新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型的建立

目的:探索新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养的方法?方法:取新生小鼠颅盖骨,采用胶原酶消化获得间充质干细胞,观察细胞的形态及增殖情况,通过细胞周期分析细胞增殖能力,通过流式测定细胞表面标志来分析细胞纯度,对细胞进行成骨成脂诱导分化,并分别予茜素红及油红O染色定性,荧光定量PCR检测成骨标志基因Osteocalcin及成脂标志基因PPARγ?Fabp4表达情况?结果:培养出的纺锤形细胞均一性好?增殖能力强?流式测定细胞表面标志显示细胞纯度好,高表达CD29?CD44,几乎不表达CD34?CD45?诱导分化后分化率高,茜素红染色及油红O染色分别可见较多矿化结节及脂滴,荧光定量PCR显示随分化相关标志基因均明显增高?结论:本研究成功建立了新生小鼠颅盖骨间充质干细胞原代培养模型,为进一步研究间充质干细胞奠定基础?     

小鼠、大鼠、食蟹猴与人的脂肪干细胞分离培养方法和生物学特性的比较分析

目的比较分析实验动物脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)与人脂肪间充质干细胞的分离培养方法和生物学特性的差异,为自体脂肪干细胞移植治疗人类疾病的临床前研究提供临床前的实验数据和方法。方法将临床患者、食蟹猴、C57小鼠和SD大鼠的皮下脂肪组织进行分离培养后得到人脂肪间充质干细胞(h ADSCs)、食蟹猴脂肪间充质干细胞(cynomolgus monkey adipose-derived mesenchymal stem cells,c ADSCs)、小鼠脂肪间充质干细胞(mouse adipose-derived mesenchymal stem cells,m ADSCs)和大鼠脂肪间充质干细胞(rat adipose-derived mesenchymal stem cells,r ADSCs);采用流式细胞术鉴定ADSCs表面标记物;细胞成脂、成骨诱导分化,于诱导后21 d和28 d固定染色,鉴定ADSCs的成脂成骨分化能力。结果 h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs的分离培养方法类似,贴壁培养后均呈成纤维细胞样生长;流式检测显示,不同物种ADSCs间充质干细胞表面标记物CD90、CD29为阳性,少量表达造血干细胞标记物CD34,血管内皮细胞标记物CD31为阴性。成脂和成骨分化能力检测显示,h ADSCs、c ADSCs、m ADSCs和r ADSCs和均具有成脂成骨分化能力,但其成脂成骨分化的时间略有差异。结论实验动物ADSCs与h ADSCs采用相同的分离培养方法,有类似的表面标记物表达及成脂成骨分化潜能,生物学特性具有一致性,是自体脂肪干细胞移植临床前研究的良好模型。     

人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性

目的：观察及研究人嗅黏膜间充质干细胞的生物学特性。方法：分离、培养、鉴定人嗅黏膜间充质干细 胞,在透射电子显微镜、扫描电子显微镜下观察其超微结构,并在体外诱导其向脂细胞、骨细胞、神经干细胞球和神 经元分化。结果：人嗅黏膜间充质干细胞生长以梭形细胞为主,呈放射状排列,高表达表面标志CD73和CD90,不表 达CD34和CD45;在扫描电子显微镜下可见细胞表面有短而粗的微绒毛突起,在透射电子显微镜下可见到两种不同的 细胞形态;具有成脂、成骨、成神经元干细胞球和神经元分化的能力。结论：人嗅黏膜间充质干细胞具有间充质干细 胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能,可作为组织工程修复的理想的种子细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化

目的建立兔骨髓间充质干细胞的体外分离、培养、鉴定方法。方法通过全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化兔骨髓间充质干细胞,进行形态学观察,绘制生长曲线,检测细胞表面标志物,加入诱导剂诱导细胞向成骨、成脂方向分化,油红O染色,检测细胞内碱性磷酸酶(ALT)、甘油三酯(TG)含量。结果兔骨髓间充质干细胞符合正常细胞生长特性,形状以梭形、纺锤形为主,后期多数细胞呈长梭形;细胞生长较旺盛,可连续传7~10代,以第3代细胞状态最佳;第3代骨髓间充质干细胞CD29表达呈阳性,CD34表达呈阴性;成骨、成脂诱导后,油红O染色出现明显脂滴,ALT、TG含量明显增高。结论全骨髓贴壁法可成功分离和培养出兔骨髓间充质干细胞,具有间充质干细胞的一般生物学特性,且生长状态良好,增殖力强,经诱导后具有向成骨和成脂分化的潜能,该方法获得的骨髓间充质干细胞可能成为组织工程的优良种子细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养和鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离培养方法及其生物学特性。方法采用全骨髓贴壁培养法获得大鼠骨髓间充质干细胞,取第3代骨髓间充质干细胞,通过成骨、成脂肪诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记（CD29、CD34、CD45、CD90）等鉴定BMSCs特征。结果全骨髓贴壁培养法获得的BMSCs,原代和传代培养具有活跃的增殖能力;BMSCs经诱导后可分别向成骨、成脂转化;流式分析表面标志分子高表达CD90（96.5%）、CD29（92.3%）,低表达CD34（0.89%）、CD45（1.41%）。结论全骨髓贴壁培养法可有效地分离和扩增BMSCs,分离培养的BMSCs具有潜在的多向分化能力。     

