80A>G或c.482G>A突变,伴有肺动脉高压的患者均携带c.80A>G突变。长期随访患者621例,其中预后正常156例（25.1%）,落后433例（69.7%）,死亡32例（5.2%）。剔除失访、死亡及资料缺失的患者,对559例患者的预后影响因素进行logistic回归分析,结果显示新生儿筛查与否、发病与否、发病年龄及基因突变位点对预后的影响有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：MMACHC基因c.609G>A突变与早发型MMA相关,患者多于出生后1个月内起病。维生素B12肌内注射对携带不同突变的患者均有效。新生儿筛查对患者预后有益,而临床发病则不利于患者预后,携带c.609G>A纯合突变患者较携带c.609G>A与其他突变位点形成的复合杂合突变患者预后差。     

海南省新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症发生情况及基因突变分析研究

背景　葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）缺乏症会因遇到某些诱因而引起急性的溶血性贫血,严重者可危及生命。海南省是G6PD缺乏症的高发地区,并且该病具有地域和种族特异性,通过筛查和最终基因确诊可做到积极有效的预防。但是目前还未见海南省人群G6PD缺乏症基因层面的报道。目的　调查2017年度海南省新生儿G6PD缺乏症发生率,并分析其基因突变特点。方法　选取全海南省内各助产单位2017-01-01至2017-12-31出生的活产新生儿130 512例。采集符合纳入标准的新生儿的足跟血制成滤纸干血片用于G6PD基因初筛。对于初筛可疑样本,采用G6PD/6-磷酸葡萄糖脱氢酶（6GPD）比值法进行生化检查确诊。生化检查确诊为G6PD缺乏症的患儿,找出其干血片进行基因分型。结果　2017年度海南省全省新生儿G6PD缺乏症初筛样本中初筛阳性率为4.00%（5 221/130 512）,G6PD/6GPD确诊2 993例,经基因检测该2 993例新生儿均有G6PD基因突变。海南省新生儿G6PD/6GPD确诊G6PD缺乏症发生率和G6PD基因突变率均为2.29%（2 993/130 512）。G6PD/6GPD确诊G6PD缺乏症发生率汉族为1.80%（1 972/109 590）,黎族为5.28%（934/17 698）,其他民族为2.70%（87/3 224）。黎族G6PD缺乏症发生率高于汉族（χ2=826.206,P<0.001）。本次共检出10种基因突变类型：1 636例（54.66%）c.1376G>T,659例（22.02%）c.1388G>A,254例（8.49%）c.95A>G,204例（6.82%）c.1024C>T,93例（3.11%）c.871G>A,64例（2.14%）c.519C>T,25例（0.84%）c.392G>T,22例（0.74%）c.1360C>T,19例（0.63%）517T>C,11例（0.37%）c.592C>T,并检出8例（0.27%）c.1376G>T复合c.1388G>A突变,3例（0.10%）c.1376G>T复合c.871G>A突变,3例（0.10%）c.1376G>T复合c.517T>C突变。并发现5例（0.17%）未知突变,其中1例487G>A、1例1004C>A和1例c.86C>T,在海南省人群未见报道。结论　海南省新生儿G6PD缺乏症发生率较高,且显著高于汉族。同时,G6PD缺乏症基因突变类型以c.1376G>T、c.1388G>A、c.95A>G 和c.1024C>T为主;且发现5例未知突变,其中c.86C>T、c.487G>A和c.1004C>A突变各有1例。     

