含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体对荷B16黑色素瘤小鼠免疫功能的影响

目的：研究含鼠GM-CSF基因的腺病毒载体（AdCMVGM-CSF）直接注射荷B16黑色素瘤小鼠瘤体内对小鼠免疫功能的影响。 方法：将B16黑色素瘤细胞（5×10⁶/只）接种于C57/BL6小鼠右侧背部皮下后,将荷瘤小 鼠随机分为2组,每组12只,待瘤体直径达5 mm时分别注射AdCMVGM-CSF、AdCMVLacZ （5×10⁸ PFU/只）,检测每组小鼠的免疫功能及其对B16黑色素瘤的抑制作用。 结果：AdCMVGM-CSF实验组小鼠注射后第10天,荷瘤鼠血清中GM-CSF水平［(1 563.72±136.58)ng·L^-1］高于对照组（P<0.01）,肿瘤组织周围的CD8＋ T细胞表达明显增强。 结论：AdCMVGM-CSF可增强荷B16黑色素瘤小鼠的抗肿瘤免疫反应,具有抑制肿瘤生长的作用。     

白细胞介素12基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用

目的：研究白细胞介素12（IL-12）基因修饰的Lewis肺癌瘤苗的抗肿瘤免疫作用。方法：用含IL-12基因的腺病毒载体,在体外以不同感染系数感染Lewis肺癌细胞,并分别接种于C57BL/6小鼠皮下,观察其致瘤性的变化;并用Lewis肺癌细胞及B16黑色素瘤细胞再 次攻击免疫后的C57BL/6小鼠,观察肿瘤发生情况。 结果：以各种感染系数AdCMVIL-12制备的瘤苗,接种于小鼠皮下后,无肿瘤生长,完全消除了Lewis肺癌细胞的致瘤性;瘤苗注射6 d后,用Lewis肺癌细胞再次攻击,仍无肿瘤生长,抑瘤率达100%;用B16黑色素瘤细胞攻击,10~12 d均有肿瘤生长,说明此瘤苗具有肿瘤特异性。结论：AdCMVIL-12能消除Lewis肺癌细胞的致瘤性,并能诱导显著的抗肿瘤免疫反应,对肿 瘤的复发及转移有较好疗效。     

结核杆菌抗原85A与GM-CSF诱发抗鼠黑色素瘤效应研究

目的：用结核杆菌抗原85A（Ag85A）和细胞因子GM-CSF,作为异种抗原及免疫增强剂,研究其在鼠体内能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答。方法：用分子生物学法构建重组质粒pRSC-Ag85A/GM-CSF,通过细胞转染获得稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16黑色素瘤细胞。48只C57BL/6小鼠随机均分为B16细胞组、B16-pRSC细胞组、B16-Ag85A细胞组和B16-Ag85A/GM-CSF细胞组,分别将上述不同B16细胞经背部皮下接种小鼠。通过观察其致瘤性的强弱、荷瘤鼠生存时间、鼠血清IFN-γ水平以及CTL、NK细胞杀伤活性,分析Ag85A和GM-CSF在抗肿瘤免疫效应中作用。结果：B16-Ag85A/GM-CSF细胞组小鼠肿瘤生长明显受到抑制,生存时间较对照组平均延长40%,血清IFN-γ分泌较对照组高1倍,CTL、NK细胞杀伤活性与其他各组相比也有较大的提高。结论：接种稳定表达Ag85A和GM-CSF的B16细胞能降低对小鼠的致瘤性,诱导有效的抗肿瘤效应。     