人脐带间充质干细胞生物学特性及向成骨细胞分化的研究

目的:体外分离、纯化及培养人脐带间充质干细胞(WJ～MSCs),观察其生物学特性并研究其定向分化成成骨细胞的能力。方法:将剔除动静脉的新鲜人脐带组织切成小段,剥离血管后酶解,释放细胞贴壁生长,倒置显微镜观察细胞形态,绘制第3代生长曲线;流式细胞仪测定细胞表面标记(CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14和HLA～DR);化学染色检测其体外诱导成骨分化的能力。结果:原代人脐带间充质干细胞呈现典型的成纤维样形态;流式细胞仪检测培养细胞间充质干细胞的表面标志CD105、CD73和CD90阳性表达,但不表达造血细胞的表面标志CD34、CD45、CD14及HLA-DR阴性表达,HLA-ABC低表达。体外诱导实验证实,该细胞具有成骨分化能力。结论:WJ-MSCs体外诱导成骨能力确切,具有类似骨髓间充质干细胞的特异性表面标记,且具有同种异体移植的低免疫原性。     

小鼠脂肪干细胞分离培养方法

目的：建立一种简单高效的小鼠脂肪干细胞分离培养方法,为小鼠模型中间充质干细胞研究提供充足的细胞来源。方法体外分离小鼠腹股沟皮下脂肪组织,应用0．1％胶原酶NB4消化,含10％ FBS的低糖DMEM培养基贴壁培养小鼠脂肪干细胞,并对其细胞形态、体外增殖能力、多向分化潜能及表面标记进行分析研究。结果体外分离培养的小鼠脂肪干细胞具有良好的细胞形态、极强的增殖能力,体外经三向诱导,具有成脂、骨及软骨分化潜能,表面标记CD34、CD105阳性,Sca-1高表达,不表达CD45及 SSEA-1。结论利用该实验方法,能培养出高纯度、具有良好干性及极强增殖能力的小鼠脂肪干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养及成骨成脂诱导

目的建立大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）体外分离、纯化、扩增的方法及诱导BMSCs成骨成脂分化,提供理想的组织工程种子细胞。方法采用贴壁筛选法分离BMSCs,通过不断传代进行纯化和扩增培养,并绘制细胞生长曲线。诱导后检测油红O染色和矿化结节。结果 BMSCs在体外分离培养扩增,细胞形态为长梭形,流式检测分析P3和P5细胞表面标记物CD44、CD90为阳性,CD45为阴性。细胞生长曲线呈S形。经成脂诱导培养,脂肪的特异性油红O染色为阳性;经成骨诱导培养,形成了矿化结节。结论本实验分离培养的细胞具有BMSCs的表面标记特征和诱导分化为脂肪细胞和成骨细胞的潜能,为BMSCs在组织工程中的应用提供基础理论和实验依据。     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离与培养方法优化

目的：建立一个分离、培养、纯化大鼠的骨髓间充质干细胞的方法。方法使用贴壁法分离大鼠的骨髓间充质干细胞,通过培养初期的频繁换液和传代过程中减少胰蛋白酶的暴露时间,达到骨髓间充质干细胞的纯化。流式细胞仪检测细胞表面标志物,MTT法检测细胞生长状况,暴露于不同的诱导培养基使细胞成骨、成脂,并向肝胆系分化。结果分离所得的细胞阳性表达CD29、CD44、CD90,而对于造血细胞标志物CD45呈阴性。在成骨、成脂培养基的诱导下,细胞ALP、茜素红、油红O染色均呈阳性,并发现传至10代的细胞仍保持分化功能。将骨髓间充质干细胞贯续暴露于不同的细胞因子和激素,得到了表达肝细胞、胆管上皮细胞特异标志的子代细胞。结论通过改良后的方法可以高效、简洁地分离出形态均一的大鼠骨髓间充质干细胞,并能够向多胚层的细胞分化。     