广东潮州地区新生儿葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症基因突变分析

目的：了解潮州地区新生儿的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency,G6PD）缺乏症的发病率及基因突变特点。方法：采用荧光斑点法对2010至2012年潮州市中心医院出生的2 500例新生儿进行G6PD缺乏筛查。对初筛阳性的67例标本用高分辨熔解曲线分析技术（high-resolution melting,HRM）和PCR-DNA测序法进行基因分型。结果：本次筛查发现潮州地区新生儿人群的G6PD缺乏症总发生率为2.6%（67/2 500）,其中男婴44例（3.22%,44/1 365）,女婴23例（2.03%,23/1 135）,男女检出率比为1.91∶1（44/23）,两者之间无统计学差异（ χ2=3.404,P=0.065）。67例初筛阳性标本中58例检测出有突变,9例未检出突变,共检出7种基因突变,含26例1 376 G>T（c.1466G>T,44.83%）,22例1 388 G>A（c.1478G>A,37.94%）,5例95 A>G（c.185A>G,8.62%）,2例871 G>A（c.961G>A,3.45%）,1例392 G>T（c.482G>T,1.72%）,1例493 A>G（c.583A>G,1.72%）,1例1360 C>T（c.1450C>T,1.72%）,没有检出复合突变类型。结论：潮州地区具有较高的G6PD发生率。G6PD Canton（1376 G>T）、G6PD Kaiping（1388 G>A）和G6PD Gaohe（95 A>G）3种突变类型最常见。     

海南黎族自治县地区新生儿G6PD缺乏症基因分析

目的了解海南省黎族自治县地区葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD)缺乏症发病情况和基因突变特点。方法收集该地区2017年1—12月出生的新生儿干血片,采用荧光分析法进行G6PD酶活性筛查,对初筛阳性的干血片样本采用多色探针荧光PCR熔解曲线法(MMCA)进行基因突变分析。结果共收集14 130例新生儿干血片,G6PD酶活性筛查共筛出1 059例阳性,初筛阳性率为7.49%,其中男性682例,女性377例,男性新生儿G6PD初筛阳性率9.13%,女性5.66%,男女初筛阳性率差异有统计学意义(P<0.01)。黎族新生儿初筛阳性率8.33%,汉族6.25%,不同民族比较差异有统计学意义(P<0.01)。通过MMCA法对1 059例初筛阳性干血片进行基因检测分析,共检出864例样本发生突变,突变率81.59%;男性突变率86.07%,女性73.47%,男女间差异有统计学意义(P<0.01);黎族突变率83.26%,汉族77.71%,突变率差异有统计学意义(P=0.033)。本次共检出11种G6PD基因单一突变型(c.1376 G>T、c.1388 G>A、c.95 A>G、c.871 G>A、c.519 C>T、c.1024 G>T、c.392G>T、c.1360C>T、c.517T>C、c.592C>T和c.86C>T)和5种复合突变型,其中c.1376 G>T复合c.871 G>A突变、c.1376 G>T复合c.517 T>C突变和c.392 G>T复合c.871G>A突变在海南省尚属首次报道。结论海南省黎族自治县地区是G6PD缺乏症高发区,黎族为高发人群,基因突变类型复杂多样,突变以c.1376G>T、c.1388G>A、c.95 A>G和c.871 G>A四种最为普遍。在G6PD缺乏症高发地区开展G6PD的活性筛查和基因检测,有利于G6PD缺乏症的确诊和防治,提高出生人口素质。     

