GLP-1、Betacellulin、Activin A、bFGF和Nicotinamide联合诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞

[目的]探讨体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ES细胞)诱导分化为胰岛素分泌细胞.[方法]以GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicoti-namide 5种生长因子诱导E14.1小鼠ES细胞30 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫组化检测分化细胞胰岛素表达,以流式细胞仪检测胰岛素分泌细胞的分化率,用RIA法测定培养液中胰岛素水平.[结果]分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和胰岛素免疫组化染色阳性,胰岛素分泌细胞的分化率平均为13.6%±3.7%,在5.6 mmol/L和25 mmol/L葡萄糖浓度作用下培养液中胰岛素水平分别为(0.04±0.01)ng/mL和(0.09±0.02)ng/mL.[结论]体外联合应用GLP-1、betacellulin、activin A、bFGF和nicotinamide 5种生长因子能将小鼠ES细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,但胰岛素分泌功能较差.     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素生成细胞团

目的 探讨体外联合应用激活素A、全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺4种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导分化为胰岛素生成细胞团. 方法 先后以激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子诱导小鼠ESC 14 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫荧光检测分化细胞胰岛素表达. 结果 分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和免疫荧光染色阳性. 结论 体外联合应用激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子能够将小鼠ESC诱导分化为胰岛素生成细胞团.     

多种生长因子诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素生成细胞团

目的探讨体外联合应用激活素A、全反式维甲酸(ATRA)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和烟酰胺4种生长因子能否将小鼠胚胎干细胞(ESC)诱导分化为胰岛素生成细胞团。方法先后以激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子诱导小鼠ESC 14 d后,应用RT-PCR、DTZ染色和免疫荧光检测分化细胞胰岛素表达。结果分化细胞可检测到胰岛素mRNA表达,DTZ染色和免疫荧光染色阳性。结论体外联合应用激活素A、ATRA、bFGF和烟酰胺4种生长因子能够将小鼠ESC诱导分化为胰岛素生成细胞团。     

ES细胞-D3诱生的胰岛素分泌细胞及其分泌的胰岛素降糖活性的研究

目的：探讨ES细胞-D3来源的胰岛素分泌细胞（IPCs）分泌的胰岛素的降糖活性及IPCs移植对糖尿病（DM）鼠的降糖作用。方法：ES细胞-D3培养于经处理的鼠胚成纤维细胞滋养层上保持未分化状态扩增，对数生长期时转入无血清含bFGF的DMEM诱导液进行诱导分化，使其分化为IPCs。于诱导的第21天，用ELISA法检测IPCs受高糖刺激2h后所分泌的胰岛素，同时将分泌的胰岛素静脉注射给小鼠，观察受鼠血糖的变化；将诱生的IPCs移植给链脲菌素（STZ）诱导的DM小鼠．观察受鼠血糖水平的改变。结果：ES细胞-D3体外诱导生成的IPCs所分泌的胰岛素具有降糖活性．且IPCs经两次移植给DM小鼠后第5天，血糖水平较移植前显著降低（P〈0．05）．第2次移植后第15天，受鼠血糖水平反弹到与移植前没有差别。结论：小鼠ES细胞-D3诱导生成的IPCs能够分泌有活性的胰岛素，且在一段时间内可显著降低DM受鼠的血糖。     

脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元诱导分化的研究

目的 研究胚胎大鼠脊髓源性神经干细胞的培养和在体外骨髓基质细胞诱导其分化的情况。方法 从孕龄13d的胚胎大鼠脊髓组织中分离获得神经干细胞，采用含表皮生长因子（EGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的无血清限定性培养基培养，同时进行诱导分化，观测脊髓神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况，用细胞免疫荧光化学方法鉴定分化结果。结果 可从胚胎脊髓中分离得到大量的神经于细胞，通过限定性培养基培养可获得于细胞球，经从骨髓基质细胞培养液中获得的限制性培养液在体外可被诱导分化，用细胞免疫荧光化学法鉴定，可见有胆碱能神经元生成。结论 胚胎大鼠脊髓神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并长期保持稳定的性状，在体外可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