人骨髓基质干细胞体外培养和生物学特性鉴定

目的 体外分离、纯化培养人骨髓基质干细胞(hBMSCs),对其表面标志物、多向分化特性进行鉴定,为骨组织工程提供理想的种子细胞来源.方法 抽取健康成人骨髓,采用全骨髓培养法,多次消化以纯化hBMSCs;应用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测;采用成骨、成软骨和成脂培养基进行三向诱导分化.结果 培养的第3代细胞表面抗原检测显示:表达CD106、CD166和CD29,不表达造血和内皮标志CD34、CD45和CD145在体外分别诱导出其向成骨、成软骨和成脂肪细胞分化.结论 hMSCs体外经分离传代培养后细胞成分较为单一,具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的基本功能特征.     

人脂肪间充质干细胞的原代培养及体外成骨成脂诱导分化

目的: 建立体外分离培养获得人脂肪间充质干细胞（human adipose derived mesenchymal stem cells,hADSCs）的方法,并观察其形态、免疫表型、生物学特性。初步探讨其体外成骨过程中出现成脂现象的原因及机制。方法 ： 剖宫产手术获得腹部皮下脂肪,0.15%Ⅰ型胶原酶消化法获得人脂肪间充质干细胞并进行体外培养。行MTT细胞增殖实验绘制增殖曲线,使用流式细胞及细胞免疫荧光技术检测细胞表面抗原,行成骨成脂分化鉴定其分化潜能。通过RT PCR技术检测成骨成脂过程中过氧化物酶体增殖物激活受体γ 2（peroxisome proliferator activated receptorγ 2,PPARγ 2）和骨桥蛋白mRNA表达情况。结果 ： 通过分离培养,获得了大量旋涡状生长的人脂肪间充质干细胞。MTT法显示细胞增殖能力强。流式细胞鉴定结果显示,CD29、CD73、CD105、CD166高表达,CD31、CD34、CD45、HLA DR低表达。细胞免疫荧光结果与之相符。hADSCs在特定诱导条件下,具有成骨成脂分化潜能。在成骨分化过程中同时伴有成脂发生。RT PCR结果显示,与对照组相比,成脂诱导组PPARγ 2 mRNA有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。与对照组相比,成骨诱导组骨桥蛋白,PPARγ 2 mRNA均有时间依赖性递增表达,差异具有统计学意义（P<0.01）。结论： 建立了一种分离培养hADSCs简单可靠的方法。获得的细胞具有贴壁生长、增殖活性强、干细胞表型以及多向分化等特征。hADSCs体外成骨过程中,三酰甘油的形成对成骨具有一定的促进作用。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养条件的优化及生物学特性

目的建立一种新的高效体外骨髓间充质干细胞纯化培养方法,并对所获得细胞进行生物学行为研究。方法采用全骨髓培养获得原代骨髓间充质干细胞,经体外成脂、成骨诱导分化并检测细胞表面分子表达对所获得干细胞进行鉴定,传代后低密度接种(3×103/cm2)结合机械擦除对所培养细胞进行纯化,并对未纯化及纯化细胞分别进行集落形成单位实验、生长曲线及细胞周期分析来研究其生物学特性。结果全骨髓贴壁法可以成功培养出骨髓间充质干细胞,细胞呈现干细胞特性生长;可在体外成功地进行成脂、成骨分化;阴性表面标记分子CD34、CD45表达率均小于2%,阳性表面标记CD73、CD90表达率均高于95%。经纯化后的细胞具有更优的生物学行为,表现在:克隆形成率达到(28.80±5.00)%(P<0.01);培养12d后细胞数量增加(26.18±4.80)倍(P<0.05);处于S+G2/M期的细胞比例达到(45.98±1.60)%(P<0.01)。结论低密度接种结合机械擦除方法可以获得高纯度骨髓间充质干细胞,且该细胞具有更佳的生物学特性。     