苯丙氨酸羟化酶基因c.158G>A(p.Arg53His)突变患儿随访及突变位点功能评估

目的：评价苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因c.158G>A（p.Arg53His）突变的临床意义。方法：持续监测2例携带PAH基因p.Arg53His突变的疑似高苯丙氨酸血症患儿血液中苯丙氨酸（Phe）浓度,分析患儿的临床生化特征,应用T-Coffee系统分析PAH蛋白的跨种属保守性,应用Swiss-Model对正常结构及变异结构的PAH进行蛋白质三维结构建模及比对分析突变所致蛋白质空间结构的改变。检索现有数据库及文献统计p.Arg53His突变的人群携带率,应用等位基因表型值（APV）与基因型表型值（GPV）预测系统对该突变相关表型进行预测。结果：2例新生儿在PAH基因上分别检出两个突变：c.611A>G（p.Tyr204Cys）、c.158G>A（p.Arg53His）和c.1238G>C（p.Arg413Pro）、c.158G>A（p.Arg53His）。2例新生儿能耐受正常饮食,在随访期间血Phe水平在正常范围内。例2的母亲为p.Arg53His纯合突变,长期未进行低蛋白质、低Phe饮食干预,血Phe浓度、Phe/酪氨酸比值均在正常范围。突变的氨基酸在13个不同物种间并非高度保守。三维结构建模结果显示,p.Arg53His突变使得PAH第53位和第49位氨基酸之间的氢键由2个减少为1个,降低了二聚体的稳定性。p.Arg53His在高苯丙氨酸血症患者中的等位基因频率为0.015?08,在健康人群中的等位基因频率为0.001?621,其中东亚人群中的携带率最高,为0.013?73。APV与GPV系统预测结果显示,该突变与轻度高苯丙氨酸血症型别相关。结论：PAH基因p.Arg53His突变与不同突变组合为复合杂合状态可引起临床表型差异。p.Arg53His突变引起体内酶活性的降低不足以出现苯丙酮尿症临床症状,分类为“可能良性”。     

人抑癌基因p53与PTEN的CRISPR-Cas9导向RNA靶点筛选与效率验证

目的：探讨应用新兴基因编辑技术规律性成簇的间隔短回文重复序列-核酸酶系统（CRISPR-Cas9）对人体内2个抑癌基因p53与PTEN进行编辑的可行性,并通过体外检测研究其编辑效果,为原代细胞向肿瘤细胞转化及建立人源化小鼠肿瘤模型提供实验研究工具。方法：序列分析确定p53及PTEN基因各亚型mRNA剪辑的共同外显子区域,针对该区域进行软件评分,设计选择针对p53及PTEN基因的CRISPR-Cas9导向RNA （sgRNA）靶点各2个,即p53-1、p53-2、PTEN-1和PTEN-2。构建共表达sgRNA与Cas9-P2A-GFP的CRISPR-Cas9质粒。选择处于对数生长期的293T细胞,将其分为对照组（未转染质粒的野生型293T细胞）和实验组（利用Lipofectamine2000转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP共表达质粒的293T细胞）,流式细胞术分选实验组绿色荧光蛋白（GFP）阳性细胞（成功转染质粒的细胞）,2周扩增培养后提取基因组DNA,PCR扩增基因组DNA包含突变位点的区段,将扩增产物凝胶电泳后胶回收,连接至pEASY-Blunt Zero克隆载体中,转化,挑取单克隆菌斑培养,提取质粒DNA测序,对比对照组与实验组测序结果后确定RNA介导的特异基因位点突变效率。结果：转染sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒的实验组流式细胞术分选后GFP阳性率高达82%,与分选前（4%）比较明显升高（P<0.05）。对分选培养后的细胞提取基因组PCR,其中包含p53突变位点的扩增片段长度均为612 bp,而包含PTEN-1突变位点的扩增片段长度为667 bp,包含PTEN-2突变位点的扩增片段长度为947 bp。对比实验组基因测序结果与未经sgRNA-Cas9-P2A-GFP质粒转染的对照组野生型细胞测序结果,p53-1、p53-2和PTEN-2诱导的突变效率分别为54.5%、45.5%和33.3%。结论：针对人p53及PTEN基因设计的sgRNA p53-1、p53-2和PTEN-2能够在基因组水平较高效率地成功介导Cas9进行位点特异性的基因编辑。     

