姜黄素诱导人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬的实验研究

目的：观察姜黄素（Curcumin）诱导人髓母细胞瘤Daoy细胞自噬的作用,并探讨其可能的作用机制。方法：体外培养人髓母细胞瘤Daoy细胞,不同浓度姜黄素作用24、48、72 h,MTT 法检测细胞增殖;荧光染色、RT-PCR和Western blot检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3的表达;RT-PCR和Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路中PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达。PI3K激动剂insulin处理细胞后,Western blot检测PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达变化。结果：姜黄素明显抑制Daoy细胞的生长,呈时间-剂量依赖性。免疫荧光显示Beclin1和LC3在姜黄素处理组中的表达明显增强。姜黄素作用不同时间,Daoy细胞中Beclin1和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的mRNA和蛋白水平均增高（mRNA：F=1 360.962、42.366,P=0.000、0.000;蛋白：F=32.723、11.847,P=0.001、0.008）,而PI3K、p-Akt和p-mTOR的表达受到明显抑制（F=329.662、80.638、183.536,P=0.000、0.000、0.000）。PI3K激动剂insulin不能有效阻断姜黄素引起的PI3K、p-Akt和p-mTOR的降低。结论：姜黄素诱导自噬抑制髓母细胞瘤Daoy细胞生长,其机制可能与上调自噬相关基因表达,抑制自噬负调控PI3k/Akt/mTOR信号通路有关。     

1，25（OH）2D3对人系膜细胞增殖及PI3K/Akt信号通路的影响

目的 观察1,25-二羟维生素D3〔1,25（OH）2D3〕对人系膜细胞（HMC）增殖及Akt、mTOR表达的影响,探讨PI3K/Akt信号通路在1,25（OH）2D3对HMC增殖调控中的作用。方法 体外培养HMC,取传代培养至第3～7代细胞分为4组：正常对照组（N组）、1,25（OH）2D3组（10-8 mol/L,VD组）、PI3K抑制剂干预组（LY294002 2 μg/ml,LY组）,LY294002（2 μg/ml）联合1,25（OH）2D3组（10-8 mol/L）组（LY+VD组）,干预48 h,倒置相差显微镜观察各组细胞生长,CCK-8法检测各组细胞增殖,流式细胞术检测各组细胞周期时相分布,Western blotting检测各组Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表达的情况。结果 各实验组吸光度值（A值）比较,差异有统计学意义（F=281.641,P＜0.01）,其中VD组、LY组和LY+VD组A值均低于N组,LY+VD组A值均分别低于VD组和LY组,差异均有统计学意义（P＜0.01）。各实验组G2/M期比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。各实验组G1期、S期和PI比较,差异均有统计学意义（P＜0.05）;其中VD组、LY组和LY+VD组G1期均高于N组,S期和PI均低于N组,LY+VD组G1期均高于VD组,S期和PI均低于VD组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。各实验组Akt/β-actin、mTOR/β-actin灰度值比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。各实验组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR灰度值比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;其中VD组、LY组和LY+VD组p-Akt/Akt、p-nmTOR/mTOR灰度值均低于N组,LY+VD组p-Akt/Akt、p-nmTOR/mTOR灰度值均低于VD组和LY组,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 1,25-（OH）2D3可通过PI3K/Akt信号通路抑制体外培养HMC的增殖。     

小分子RNA干扰磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α基因对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨小分子RNA干扰磷脂酰肌醇3-激酶催化亚基α(PIK3CA)基因对人骨肉瘤Saos-2细胞增殖和侵袭能力的影响。方法培养人骨肉瘤Saos-2细胞,将细胞随机分为siRNA-PIK3CA组、siRNA对照组和空白对照组,siRNA-PIK3CA组细胞转染siRNA-PIK3CA序列,siRNA对照组细胞转染siRNA对照序列,空白对照组细胞正常培养,不作任何干预。实时荧光定量聚合酶链反应检测各组细胞中PIK3CA mRNA表达,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡情况,Transwell法检测各组细胞迁移和侵袭能力,Western blot法检测各组细胞中PIK3CA、磷酸肌醇3激酶(PI3K)、磷酸化-PI3K (p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化-Akt(p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)和磷酸化-m TOR(p-mTOR)蛋白表达。结果 siRNA-PIK3CA组细胞中PIK3CA mRNA和蛋白相对表达量均低于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05); siRNA-PIK3CA组细胞转染后24、48、72、96 h增殖能力均低于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05); siRNA-PIK3CA组细胞凋亡率高于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05); siRNA-PIK3CA组迁移细胞数和侵袭细胞数均少于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05); siRNAPIK3CA组细胞中PI3K、Akt、m TOR蛋白相对表达量均高于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05),而p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量均低于siRNA对照组和空白对照组(P <0. 05)。siRNA对照组与空白对照组细胞中PIK3CA mRNA和蛋白相对表达量、细胞增殖能力、迁移细胞数和侵袭细胞数及PI3K、Akt、m TORp-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P> 0. 05)。结论下调PIK3CA基因可减少人骨肉瘤细胞增殖,抑制细胞迁移及侵袭能力,增加细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路有关。     