脐血间充质干细胞表达的IDO对异基因淋巴细胞的增殖及再生障碍性贫血小鼠造血恢复的影响

目的 探讨脐带血间充质干细胞(UCB-MSCs)发挥免疫调节作用机制及对再生障碍性贫血小鼠的治疗效应.方法 采集足月胎儿脐带血,采用羟乙基淀粉沉降+淋巴细胞分离两步法分离培养UCB-MSCs.观察细胞形态,流式细胞术检测细胞表面标志物,成骨、成脂诱导鉴定分化潜能.研究UCB-MSCs表达吲哚胺2,3-过氧化酶(IDO)的情况.建立UCB-MSCs与异基因淋巴细胞共培养体系,探讨其发挥免疫调节作用的机制;同时构建免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型,观察其对再障造血恢复的影响.结果 UCB-MSCs为成纤维样细胞,贴壁生长.流式细胞仪检测结果 表明,其不表达造血标志CD34,高表达CD44、CD73,体外成功诱导成骨与成脂分化.经γ干扰素(IFN-γ)诱导表达IDO活性,对异基因淋巴细胞的增殖可能发挥免疫抑制作用.MSCs输注再生障碍性贫血小鼠模型,可减轻小鼠骨髓造血衰竭程度.结论 UCB-MSCs在体外成功分离培养,并具有间充质干细胞生物学特性;MSCs可能通过IDO途径发挥免疫负调控作用.UCB-MSCs的IDO表达对于免疫介导再障小鼠模型的骨髓造血恢复具有改善作用.     

小鼠脐带间充质干细胞的体外诱导分化

目的分离扩增小鼠脐带间充质干细胞（mouse umbilical cord mesenchymal stem cells,mUCMSCs）探讨其是否可诱导成软骨、脂肪和成骨细胞。方法 通过贴壁培养法将mUCMSCs体外分离、扩增、纯化,倒置显微镜下观察细胞的形态特征,运用流式细胞仪检测分析细胞的抗原标志表达进行鉴定。运用诱导培养液对分离的mUCMSCs分别定向诱导培养为软骨、脂肪和成骨细胞。结果 运用组织贴块培养法可从新鲜脐带中分离到贴壁生长的成纤维样细胞,这些细胞高表达CD29、CD90和CD105,低表达CD34。成软骨诱导后阿新兰染色呈蓝色;成脂诱导后油红O染色,出现红色脂滴;茜红素染色成骨诱导的mUCMSC,可见红色结节。结论 贴壁培养法分离培养所获得的mUCMSCs在体外可诱导分化为软骨、脂肪和成骨细胞。     

小鼠脂肪源干细胞的生物学特性及增殖特点

目的探讨脂肪源干细胞的生物学特性及其增殖特点。方法无菌条件下获取C57BL/6小鼠腹股沟脂肪组织,Ⅰ型胶原酶消化并收集脂肪源干细胞(ADSCs),细胞传代至第3代(P3)后加成骨诱导液及成脂诱导液,对脂肪源干细胞进行定向成骨及成脂诱导,并分别行茜素红及油红O染色;流式细胞仪检测脂肪源干细胞表面免疫表型;测定脂肪源干细胞的细胞周期及其生长方式;CCK-8法测脂肪源干细胞增殖情况。结果小鼠脂肪来源的细胞在体外呈梭形生长,且能稳定传代;细胞在加入成骨及成脂诱导液后可定向分化成成骨细胞、成脂细胞;流式指标检测示:CD29高表达(91.4±0.95)%,CD34低表达(38.7±0.4)%;细胞增殖结果显示:细胞增殖旺盛,具有典型的对数期、平台期。结论小鼠脂肪组织来源的细胞是间充质干细胞;脂肪源间充质干细胞是具有多向分化潜能的理想种子细胞。     

大鼠脂肪间充质干细胞体外培养及其分化研究

目的:建立大鼠脂肪间充质干细胞体外分离培养体系并研究其多向分化潜能。方法:取6周龄大鼠双侧腹股沟和附睾处脂肪,酶解法分离培养原代脂肪间充质干细胞,绘制第三代细胞生长曲线。成脂诱导4 d,成骨诱导培养18 d,分别通过油红O染色、碱性磷酸酶活性检测和钙盐沉积VonKossa染色来观察细胞成脂、成骨表型转化。结果:大鼠脂肪中能分离培养出一定量的脂肪间充质干细胞,其群体倍增时间为(60±3.2)h。在成脂诱导培养液作用下可分化为脂肪细胞;成骨诱导培养液作用下,可特异性表达成骨分化标志碱性磷酸酶,同时也具有矿化细胞外基质的能力。结论:脂肪间充质干细胞具有易于取材、大量分离培养和定向诱导成骨分化的特点,是骨组织工程理想的种子细胞的来源。     