CD自杀基因联合GM-CSF基因治疗的抗肿瘤作用及免疫机理

目的：研究自杀基因与粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）基因联合治疗抗肿瘤作用及免疫机制。方法：小鼠皮下接种黑色素瘤Ｂ１６Ｆ１０细胞３ｄ后,分别在肿瘤局部直接注射表达小鼠ＧＭ－ＣＳＦ的重组腺病毒ＡｄＧＭ－ＣＳＦ和表达大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（ＣＤ）基因的腺病毒ＡｄＣＤ,然后连续１０ｄ腹腔注射５氟胞嘧啶（５ＦＣ）（ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ组）、单用ＡｄＣＤ／５ＦＣ组、单用ＡｄＧＭ－ＣＳＦ组、注射对照病毒ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ组或ＰＢＳ组。结果：与接受ＡｄＣＤ／５ＦＣ、ＡｄＧＭ－ＣＳＦ、ＡｄｌａｃＺ／５ＦＣ或ＰＢＳ治疗的荷瘤小鼠比较,经联合治疗后荷瘤小鼠皮下肿瘤结节的生长明显受到抑制,荷瘤小鼠的存活期明显延长（Ｐ＜０．０１）。经ＡｄＣＤ／５ＦＣ／ＡｄＧＭＣＳＦ联合基因治疗后,肿瘤瘤体内或瘤周有大量树突状细胞、ＣＤ８＋Ｔ细胞浸润,黑色素瘤细胞表达ＭＨＣ－Ⅰ和Ｂ７－１分子明显增加,荷瘤小鼠脾细胞对Ｂ１６Ｆ１０黑色素瘤细胞特异性杀伤功能增强。结论：联合应用自杀基因和ＧＭ－ＣＳＦ基因转移可以直接杀伤肿瘤细胞,又可提高机体对肿瘤的免疫应答,两者可协同发挥抗肿瘤作用。     

含鼠白细胞介素12基因腺病毒载体对小鼠支气管哮喘模型肺组织GATA-3表达的影响

目的：探讨含鼠白细胞介素12（IL-12）基因的腺病毒载体（AdCMVIL-12）对小鼠支气管哮喘模型GATA-3表达的影响。方法：BALB/c小鼠30只,随机分为正常对照组（A组）、哮喘模型组（B组）和AdCMVIL-12实验组（C组），B和C组建立哮喘模型，并于第20天分别鼻内吸入50 μL生理盐水和5×10⁸ PFU AdCMVIL-12。第28天收集各组小鼠的支气管肺泡灌洗液（BALF），比较细胞总数及细胞分类的变化，HE染色观察小鼠支气管及肺组织的病理变化，免疫组化及RT-PCR方法检测各实验组肺组织中GATA-3的表达情况。结果：哮喘模型组与对照组及AdCMVIL-12实验组比较，小鼠肺组织有大量炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞为主。免疫组织化学及RT-PCR结果显示，哮喘模型组小鼠肺组织GATA-3表达（0.48 ±0.06）明显高于实验组（0.16±0.07）及对照组（0.18±0.04 ）(P<0.01)。结论：AdCMVIL-12对小鼠支气管哮喘的气道及肺组织炎症有明显的抑制作用，其机制可能与AdCMVIL-12阻断GATA-3的表达,调节Th₁/Th₂细胞因子的平衡有关。     

IL-2基因转染细胞激活非特异性免疫杀伤细胞的抗肿瘤作用

以NIH3T3细胞作为载体细胞，用基因转染的方法建立了持续分泌白细胞介素2（IL－2）的细胞株。在体外此细胞上清可以增强小鼠脾细胞和腹腔巨噬细胞对黑色素瘤B16细胞的杀伤作用（与对照组比较，均为P＜0．01）。体内注射基因转染细胞则可以抑制黑色素瘤细胞在体内的生长（与对照组比较，均为P＜0．01）。结果表明，分泌IL-2的成纤维细胞可以通过激活非特异性免疫杀伤细胞而达到抗肿瘤的作用，是一种有较大潜力的肿瘤生物治疗的新途径。     

过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。     

树突状细胞激活的肿瘤浸润淋巴细胞体外抗小鼠乳腺癌活性的研究

目的:探讨致敏的树突状细胞(DC)激活的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)体外抗小鼠乳腺癌活性.方法:从小鼠四肢长骨骨髓中获取DC,应用粒/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-4(IL-4)和肿瘤全细胞性抗原致敏DC,然后用DC激活TIL,观察TIL在体外对小鼠C127乳腺癌细胞、小鼠MA782乳腺癌细胞和小鼠B16黑色素瘤细胞的杀伤活性.结果:经C127细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL具有很强的对C127细胞的杀伤活性[杀伤活性为(70.21±2.86)%],明显高于其对MA782和B16细胞的杀伤活性[杀伤活性分别为(51.31±3.25)%,(31.41±2.65)%],也明显高于未经DC激活的TIL、C127-DC-小鼠脾淋巴细胞和未经DC激活的小鼠脾淋巴细胞对C127细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(48.30±2.97)%,(47.76±3.43)%和(17.23±2.56)%]和对MA782细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(38.52±2.87)%,(36.62±2.75)%和(18.07±2.40)%]以及对B16细胞杀伤活性[杀伤活性分别为(25.38±2.63)%,(24.82±2.81)%和(17.34±2.81)%],同时B16细胞全细胞性抗原致敏的DC激活的TIL(TIL来源于C127瘤体)也可诱导相对较低的对B16细胞的特异性细胞杀伤活性.结论:经C127细胞全细胞性抗原致敏的DC能诱导TIL产生高效而特异的体外抗小鼠乳腺癌免疫.     