过表达TLR4基因对胃癌细胞自噬的抑制作用及其机制

目的 采用慢病毒过表达胃癌细胞中Toll样受体4（TLR4）基因,探讨其对胃癌细胞自噬的作用,并阐明其作用机制。 方法 处于对数生长期的胃癌BGC-823细胞和SGC-7901细胞分为未感染组、阴性对照病毒组和基因过表达组,分别给予无慢病毒感染、空载体慢病毒和过表达TLR4慢病毒稳定感染。采用Western blotting法检测正常胃黏膜上皮GES-1细胞及胃癌BGC-823细胞、SGC-7901细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖活性,实时荧光定量PCR（RT-qPCR）法分别检测各组细胞中TLR4、Beclin1和微管相关蛋白轻链3（LC3）mRNA表达水平,Western blotting法检测各组细胞中磷脂酰肌醇-3激酶／蛋白激酶B（PI3K／Akt）、磷酸化PI3K／磷酸化Akt（p-PI3K／p-Akt）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和磷酸化mTOR（p-mTOR）信号通路相关蛋白及细胞自噬相关蛋白（LC3、Beclin1和p62）蛋白表达水平。 结果 BGC-823细胞、HGC-27细胞和MGC-803细胞中TLR4蛋白表达水平高于胃黏膜上皮GES-1细胞。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞增殖活性明显升高（P<0.05或P<0.01）。与阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中TLR4 mRNA表达水平明显升高（P<0.01）,BGC-823细胞中Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）,SGC-7901细胞中LC3和Beclin1 mRNA表达水平降低（P<0.05）。与未感染组和阴性对照病毒组比较,过表达TLR4组BGC-823细胞和SGC-7901细胞中LC3和Beclin1蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,p62、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。 结论 过表达TLR4基因可以通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路明显抑制胃癌细胞的自噬活性。     

阿伐他汀通过PI3K/Akt/mTOR途径调节白血病细胞自噬的作用及机制

目的:研究阿伐他汀对白血病细胞K562自噬的影响及相关信号机制。方法:取对数生长期的K562细胞,分为阴性对照组、阿伐他汀组、阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组、阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组。共培养24h后,采用吖啶橙染色观察细胞自噬体的变化,Western Blot检测Ⅱ型自噬标志蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3-Ⅱ)和自噬血管基因Beclin-1的表达,RT-PCR和Western Blot检测磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化mTOR(p-mTOR)的表达。结果:与阴性对照组相比,阿伐他汀抑制白血病细胞K562自噬体的形成(P<0.05),下调LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组LC3-Ⅱ和Beclin-1的表达增加(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达增加(P<0.05)。与阿伐他汀组相比,阿伐他汀+PI3K抑制剂(LY294002)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05);阿伐他汀+mTOR抑制剂(雷帕霉素)组p-Akt和p-mTOR基因的mRNA和蛋白表达水平均下降(P<0.05)。结论:阿伐他汀可以抑制白血病细胞K562自噬,推测其机制可能与激活PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。     

