薯蓣皂苷通过调控AMPK/mTOR自噬信号通路影响骨肉瘤细胞增殖及侵袭的机制研究

【】 目的 探讨薯蓣皂苷(Dioscin)通过调控AMPK/mTOR自噬信号通路对MG63细胞增殖及侵袭的影响。方法 体外培养骨肉瘤MG-63细胞,分为空白对照组、薯蓣皂苷不同剂量组(20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、100μmol/L),CCK-8法观察细胞增殖能力,划痕实验观察细胞迁移能力,通过Transwell小室观察细胞侵袭能力,丹酰尸胺法(MDC)观察细胞自噬情况,Western blot检测磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶/腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK/AMPK)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR/mTOR)、转录因子EB(TFEB)、被微管相关蛋白轻链3II(LC3-Ⅱ)、肌球蛋白样BCL2结合蛋白(beclin-1)蛋白表达水平。结果 与空白对照组比较,Dioscin各剂量组MG63细胞增殖率、细胞迁移及侵袭能力依次降低,呈浓度依赖性(P＜0.05) ; MDC染色显示,空白对照组中仅有少量细胞自噬泡,作用48h后Dioscin各组自噬泡依次增多;与空白对照组相比,Dioscin各组MG63细胞中p-AMPK/AMPK、TFEB、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白水平依次升高,p-mTOR/mTOR蛋白水平依次降低,差异均具有统计学意义(P＜0.05);与Dioscin组比较,Dioscin+AMPK抑制剂组p-AMPK/AMPK、TFEB、LC3-Ⅱ、beclin-1蛋白表达水平明显降低,p-mTOR /mTOR表达升高,差异均具有统计学意义(P＜0.05)。结论 Dioscin可能通过调控AMPK/mTOR-TFEB通路抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移及侵袭。     

经皮蛛网膜下置管引流对脊柱骨折合并硬脊膜损伤术后患者脑脊液漏的影响研究

目的观察经皮蛛网膜下置管引流对脊柱骨折合并硬脊膜损伤术后患者脑脊液漏的影响。方法选取2014年6月~2017年6月我院收治的脊柱骨折合并硬脊膜损伤术后出现脑脊液漏的患者74例为研究对象,按照随机数字表法分为常规组与观察组各37例,常规组采用体位调节伤口加压包扎治疗,观察组采用经皮蛛网膜下置管引流治疗。比较两组治疗后脑脊液漏消失时间、切口愈合时间、初次治疗成功率及并发症发生率。结果观察组脑脊液漏消失时间、切口愈合时间显著短于常规组,差异有统计学意义(P0.05);观察组初次治疗成功率为97.30%,显著高于常规组78.38%,差异有统计学意义(P0.05);观察组并发症发生率为0,显著低于常规组16.22%,差异有统计学意义(P0.05)。结论与常规治疗相比,经皮蛛网膜下置管引流治疗脊柱骨折合并硬脊膜损伤术后脑脊液漏效果良好,初次治疗成功率高,并发症少。     

人间充质干细胞外泌体通过p38丝裂素活化蛋白激酶信号通路促进小鼠胚胎成骨细胞前体增殖和成骨分化

目的 观察人间充质干细胞(hMSC)分泌的外泌体对小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1细胞)增殖和成骨分化的作用,并基于p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)信号通路探讨相关分子机制.方法 采用流式细胞术检测hMSC表面标志物;以成骨诱导液干预hMSC,通过茜素红染色检测钙化结节以反映其成骨能力;采用差速离心法提取hMSC外泌体,通过电镜观察检测外泌体粒径.将MC3T3-E1细胞分为4组,分别给予外泌体干预(外泌体组)、p38MAPK抑制剂SB203580干预(抑制剂组)、SB203580干预6 h后再加入外泌体干预(抑制剂+外泌体组),以未干预组作为对照组.通过蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR检测各组细胞中Ⅰ型胶原蛋白alpha1(COL1A1)、ruh相关转录因子2(Runx2)、碱性磷酸酶(Alp)、骨桥蛋白(Opn)的蛋白和mRNA表达量,蛋白质印迹法检测p38MAPK和磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)的表达量,MTT法检测细胞增殖情况,茜素红染色检测细胞成骨能力,采用Alp试剂盒检测细胞上清液中Alp活力.结果 hMSC表面CD90和CD105呈阳性表达,CD34和CD45呈阴性表达;hMSC具有成骨分化能力;分离的外泌体粒径为40～160 nm.与对照组比较,外泌体组MC3T3-E1细胞增殖能力,成骨能力,Alp活力,细胞中COL1A1、Runx2、Alp、Opn的蛋白和mRNA表达量,p-p38/p38MAPK蛋白表达量比值均增高,差异有统计学意义(P<0.05);抑制剂组结果与外泌体组相反,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);与抑制剂组比较,抑制剂+外泌体组MC3T3-E1细胞增殖能力、矿化结节、Alp活力无明显变化,细胞中COL1A1、Runx2、Alp、Opn的蛋白和mRNA表达量及p-p38/p38MAPK蛋白的表达量比值均无明显变化,差异无统计学意义(P>0.05).结论 hMSC分泌的外泌体可通过p38MAPK信号通路促进MC3T3-E1细胞的增殖和成骨分化.     

骨关节炎软骨损伤中miRNA-214的作用机制及靶向基因研究

目的:探讨骨关节炎(osteoarthritis, OA)软骨损伤中微小RNA(micro RNA,miRNA)-214的作用机制及靶向基因。方法:(1)OA患者膝关节损伤软骨组织中miRNA-214表达量检测。根据软骨损伤程度Outerbridge分级标准将收集的OA患者膝关节软骨组织进行分级，分别提取各软骨组织的总RNA,逆转录cDNA后采用实时定量PCR检测损伤软骨组织中miRNA-214的表达量。(2)miRNA-214在OA大鼠软骨损伤中的作用机制分析。采用手术剪断大鼠前交叉韧带的方法建立大鼠OA模型。将40只造模成功的大鼠随机分为miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组及模型组，将10只接受手术但不剪断前交叉韧带的大鼠纳入假手术组。设计、合成miRNA-214模拟物、miRNA-214抑制剂及miRNA-214阴性对照序列，构建慢病毒表达载体，完成病毒包装。在miRNA-214高表达组、miRNA-214低表达组、阴性对照组、模型组及假手术组大鼠右侧膝关节腔内分别注射100μL miRNA-214模拟物慢病毒混悬液、100μL miRNA-214抑...