表皮生长因子对大鼠胚胎神经干细胞增殖分化的影响

目的：建立神经干细胞分离、培养的技术方法，探讨表皮生长因子(EGF)对大鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响。方法：从大鼠胚胎大脑组织中分离、培养神经干细胞，并用EGF和血清诱导其分化，采用免疫细胞化学方法鉴定神经干细胞增殖和分化的神经样细胞。结果：大鼠胚胎神经干细胞在无细胞因子和血清的培养基中无新生细胞形成，但能在EGF和血清的诱导下产生nestin和BrdU阳性细胞，细胞贴壁后分化为神经元和星形胶质样细胞。结论：EGF和血清能促进神经干细胞增殖，并诱导其向神经元样和星形胶质样细胞分化。     

体外培养海马神经干细胞的分化及超微结构观察

目的：研究胎鼠海马神经干细胞（NPCs）体外培养方法、了解其分化及超微结构特点．方法：分离胎鼠海马NPCs,应用机械分离法将海马组织制成单细胞悬液,用含有bFGF和EGF的无血清培养基培养,传代后用含血清培养基促分化,免疫细胞化学方法对NPCs及其分化后的子代神经细胞进行鉴定,并在电镜下观察分化后细胞的形态结构特征．结果：海马NPCs在无血清培养基中悬浮成球,贴壁后,细胞逐渐从细胞球向周围迁移分化．体外培养胎鼠海马NPCs表达巢蛋白（nestin）,在体外可诱导分化产生分别表达Tuj-1和GFAP的神经细胞．电镜观察到分化后的神经细胞及突起相互间排列、具有各种细胞器结构,可见细胞间紧密连接,完整的突触结构．结论：采用无血清培养基中加入特定生长因子的培养技术,可培养出在体外稳定增殖并有多向分化潜能的大鼠胚胎NPCs．     

无血清培养富集乳腺癌干细胞的初步研究

目的：探讨富集乳腺癌干细胞的方法,以获得稳定数量的肿瘤干细胞。方法：（1）采用无血清悬浮培养方法,从乳腺癌MDA-MB-435细胞中筛选和培养肿瘤干细胞。（2）采用相差显微镜观察含胰岛素和不含胰岛素的无血清培养基中干细胞球形成大小、数量及随时间生长变化情况。（3）采用荧光显微镜观察Hoechst33342染料对MDA-MB-435肿瘤干细胞染色情况。（4）将MDA-MB-435肿瘤干细胞转人有血清培养基培养诱导分化,观察是否能有分化现象。结果：（1）采用无血清悬浮培养方法筛选和培养MDA-MB-435肿瘤干细胞成功。（2）发现不含胰岛素的无血清培养基中,形成的肿瘤干细胞团数量多且体积大。（3）随着培养时间延长,肿瘤干细胞球数量逐渐增多,体积逐渐变大。（4）Hoechst33342染料对肿瘤干细胞染色鉴定,约有90％肿瘤干细胞蓝色荧光染料较弱,呈暗淡区。（5）MDA-MB-435肿瘤干细胞经含血清培养基再次培养,具有分化功能。结论：含生长因子的无血清培养基培养MDA-MB-435细胞,可生成肿瘤干细胞球;不含胰岛素的无血清培养基更适合作为筛选肿瘤干细胞的培养基。     

新生豚鼠海马神经干细胞的分离培养及鉴定

目的：探讨新生豚鼠海马来源的神经干细胞体外培养的最佳条件。方法：分离新生24h内的豚鼠海马组织，制成单细胞悬液，分别于DMEM／F12培养基、含体积分数2％B27的培养基及含4ng／L bFGF的B27培养基进行原代和传代培养，收集原代和传代培养的细胞，进行巢蛋白(Nestin)、GFAP及NSE免疫细胞化学染色。结果：在含bFGF的B27培养基中，传代的细胞不断分裂增殖，形成悬浮生长的呈Nestin阳性的神经干细胞团。传代培养分化的细胞可见NSE或GFAP免疫阳性细胞。结论：含体积分数2％B27的DMEM／F12培养基中添加bFGF可获得大量新生豚鼠海马神经干细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞诱导为胰岛样细胞体外实验