mTORC1/2抑制剂与伊马替尼联用抑制Ph +ALL细胞株生长的作用机制

【摘要】 目的 探讨哺乳动物雷帕霉素靶蛋白C1/2（mTORC1/2）抑制剂PP242与伊马替尼（IM）联用对费城染色体阳性（Ph+）急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞株SUP-B15的抗白血病作用及机理。方法 以SUP-B15细胞为研究模型,MTT法检测IM与PP242联合处理SUP-B15细胞72 h后的半数抑制浓度（IC ₅₀ ）及联合作用指数（CI ）;Western blot法检测PP242处理SUP-B15细胞后对磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/mTOR通路的影响,以及IM与PP242联合处理SUP-B15细胞后对PI3K/Akt/mTOR通路及凋亡相关蛋白的影响。结果 IM单用于SUP-B15细胞的IC ₅₀ 值为（1.50±0.09） μmol/L。而IM与20、30、50 nmol/L PP242联用于SUP-B15细胞,其IC ₅₀ 分别下降为（0.81±0.030） μmol/L、（0.36±0.140） μmol/L、（0.02±0.002） μmol/L, CI 值分别为0.764、0.545、0.507,提示两药有较高的协同作用。PP242单独作用于SUP-B15细胞后,磷酸化Akt（p-Akt）、p-4EBP1、p-elF4E、p-ABL、p-mTOR、p-P70等 PI3K/Akt/mTOR通路上的关键磷酸化蛋白表达下调,且这种变化呈现浓度和时间依赖性。PP242与IM联合用于SUP-B15细胞时,SUP-B15细胞PI3K/Akt/mTOR通路的各关键蛋白下调较PP242或IM单用时更明显,凋亡相关蛋白Bax、cleaved Caspase-3上调也较两药单用时更明显。结论 PP242与IM联合使用时可增强对于PI3K/Akt/mTOR通路的抑制,增加由Bax、Caspase-3所介导的凋亡作用。     

槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞自噬及磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路的影响

目的 观察槲皮素对人前列腺癌PC-3细胞活力、凋亡、自噬及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的影响。方法 体外培养PC-3细胞,采用CCK-8法检测PC-3细胞活力,TUNEL染色检测PC-3细胞凋亡,吖啶橙染色观察PC-3细胞自噬小泡,GFP-LC3质粒转染分析观察PC-3细胞自噬小体,Western blot分析检测自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3融合蛋白(LC3)、Beclin-1和PI3K/Akt/mTOR 信号通路蛋白的表达。结果 槲皮素以浓度-时间依赖性的方式抑制PC-3细胞活力,并诱导细胞凋亡;能够增加PC-3细胞自噬小泡和自噬小体的数量;能够升高PC-3细胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1表达,同时降低磷酸化-PI3K、磷酸化-Akt和磷酸化-mTOR的表达。结论 槲皮素可能是通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导PC-3细胞发生自噬。     

胃肠间质瘤危险性分级与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白和磷酸化哺乳 动物雷帕霉素靶蛋白表达的关系

目的研究胃肠间质瘤危险性分级与磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号传导通路中mTOR和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)表达的关系。方法用免疫组织化学法检测40例胃肠间质瘤中PI3K/Akt/mTOR信号传导通路相关蛋白mTOR和p-mTOR的阳性表达率,分析其在不同危险程度组之间的差异。结果 mTOR、p-mTOR蛋白在部分胃肠间质瘤呈阳性表达,定位于细胞质。mTOR、p-mTOR在极低和低度危险组的阳性表达率均低于中高度危险组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论胃肠间质瘤PI3K/Akt/mTOR信号传导通路中mTOR和p-mTOR与其侵袭危险性有关,提示该信号传导通路在介导胃肠间质瘤发生、发展过程中起重要作用。     

PI-103对人卵巢癌细胞株SKOV3／DDP顺铂化疗效果的影响

目的：探讨磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）双抑制剂PI-103对卵巢癌耐顺铂株SKOV3/DDP顺铂化疗效果的影响。方法：将PI-103、顺铂及两者联合分别作用于SKOV3/DDP细胞,采用CCK-8法检测细胞生长情况,流式细胞技术检测药物单独或联合作用对细胞凋亡的影响;应用Western blot检测蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、核糖体蛋白（rpS6）、磷酸化rpS6（p-rpS6）以及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax蛋白表达变化。结果：PI-103能够抑制SKOV3/DDP细胞增殖,且呈浓度、时间依赖性;联合用药可以明显增加对细胞生长抑制和凋亡作用。 PI-103能下调Akt和rpS6的磷酸化水平,促DDP上调Bax和下调Bcl-2的表达。结论：PI-103抑制PI3 K/Akt/mTOR信号传导通路,促DDP上调促凋亡蛋白及下调抗凋亡蛋白的表达,从而抑制癌细胞生长,诱导其凋亡,增加卵巢癌耐顺铂株SKOV3/DDP细胞对DDP的化疗效果。     