荧光PCR熔解曲线法检测广东韶关地区G6PD缺乏症基因突变

目的:采用荧光PCR熔解曲线法检测广东韶关地区G6PD缺乏基因突变,获得基因突变谱并进行方法学应用评价.方法:采用荧光PCR熔解曲线法试剂盒对613例G6PD缺乏症表型筛查阳性样本,分两管检测中国人群常见的12种G6PD基因突变(95A>G、383T>C、392G>T、487G>A、517T>C、592C>T、871G>A、1004C>A、1024C>T、1360C>T、1376G>T、1388G>A).结果:613例标本中检出基因突变536例(男性365例,女171例,占87.44%),其中:1388G>A突变210例(占37.30%),1376G>T突变213例(占37.83%),95A>G突变55例(占9.77%),871G>A突变49例(占8.70%),1024C>T突变18例(占3.20%),1004C>A突变2例(占0.35%),1360C>T突变4例(占0.71%),383T>C突变1例(占0.18%),392G>T突变10例(占1.78%),517T>C突变1例(占0.18%),没有发现487G>A、592C>T突变类型.另外,女性双重杂合或纯合突变分布情况为:1388G>A纯合突变7例,1376G>T纯合突变4例,871G>A纯合突变1例,1388G>A/1376G>T杂合突变4例,1388G>A/871G>A杂合突变2例,1388G>A/95A>G杂合突变1例,1376G>T/1024C>T杂合突变1例,1376G>T/95A>G杂合突变1例,1376G>T/392G>T杂合突变2例.结论:1388G>A,1376G>T,95A>G,871G>A,1024C>T,1004C>A,1360C>T,383T>C,392G>T,517T>C是韶关地区最常见的基因突变类型,与已报道的中国南方人群突变谱相近;荧光PCR熔解曲线法G6PD缺乏症基因结果准确,可广泛应用于临床基因检测.     

贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因突变型

目的研究贵州土家族葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)基因致病突变型,检测G6PD缺乏症发生率及基因频率。方法通过硝基四氮唑蓝纸片法对2 789例土家族男性进行G6PD缺乏症定性筛查,用变性高效液相色谱技术和DNA测序对78例个体进行基因突变型鉴定。结果在2 789例纯系土家族男性中,发现2例酶活性异常。在印江县采集的78例(2例酶活性异常和76例正常)纯系土家族男性血样中,共检出G6PD c.1388G>A突变2例、c.1376G>T突变1例和c.1311C>T/IVS 11+93T>C突变2例,基因突变型分别占2.6%、1.3%和2.6%。结论在贵州土家族人群中发现c.1388G>A、c.1376G>T和c.1311C>T/IVS11+93T>C 3种突变型,是共同存在于中国人群的G6PD基因突变型,中华民族可能源于共同的祖先;贵州省印江县土家族男性G6PD缺乏症的基因频率为6.5%,可为上述地区G6PD缺乏症的防治提供依据。     

低钾型周期性麻痹患者的临床及基因特征

目的 分析低钾型周期性麻痹患者的临床特征及基因突变特点。方法 对32例低钾型周期性麻痹患者进行基因筛查,发现6例存在基因突变,回顾性分析这6例患者的临床及基因特征,并进行家系研究。基因检测应用聚合酶链式反应后直接测序。结果 6例患者均青少年发病,5例发作有明确诱因,检测血钾低且补钾治疗有效。5例患者有明确低钾型周期性麻痹家族史。患者基因突变分别为CACNA1S基因c.1583G>A（p.Arg528His）、c.2627T>A（p.Val876Glu）、c.2690G>A（p.Arg897Met）及c.2700G>C（p.Arg900Ser）突变以及SCN4A基因c.2015G>A（p.Arg672His）和c.2024G>A（p.Arg675Gln）突变,其中CACNA1S基因p.Arg528His和SCN4A基因p.Arg672His为热点突变,Arg897Met为新的突变位点。结论 6例低钾型周期性麻痹患者临床表现典型,存在CACNA1S或SCN4A基因的胚系突变,CACNA1S Arg897Met为新的突变位点。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠的实验研究

目的：应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法：根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果：成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10bp和11bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论：利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