目的：探讨骨髓间充质干细胞（BMSCs）在不同葡萄糖浓度培养基中诱导效果的差异.方法：采用电镜观察细胞形态学变化、双硫腙（DTZ）染色鉴定胰岛素分泌细胞的存在;放射免疫分析法观察诱导后BMSCs细胞对葡萄糖刺激试验的反应;免疫细胞化学分析鉴定细胞内胰岛素分泌以及Real-timePCR鉴定胰岛β细胞相关基因mRNA表达水平.结果：电镜观察可见诱导后的细胞具备典型分泌细胞特点,DTZ染色显示各诱导组细胞团为棕红色,细胞浆中富含锌离子,而对照组则无染色,表明胰岛素分泌样细胞的存在.经不同浓度葡萄糖诱导后其吸光度值A值：低糖5.5mmol/L诱导组（4.75±1.87）,中糖11.1mmol/L诱导组（10.96±2.06）,高糖25mmol/L诱导组（12.53±2.04）,且各诱导组吸光度值A值随着培养基葡萄糖浓度的不断增加,A值也在不断增高.Real-timePCR定量分析结果显示,诱导后胰岛β细胞相关基因GK,PDX-1,ngn3,GLP-1mRNA的表达水平变化显著,差异具有统计学意义（P〈0.01）.胰岛素分泌量高糖25mmol/L诱导组（6.64±0.46）IU/L高于其他各组,差异具显著性（P〈0.01）.结论：培养基葡萄糖浓度对大鼠BMSCs诱导为胰岛样细胞具有一定影响,以高糖培养基的诱导效果较好.     

体外诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化的研究

目的:体外分离和定向诱导小鼠胎肝间充质干细胞向胰岛B样细胞分化.方法:无菌条件下从正常C57BL/6J胎鼠肝中分离出间充质干细胞,体外培养传3代后用高浓度葡萄糖培养基以及碱性纤维生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)和尼克酰胺诱导分化,观察胎肝间充质干细胞诱导前后形态变化;用RT-PCR检测细胞诱导前后胰十二指肠同源异型基因盒1(pancreatic duodenal homeobox-1,PDX-1)、胰岛素原1(proinsulin-1,INS-1)、葡萄糖转运子2(glucose transporter-2,GLUT-2)表达情况;胰岛素免疫细胞化学染色鉴定诱导后细胞胰岛素的表达;在形成胰岛样细胞簇后,用双硫腙做胰岛B细胞特异性染色.结果:RT-PCR显示诱导5 d后PDX-1、INS-1、GLUT-2均有表达,而诱导前的细胞则没有检测到表达;胰岛素免疫细胞化学表明细胞簇内的细胞胰岛素染色强阳性;细胞簇双硫腙染色阳性(每个T-25培养瓶有80～120个).结论:从胎肝中分离出的间充质干细胞在体外可以定向诱导分化为胰岛B样细胞.     

全反式维甲酸联合细胞因子诱导无血清培养的骨髓基质干细胞向神经细胞分化

目的研究全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子等细胞因子联合诱导体外无血清培养的骨髓基质干细胞（BMSCs）向神经细胞分化的作用。方法用含2%Utroser G的UltraCULTURE无血清培养体系体外扩增大鼠BMSCs，免疫细胞化学染色鉴定其表面标志，用以全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子为主要成分的复合诱导液诱导BMSCs向神经细胞方向分化，镜下观察细胞形态学变化，用抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）抗体和抗胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体进行免疫细胞化学染色鉴定诱导后的神经细胞。结果经全反式维甲酸、表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合诱导后的BMSCs表现为神经细胞形态特征，诱导后的细胞可存活14 d以上，免疫细胞化学染色显示NSE和GFAP均有阳性表达，前者阳性率为65.6%，后者阳性率为12.5%。结论全反式维甲酸与表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子及神经生长因子联合应用可在体外高效、稳定地诱导无血清培养的BMSCs分化为神经细胞。     