miR-1通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬的影响

目的 探讨miR-1对高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的影响。方法H9c2细胞随机分为4组。正常组使用普通培养基培养,未转染;诱导组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,未转染;miR-1 NC组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 NC;miR-1 inhibitor组使用含33 mmol/L葡萄糖的培养基诱导,转染miR-1 inhibitor。在加入葡萄糖诱导前48 h,使用Lipofectamine 3000转染试剂盒进行转染。实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测H9c2细胞和高糖诱导的H9c2细胞中miR-1表达水平;CCK-8法检测各组H9c2细胞增殖活性;蛋白免疫印记法（Western blot）检测各组H9c2细胞中Beclin1、p65、PI3K蛋白表达水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及AKT、mTOR蛋白磷酸化水平;生物信息学预测和双萤光素酶验证miR-1和PI3K的靶向关系。结果与正常组相比,诱导组的H9c2细胞中,miR-1表达水平显著升高（P<0.05）,PI3K蛋白表达水平显著降低（P<0.05）。与正常组相比,诱导组H9c2细胞Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著升高,自噬小体增多,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著降低（P<0.05）;与诱导组和miR-1 NC组相比,miR-1 inhibitor组H9c2细胞miR-1水平、Beclin1蛋白表达、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值显著降低,自噬小体减少,细胞增殖率、p62蛋白表达以及PI3K、Akt、mTOR蛋白磷酸化水平显著升高（P<0.05）;miR-1和PI3K间存在靶向关系。结论在高糖诱导的H9c2细胞中,miR-1表达水平升高,抑制miR-1,可通过靶向激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,抑制高糖诱导的H9c2心肌细胞自噬。     

盐酸小檗碱对宫颈癌HeLa细胞外泌体的影响及其机制

目的：观察盐酸小檗碱对宫颈癌HeLa细胞释放外泌体的干预作用,探讨其对癌细胞增殖和转移能力的影响。方法：将HeLa细胞分为对照组和低、中、高剂量盐酸小檗碱组,分别采用0、10、20和40 mg·L^-1盐酸小檗碱干预HeLa细胞24 h,高速离心提取外泌体,Western blotting法检测外泌体标志物CD81和CD63及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶（Akt）信号通路相关蛋白表达水平,MTT比色法检测细胞体外生长抑制率,划痕实验检测细胞迁移率,Transwell小室实验检测穿膜细胞数。结果：与对照组比较,低、中和高剂量盐酸小檗碱组细胞外泌体中外泌体标志物CD81和CD63蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞生长抑制率明显升高（P<0.05）,细胞迁移率和穿膜细胞数明显降低（P<0.05）,细胞中PI3K、Akt和磷酸化Akt（p-Akt）蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与低剂量盐酸小檗碱组比较,中和高剂量盐酸小檗碱组细胞外泌体中CD81和CD63蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞生长抑制率明显升高（P<0.05）,细胞迁移率和穿膜细胞数明显降低（P<0.05）,细胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平明显降低（P<0.05）。与中剂量盐酸小檗碱组比较,高剂量盐酸小檗碱组细胞外泌体中CD81和CD63蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,细胞生长抑制率明显升高（P<0.05）,细胞迁移率和穿膜细胞数明显降低（P<0.05）,细胞中PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,具有浓度依赖性。结论：盐酸小檗碱能够抑制宫颈癌细胞外泌体分泌和癌细胞增殖,降低癌细胞的侵袭和转移能力,其作用机制可能与下调PI3K/Akt信号通路相关蛋白表达有关。     

薯蓣皂苷通过调控AMPK/mTOR自噬信号通路影响骨肉瘤细胞增殖及侵袭的机制研究

【】 目的 探讨薯蓣皂苷(Dioscin)通过调控AMPK/mTOR自噬信号通路对MG63细胞增殖及侵袭的影响。方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞,分为空白对照组、薯蓣皂苷不同剂量组(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L),CCK-8法观察细胞增殖能力,划痕实验观察细胞迁移能力,通过Transwell小室观察细胞侵袭能力,丹酰尸胺法(MDC)观察细胞自噬情况,Western blot检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK/AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR/mTOR)、转录因子EB(TFEB)、被微管相关蛋白轻链3II(LC3-Ⅱ)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(beclin-1)蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较,Dioscin各剂量组MG63细胞增殖率、细胞迁移及侵袭能力依次降低,呈浓度依赖性(P＜0.05) ; MDC染色显示,空白对照组中仅有少量细胞自噬泡,作用48h后Dioscin各组自噬泡依次增多;与空白对照组相比,Dioscin各组MG63细胞中p-AMPK/AMPK、TFEB、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白水平依次升高,p-mTOR/mTOR蛋白水平依次降低,差异均具有统计学意义(P＜0.05);与Dioscin组比较,Dioscin+AMPK抑制剂组p-AMPK/AMPK、TFEB、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白表达水平明显降低,p-mTOR /mTOR表达升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论 Dioscin可能通过调控AMPK/mTOR-TFEB通路抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭。     

PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白在结直肠癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系*

目的?探究PI3K/Akt/mTOR信号通路中PTEN、p-Akt和p-mTOR在结直肠癌中的表达及与临床病理特征和预后的关系。方法?选取2016年1月—2017年12月中国人民武装警察部队海警总队医院52例结直肠癌活检标本。采用免疫组织化学SP法检测PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白在结肠癌标本及癌旁正常组织标本中的表达;Logistic回归模型分析PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达与临床病理特征的关系;Kaplan-Meier生存曲线分析PI3K-Akt-mTOR信号通路相关蛋白表达与预后的关系。结果?结肠癌组织中PTEN阳性率低于癌旁正常组织（P?<0.05）,而p-Akt、p-mTOR阳性率均高于癌旁正常组织（P?<0.05）;淋巴结转移患者的p-Akt和p-mTOR阳性率均高于无淋巴结转移患者（P?<0.05）;肿瘤浸润达到浆膜层患者的p-Akt阳性率高于未达浆膜层患者（P?<0.05）;肿瘤低分化患者的p-Akt阳性率高于高、中分化患者（P?<0.05）。临床分期Ⅲ、Ⅳ期患者的p-Akt和p-mTOR阳性率均高于Ⅰ、Ⅱ期患者（P?<0.05）。结直肠癌患者临床分期Ⅲ、Ⅳ期[OlR=4.098（95% CI：2.337,7.134）]是p-Akt阳性表达的影响因素（P?<0.05）。PTEN阳性患者的4年生存率为59.62%,高于阴性患者的21.15%（P?<0.05）;p-Akt阴性患者4年生存率为65.38%,高于阳性患者的19.23%（P?<0.05）;p-mTOR阴性患者4年生存率为61.54%,高于阳性患者的21.15%（P?<0.05）。结论?PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达与结直肠癌的发展、预后密切相关,p-Akt、p-mTOR有望成为新的结直肠癌治疗靶点和临床指标。     

JQ1通过抑制Akt/mTOR通路协同阿霉素抑制人骨肉瘤细胞的实验研究

目的 探索BRD4抑制剂JQ1协同传统化疗药物阿霉素（adriamycin, ADM）治疗骨肉瘤的有效性。方法 选取人骨肉瘤细胞系143b,在体外进行CCK8细胞增殖实验,了解ADM和JQ1对143b细胞的半数抑制率（IC50）剂量;应用低于IC50剂量的ADM或JQ1或联合应用ADM和JQ1,进行平板克隆实验和细胞凋亡实验;利用裸鼠皮下成瘤实验,观察应用ADM或JQ1或联合应用ADM和JQ1对体内肿瘤生长的抑制,以及诱导体内肿瘤细胞凋亡的作用;通过Western印迹法探索JQ1协同ADM抑制骨肉瘤细胞的可能机制。结果 ADM和JQ1对人骨肉瘤细胞系143b的IC50分别为0.23μmol/L和9.47μmol/L;选取0.2μmol/L ADM和8μmol/L JQ1进行平板克隆和细胞凋亡实验。单独应用ADM或JQ1可以抑制骨肉瘤细胞的克隆形成能力并诱导凋亡,联合ADM和JQ1可显著抑制骨肉瘤细胞的克隆形成能力并诱导凋亡,效果显著优于单药（P<0.05）。单独应用ADM或JQ1可抑制小鼠体内骨肉瘤的生长,联合应用ADM和JQ1对肿瘤生长的抑制要明显优于单独用药,差异具有统计学意义（P<0.05）。Caspase3免疫组化染色提示单独应用ADM或JQ1都可以在体内诱导人骨肉瘤细胞143b的凋亡,联合ADM和JQ1显著增强了对骨肉瘤细胞凋亡的诱导。Western印迹法提示骨肉瘤细胞在单独应用ADM后,磷酸化的Akt（p-Akt）和磷酸化的mTOR（p-mTOR）蛋白表达都上调了,而JQ1能够抑制p-Akt和p-mTOR的表达,JQ1联合ADM处理过的骨肉瘤细胞中p-Akt和p-mTOR的表达显著低于单独应用ADM组。结论 JQ1联合ADM能够显著抑制骨肉瘤细胞在体外和体内的生长,并诱导骨肉瘤细胞的凋亡;JQ1可能是通过抑制Akt/mTOR通路协同ADM发挥抑制人骨肉瘤细胞的作用。     