人嗅黏膜间充质干细胞的体外培养、鉴定及诱导分化的研究

目的 :建立人嗅黏膜间充质干细胞的获取、分离、培养方法。方法 :通过人嗅黏膜组织贴壁法体外分离、培养嗅黏膜间充质干细胞,观察细胞形态学,绘制其生长曲线,观察其细胞周期分析,进行流式细胞仪检测来观察其细胞表面标记物。结果 :培养的人嗅黏膜间充质干细胞形态上以梭形为主,细胞排列呈放射状,细胞增殖迅速。生长曲线及细胞周期结果提示人嗅黏膜间充质干细胞符合细胞正常生长特征且细胞增殖较活跃。第5代人嗅黏膜间充质干细胞表达间充质干细胞阳性标记物CD73,CD90,不表达造血干细胞标记物CD34,CD45。细胞进行成脂肪组织、成骨组织诱导后,细胞油红O染色可见红色脂滴,茜素红染色后可见钙盐沉积。结论 :人嗅黏膜组织块贴壁培养法是一种有效的具有简便操作性的方法,通过此方法培养出的细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,细胞经诱导后具有多向的分化潜能,为其今后的临床应用提供了充足的种子细胞来源具有重大意义。     

人脐带华通氏胶间充质干细胞的分离、培养、鉴定及冻存、复苏

目的：探讨从人脐带华通氏胶（Wharton’s jelly,WJ）中分离、培养、鉴定间充质干细胞（mesenchymal stemcells,MSCs）及其冻存、复苏的方法。方法：采用植块法分离、培养间充质干细胞,流式细胞仪检测P3代细胞免疫表型,鉴定其向成骨、成脂方向诱导分化的能力;将P1细胞冻存6个月后复苏,鉴定复苏后细胞的特性。结果：植块法容易从人脐带华通氏胶中获得间充质干细胞;组织块贴壁后6 d可见组织块周围细胞爬出,原代培养14~18 d细胞融合70%~80%;P3代细胞强烈表达CD73、CD90、CD105,不表达CD14、CD34、CD45、CD79a和HLA-DR;成骨诱导分化后10 d,可见明显钙结节;成脂诱导14 d,有明显的脂滴出现,油红O染色阳性。冻存再复苏细胞活力达80%,细胞免疫表型及成骨、成脂诱导显示与冻存前细胞呈相同的特性。结论：组织块培养法可从人脐带华通氏胶中分离、培养出纯度较高间充质干细胞,冻存、复苏不改变其特性。     

肾血管平滑肌脂肪瘤中间充质干细胞的分离培养及鉴定

目的明确经典型肾血管平滑肌脂肪瘤组织中是否存在间充质干细胞。方法收集8例肾血管平滑肌脂肪瘤手术切除的标本,剪碎后PBS洗涤,以胶原酶水解,贴壁培养后传代,流式细胞术检测细胞表型,并行体外成骨、成脂肪分化检测。结果从8例肾血管平滑肌脂肪瘤组织中均分离出具有间充质干细胞形态特征的贴壁细胞,该细胞不表达CD14、CD31、CD34、CD45、CD144等造血细胞或内皮细胞表面标志,而表达间充质干细胞表面标志如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等。在体外诱导后具有向骨、脂肪组织分化的能力。结论肾血管平滑肌脂肪瘤组织中存在具有间充质干细胞形态、表型和功能特征的一群细胞,间充质干细胞可能与肾血管平滑肌脂肪瘤的发生具有密切关系。     

人脐血间充质干细胞体分离、培养及向脂肪细胞分化的实验研究

目的:探讨脐血间充质干细胞(UCB-MSCs)的分离培养及向脂肪细胞的分化潜能。方法:从足月儿脐血中获得间充质干细胞,体外培养传代,流式细胞检测细胞表面及抗原细胞周期;予10-6M地塞米松、100μg/ml1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤(IBMX)、50μg/ml抗坏血酸的IMDM培养基,对MSCs进行诱导向脂肪细胞分化,油红-O染色染色鉴定。结果:成功建立了脐血间充质干细胞分离及培养扩增的方法;流式细胞仪检测结果显示,贴壁细胞均表达CD105、CD29和CD44,不表达造血细胞表型CD34、CD45和内皮细胞表型CD31;经脂肪培养液诱导后在细胞胞浆里可见颗粒状红色脂滴形成。结论:脐血间充质干细胞能进行体外分离培养,并能诱导分化为脂肪细胞。