胎胰蛋白促进人脂肪来源的间充质干细胞向胰岛素及C-肽阳性细胞的分化及细胞鉴定

目的：利用大鼠胚胎胰腺组织蛋白提取物诱导人脂肪来源的间充质干细胞(hASCs)向胰岛素分泌细胞分化,为临床胰岛移植寻找新的细胞来源。方法：将新生SD大鼠的胚胎胰腺匀浆后提取胎胰蛋白,重建胰腺微环境,诱导hASCs向胰腺方向分化。诱导组为胎胰蛋白培养组,对照组不添加胎胰蛋白,其余培养条件相同,诱导20 d后,荧光定量PCR技术检测2组胰腺发育相关基因的表达水平,ELISA法检测细胞悬液胰岛素水平,荧光免疫组织化学检测细胞C-肽蛋白表达。结果：在胎胰蛋白诱导过程中,hASCs重要标志基因Oct3/4及Nanog的表达持续降低,说明hASCs逐渐失去全能干细胞的特性;在诱导的第6天开始检测到PDX-1和CK-19的表达上调,诱导细胞出现了胰腺方向的分化,12 d开始检测到胰岛素的阳性表达。所获分化细胞基础相分泌胰岛素量为（287.17± 15.67） mIU•L^-1,高糖刺激下为（401.09±28.94 ）mIU•L^-1,二者比较差异有统计学意义（P<0.01）,且均明显高于对照组的（4.85±1.04） mIU•L-1 (P<0.01);免疫荧光检测,诱导组可见C肽阳性细胞,对照组未见C-肽阳性细胞。结论：模拟的微环境可诱导hASCs分化为有功能的胰岛素产生细胞,具有替代胰岛细胞治疗糖尿病的潜在可能性。     

体外诱导犬骨髓间充质干细胞向上皮样细胞分化的初步研究

目的:探讨体外诱导犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)向上皮样细胞分化的可行性和基本条件.方法:抽取成年健康杂种犬的骨髓,用密度梯度离心及贴壁培养法分离纯化BMSCs,培养扩增后,取第2代BMSCs在以下不同培养液中诱导培养:K-SFM EGF BPE、DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS,观察细胞形态的变化,绘制细胞的生长曲线,诱导培养后第7、14天,用免疫细胞化学染色和流式细胞仪鉴定上皮细胞特异性标志物细胞角蛋白(cytokeratin, CK)和上皮膜抗原(epithelial membrane antigen, EMA)的表达.结果:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞形态变为圆形或椭圆形,有突起,第14天圆形或椭圆形细胞明显增多;诱导培养过程中DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞形态无明显变化.CK免疫细胞化学染色结果提示:K-SFM EGF BPE组诱导培养第7天,少量细胞呈阳性表达,第14天,阳性细胞明显增多;DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均呈阴性表达.流式细胞仪检测发现K-SFM EGF BPE组诱导培养第14天,部分细胞CK和EMA呈阳性表达(>7%),DMEM EGF、K-SFM BPE、DMEM FBS组细胞均为阴性.结论:本实验提示K-SFM EGF BPE联合培养液能够在体外诱导犬BMSCs向上皮样细胞分化.     

小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性

[目的] 探讨小鼠骨髓干细胞有无被诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性.[方法] 培养小鼠骨髓干细胞,采用含 GLP-1和 nicotinamide的无血清培养液诱导分化,在培养过程中,检测有关基因的表达.[结果]培养的小鼠骨髓干细胞具有与文献报道相似的生物学特性;在诱导分化第 7天,有 ngn3和 pdx-1基因表达;在诱导分化第 14天,有 nkx2.2、 pdx-1和 ins2基因表达.[结论] 小鼠骨髓干细胞有诱导分化为胰岛素分泌细胞的可能性,值得进一步研究.     

体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺细胞分化的研究

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞来源表皮干细胞向汗腺上皮分化可行性及条件,为汗腺组织工程探索新的种子细胞提供来源。方法:体外分离培养、扩增并鉴定人汗腺细胞。将胚胎干细胞培养于人羊膜表面诱导其向表皮干细胞转化后,与人汗腺细胞直接共同培养,诱导其分化为汗腺细胞。采用倒置显微镜进行形态学观察,并用免疫细胞化学染色方法检测诱导分化结果。结果:体外培养的人汗腺细胞CK19、CEA阳性表达。培养于人羊膜表面的胚胎干细胞β1整合素呈强阳性表达,符合表皮干细胞的表面抗原标志。经与人汗腺细胞共培养2周后,有部分胚胎干细胞来源的表皮干细胞表达CEA,表明通过汗腺细胞分泌的细胞因子、细胞间直接接触等可能的作用途径,使其表型向汗腺细胞表型转化。结论:胚胎干细胞来源表皮干细胞可能成为汗腺组织工程种子细胞的重要来源。     