片仔癀通过PI3K/Akt信号通路诱导人骨肉瘤U2OS细胞凋亡

目的探讨片仔癀诱导骨肉瘤U2OS细胞凋亡与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途径的关系。方法采用不同浓度片仔癀（0.4，0.8，1.2mg/mL）作用U2OS细胞，采用MTT法检测片仔癀对U2OS细胞增殖的影响；Hoechst 333258染色观察细胞凋亡情况；Western blot检测PI3K调节亚基p85α（PI3K p85α）、磷酸化PI3K调节亚基p85α（p-PI3K p85α）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、核多聚（ADP-核酶）聚合酶（PARP）、裂解PARP（Cleaved PARP）等PI3K/Akt途径相关蛋白的表达。结果片仔癀可明显抑制U2OS细胞的增殖，呈时间和浓度依赖性，诱导U2OS细胞凋亡；Western blot显示p-PI3K p85α、p-Akt蛋白表达明显下调，Cleaved PARP表达量增加，与空白对照组相比有明显差异（P<0.05）。结论片仔癀可通过抑制PI3K/Akt信号途径PI3K p85α、Akt磷酸化，促进PARP裂解，诱导骨肉瘤U2OS凋亡。     

二甲双胍影响人结直肠癌细胞增殖和凋亡的机制研究

目的 探讨二甲双胍对人结直肠癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 二甲双胍处理体外常规培养人结直肠癌细胞HCT-15、COLO205,通过MTT检测结直肠癌细胞的生长活力;流式细胞仪检测细胞的周期及凋亡;Western blot检测凋亡相关蛋白Bad、Bcl-2、Cleaved caspase-3及信号通路蛋白Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、S6K、p-S6K的表达变化.结果 不同浓度的二甲双胍作用HCT-15、COLO205细胞72 h后细胞活力明显受到抑制,并呈现浓度依赖性;经流式细胞术分析,二甲双胍能够促使细胞停滞于G0/G1期,同时上调细胞早期及晚期凋亡所占比率;Western blot分析发现,Bad、cleaved caspase-3表达量随着二甲双胍浓度的升高而上调,Bcl-2表达量随着二甲双胍浓度升高而下降;同时,p-Akt及p-mTOR、p-S6K的表达量均明显被抑制,但Akt、mTOR、S6K总蛋白表达量无明显变化.结论 二甲双胍能够抑制结直肠癌细胞增殖,促进细胞凋亡;而具体机制可能与抑制Akt及mTOR通路活性有关.     

槲皮素对人骨肉瘤MG-63细胞周期及自噬流的影响

【目的】观察槲皮素对人骨肉瘤MG-63细胞体外生长周期及自噬的影响。【方法】以不同质量浓度的槲皮素作用于体外培养的MG-63细胞,流式细胞术检测MG-63细胞生长周期,荧光显微镜观察单体红色荧光蛋白(mRFP)—绿色荧光蛋白(GFP)—微管相关蛋白轻链3(LC3)双标腺病毒转染MG-63细胞后自噬小体的形成和自噬流的变化。【结果】槲皮素显著增加处于G1期的骨肉瘤MG-63细胞数量,上调MG-63细胞自噬水平。【结论】槲皮素可抑制人骨肉瘤MG-63细胞的增殖,使其停滞在细胞周期G1期,并诱导细胞自噬。     