基于CRISPR/Cas9技术构建严重联合免疫缺陷小鼠

目的 应用CRISPR/Cas9技术靶向敲除编码小鼠T、B细胞的Rag2基因及编码NK细胞的IL2rg基因,构建T、B细胞及NK细胞联合免疫缺陷小鼠。方法 根据Genbank报道的Rag2及IL2rg基因序列,分别针对其外显子设计25 bp左右的sgRNA并进行合成, sgRNA退火后克隆入pX330载体。Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA及Cas9重组质粒体外转录为mRNA后显微注射入BALB/c小鼠受精卵细胞,受精卵细胞移植到受体动物获得子代小鼠,首建鼠（F0）与野生型小鼠交配获得F1代小鼠,突变的F1代小鼠互交后筛选F2代纯合子小鼠。通过基因测序、流式细胞技术及接种人源性肿瘤细胞系方法检测子代小鼠基因型和表型。结果 成功构建了Rag2-sgRNA、IL2rg-sgRNA重组质粒并对其进行了体外转录,mRNA显微注射并移植后获得57只F0小鼠。连续交配后,获得F2代纯合子小鼠。序列分析表明子代小鼠中IL2rg有两个基因型,分别是10 bp和11 bp的缺失突变;而Rag2只有一个基因型,为8 bp的缺失突变。与野生型BALB/c小鼠相比,小鼠外周血中CD3、B220及NKp46阳性细胞数量明显降低。接种人乳腺癌细胞系SKBR-2HL后,肿瘤生长良好,且随着时间延长肿瘤组织逐渐增大。结论 利用CRISPR/Cas9技术可有效实现BABL/c小鼠体内Rag2、IL2rg基因突变,并导致小鼠T、B及NK细胞功能异常。     

应用CRISPR/Cas9技术构建IL-15敲除的MGC-803胃癌细胞株

目的:运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立IL-15基因敲除的MGC-803胃癌细胞株?方法:针对IL-15基因作用的功能域,设计了靶向IL-15基因Exon2的gRNA? 构建PX458-gRNA重组质粒并转化感受态细胞Stbl3,筛选出重组子后进行测序,通过测序确认了所设计的gRNA的有效性?并进一步通过流式细胞分选以及ELISA法检测筛选出的MGC-803胃癌细胞株IL-15基因的表达水平?结果:测序结果显示敲除质粒构建成功,与阴性对照组相比,转染PX458-IL-15-gRNA质粒组IL-15的表达水平明显低于阴性对照组,差异具有统计学意义(P < 0.001)?结论:利用CRISPR-Cas9系统成功构建了IL-15基因敲除的MGC-803 细胞,为后续研究IL-15在肿瘤中的作用机制和功能奠定了基础?     

利用CRISPR/Cas9 系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。方法:设计针对敲除CBX2的short guide RNA（sgRNA）,并克隆到载体PX459中。将测序正确的重组质粒转染到A549细胞中,利用嘌呤霉素筛选转染阳性细胞并分离得到5个单克隆细胞系,通过Western blot方法检测构建的细胞系中CBX2蛋白表达情况。结果:成功构建了靶向CBX2的CRISPR/Cas9重组质粒,筛选出的5个单克隆细胞系中CBX2蛋白表达水平均显著下降。结论:成功利用CRISPR/Cas9 系统构建了稳定敲除CBX2基因的A549细胞系。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7细胞株

目的 利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除4.1R基因的RAW264.7巨噬细胞株,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能奠定基础.方法 根据CRISPR/Cas9靶向原理设计并合成3个特异性识别4.1R基因的向导RNA(sgRNA),构建sgRNA-lentiCRISPRv2重组质粒并转入293T细胞中制备sgRNA-Cas9慢病毒,慢病毒侵染RAW264.7细胞,嘌呤霉素筛选出阳性细胞并稀释至单克隆,Western blotting印记检测单克隆细胞中蛋白4.1R的表达,测序确认单克隆细胞中突变位点.结果 Western blotting印迹检测结果表明筛选出的1株单克隆细胞中蛋白4.1R的表达完全缺失;测序结果表明该细胞株中4.1R基因发生了19bp的缺失突变;并且4.1R基因敲除后,RAW264.7细胞的增殖能力显著增加.结论 本研究利用CRISPR/Cas9系统成功的干扰了巨噬细胞系RAW264.7细胞中4.1R的表达,为研究4.1R在巨噬细胞中的功能提供了有效工具.