人脂肪基质细胞向胰岛素分泌细胞的分化诱导

目的:体外分离培养人脂肪来源基质细胞（hADSCs）,并定向诱导hADSCs向胰岛样细胞分化,探讨hADSCs分化为胰岛素分泌细胞的潜能。方法:从脂肪抽吸物中分离hADSCs,利用碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、上皮细胞生长因子(EGF)、尼克酰胺和exendin-4等因子诱导hADSCs向胰岛样细胞分化。采用RT-PCR检测诱导前后胰岛素、胰十二指肠同源性盒因子(Pdx-1)、葡萄糖转运因子2(Glut-2)和胰高血糖素(glucagon)基因的表达;双硫腙染色鉴定胰岛样细胞团;免疫荧光染色检测诱导后细胞胰岛素和Pdx-1的表达;ELISA检测诱导后细胞在低糖和高糖环境中胰岛素的分泌量。结果:诱导7 d左右细胞由长梭形逐渐变成多边形,并且细胞开始呈岛状聚集,21 d左右形成胰岛样细胞团。双硫腙染色阳性;RT-PCR显示,诱导后细胞表达胰岛素、Pdx-1、Glut-2和glucagon基因;免疫细胞化学显示,诱导后细胞表达胰岛素和Pdx-1;葡萄糖刺激实验显示胰岛素的释放,并且随着葡萄糖浓度增加胰岛素的释放量也增加。结论:体外hADSCs具有分化为胰岛素分泌细胞的潜能,为将来应用于临床移植治疗糖尿病奠定了基础。     

Skeletal muscle-derived stem cells exhibit cardiocyte competences

Adult stem cells from skeletal muscle cells were induced to differentiate into cardiocytes to see if stem cells from another different but histologically-comparable tissues can differentiate to the target cells. Skeletal muscles-derived stem cells （MDSCs） were isolated from adult skeleton muscle tissues by differential adhesion, and immunocytochemically identified by using Sca-1. In order to induce the proliferation but not differentiation of MDSCs, the cells were cultured in Dulbecco’s modified Eagle’s medium/F12 （DMEM/F12） supplemented with 1：50 B27, 20 ng/mL basic fibroblast growth factor （bFGF）, 20 ng/mL epidermal growth factor （EGF） in a suspension for 6 days. Then these stem cells were treated with 5 μmol/L 5-azacytidine for 24 h in an adherence culture. The characteristics of induced cells were examined by immunocytochemistry, quantitative real time RT-PCR and morphological observation of cell phenotype. Our results showed that the appearance of some cells gradually changed from spindle-shape into polygonal or short-column-shape. Some of these post-treated cells could contract spontaneously and rhythmically. The expression of GATA-4 and cTnT was increased 1 and 2 week（s） after the treatment. And about 16.6% of post-treated cells were cTnT-positive. Therefore, we are led to conclude that skeletal muscle-derived stem cells could differentiate into cardiocyte-like cells, which exhibited some characteristics of cardiocytes.     

体外诱导人脐血单个核细胞向肝细胞样细胞的分化

目的:探讨人脐血单个核细胞（MNC）能否在体外诱导分化为肝细胞样细胞。方法:采集正常产妇脐血,淋巴细胞分离液分离MNC,流式细胞仪检测其表面标志。分别用肝细胞生长因子(HGF)、成纤维细胞生长因子-4(FGF4)、HGF+FGF4、无生长因子4种处理因素 进行诱导培养,于诱导前及诱导后的第7、14、21、28天采用RT-PCR检测AFP、白蛋白及C-met、FGFR₂ mRNA的表达,免疫细胞化学法检测肝细胞抗原和CK18的表达,PAS 法进行糖原染色。结果:诱导前检测到C-met、FGFR₂ mRNA的表达,诱导后第7和21天分别检测出AFP和白蛋白mRNA的表达,第28天检测出CK18、肝细胞抗原的表达及糖原染色阳性细胞,无生长因子诱导组未检测到肝系细胞标志。HGF+FGF4诱导组肝系细胞标志阳性率均高 于单独生长因子诱导组(P<0.05)。结论：HGF、FGF4均能在体外诱导人脐血MNC分化为肝细胞样细胞,且二者在一定程度上有联合作用。