鱼藤素对乳腺癌细胞株MCF-7增殖和凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的：观察鱼藤素对MCF-7细胞株细胞增殖和凋亡及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt）信号通路的影响,旨在研究其抗肿瘤机制。方法：细胞计数试剂盒8（cell counting kit-8,CCK8）检测0、1、5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后对MCF-7细胞增殖的影响,膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶双染法检测细胞凋亡率,透射电子显微镜观察细胞凋亡形态,蛋白质印迹法检测细胞内PI3K/Akt通路相关分子的蛋白表达。结果：5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后能明显抑制MCF-7细胞增殖（P〈0.01）,抑制率随着浓度升高和时间延长而增加,各组间两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）;而1μmol/L鱼藤素作用6、24、48和72h后对MCF-7细胞的增殖无明显影响（P〉0.05）。5、10、15和20μmol/L鱼藤素作用6h后能诱导MCF-7细胞凋亡,透射电子显微镜下可观察到典型的凋亡细胞形态,而相同条件下1μmol/L鱼藤素对MCF-7细胞的凋亡诱导作用不明显。5μmol/L鱼藤素作用6h后,MCF-7细胞内磷酸化Akt（p-Akt）（Thr308）、磷酸化糖原合成酶激酶-3β（phosphorylated glycogen synthase kinase-3β,p-GSK-3β）（Ser9）、磷酸化磷酸肌醇依赖性激酶1（phosphorylated 3-phosphoinositide-dependent protein kinase1,p-PDK1）（Ser241）和磷酸化人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因编码的蛋白（phosphorylated phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10,p-PTEN）（Ser380）的表达量明显减少,而总Akt蛋白的表达量则无明显变化;1μmol/L鱼藤素作用6h后,细胞内上述所有蛋白的表达量均无明显变化。结论：鱼藤素可能通过抑制PTEN（Ser380）和PDK1（Ser241）蛋白的磷酸化,进而抑制Akt（Thr308）的磷酸化,间接抑制其下游GSK-3β（Ser9）的磷酸化,最终诱导MCF-7细胞凋亡和抑制其增殖。     

小鼠骨髓间充质干细胞自噬与衰老的关系

目的 探讨小鼠骨髓间充质干细胞（BM-MSCs）自噬与衰老的关系。方法 通过体外分离培 养年轻组小鼠（8 周龄）和老年组小鼠（18 个月龄）BM-MSCs,流式细胞术检测细胞表型,TUNEL 染色检 测细胞凋亡,ELISA 试剂盒检测BM-MSCs 分泌蛋白VEGF、bFGF、IGF-1、HGF 的表达,Western blot 检 测自噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5、p62 及信号通路蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、 mTOR 的表达。结果 与年轻组比较,老年组BM-MSCs 凋亡增加（P <0.05）,分泌功能下降（P <0.05）,自 噬相关蛋白LC3- Ⅰ、LC3- Ⅱ、Beclin 1、ATG12-5 表达水平下降（P <0.05）,相反p62 蛋白表达水平升高 （P <0.05）,自噬信号通路相关蛋白p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR 表达升高。结论 老年小鼠BM-MSCs 凋亡增加,自噬活性及旁分泌功能下降。     

PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活导致强直性脊柱炎患者的间充质干细胞自噬减弱

目的 比较强直性脊柱炎患者间充质干细胞（ASMSCs）与健康人间充质干细胞（HDMSCs）自噬水平的差异及其机制。 方法 将ASMSCs和HDMSCs种于6孔板,细胞贴壁后,实验组加入25 ng/mL α-肿瘤坏死因子（TNF-α）及培养液,对照组单纯加入培养液,诱导6 h后进行后续实验。用GFP-LC3B免疫荧光染色检测自噬情况,并通过检测LC3 II/LC3 I及P62的蛋白表达进一步确认。通过qRT-PCR检测基因表达水平,通过Western blot检测蛋白表达水平。使用TG100713特异性阻断PI3K的磷酸化以明确PI3K/AKT/mTOR通路与ASMSCs自噬减弱的关系。 结果 ASMSCs的LC3 II/LC3 I表达水平和GFP-LC3B免疫荧光斑点明显弱于HDMSCs（P<0.05）,而P62表达水平明显高于HDMSCs（P<0.05）。在自噬过程中,ASMSCs中p-PI3K/PI3K、pAKT/AKT和p-mTOR/mTOR的表达明显高于HDMSCs（P<0.05）。阻断PI3K磷酸化后,p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR的表达及ASMSCs的自噬可恢复至HDMSCs的水平。结论 TNF-α诱导下,PI3K/AKT/mTOR信号通路异常是导致ASMSCs自噬减弱的关键,可能参与AS慢性炎症的发生。