腺病毒介导p21WAF-1联合GM-CSF基因对胃癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用的研究

目的探讨腺病毒介导p21^WAF-1联合GM-CSF基因对胃癌荷瘤裸鼠的抑瘤作用。方法将32只裸鼠建立人胃癌MKN-45细胞移植瘤动物模型。成瘤后动物随机平均分为4组：对照组、p21^WAF-1基因治疗组、GM-CSF基因治疗组、p21^WAF-1＋GM-CSF联合基因治疗组；分别由皮下瘤体内注射重组体腺病毒0．1mL Ad-LacZ、Ad-p21、Ad，GM、Ad-p21＋GM，每周1次，共3次。3个月后观察肿瘤抑制率、肿瘤体积和动物存活情况以及肿瘤组织病理切片。结果（1）联合基因治疗组动物的肿瘤生长受到明显抑制。与单独给予p21^WAF-1和GM-CSF基因治疗动物相比。抑制作用显著提高（P〈0．05）；（2）荷瘤小鼠生存期观察，与对照组相比，p21^WAF-1基因组和GM-CSF基因组有所延长，联合基因治疗组显著延长（P〈0．01）；（3）病理切片示各基因治疗组肿瘤组织均有出血、坏死和炎性细胞浸润，联合基因治疗组有片状坏死。结论p21^WAF-1和GM-CSF两种基因联合治疗胃癌，可以有效抑制肿瘤生长、延长生存期，为胃癌的治疗提供新的思路。     

瘤体注射IL-2重组腺病毒基因治疗小鼠胶质母细胞瘤及其免疫机制的初步探讨

目的：观察瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对G422皮下荷瘤的治疗作用,对体内基因转染效率及治疗的免疫机制进行初步分析。方法：将LacZ,IL-2重组腺病毒直接注射到皮下接种的G422胶质母细胞瘤瘤体,X－gal染色检测基因转染的效率,观察肿瘤的大小和荷瘤小鼠的存活期,采用4h^51Cr释放法检测荷瘤小鼠脾细胞诱导的NK、LAK、CTL的杀伤活性,对治疗后的肿瘤进行常规病理分析。结果：采用瘤体注射腺病毒具有较高的体内基因转染效率,瘤体注射IL－2重组腺病毒对皮下建立的胶质母细胞瘤有一定的治疗作用,肿瘤的生长受抑制,荷瘤小鼠的存活期显延长,但没有长期存活小鼠。IL－2基因治疗组小鼠脾细胞的LAK、CTL杀伤活性显增强,肿瘤局部出现更多的坏死和炎性浸润细胞。结论：采用瘤体直接注射IL－2重组腺病毒对胶质母细胞瘤皮下荷瘤有治疗,其机制可能是增强了宿主的局部和全身抗肿瘤免疫反应。     

CD3AK和黄芪多糖联合治疗荷瘤动物的实验研究

目的　探讨CD3AK和黄芪多糖 (APS)对荷瘤动物的治疗作用。方法　将黑色素瘤B1 6细胞移植到C57BL/ 6小鼠腹腔建立动物模型 ,分别用APS、CD3AK及二者联合治疗荷瘤鼠 ,检测荷瘤鼠脾NK细胞活性和脾淋巴细胞IL - 2诱生水平以及荷瘤鼠生存期。结果　单纯APS和单纯CD3AK细胞能延长荷瘤鼠的生存期 ,分别为 1 8.64± 1 .2 1天和 2 5 .34± 3 .68天 (荷瘤鼠对照组为 1 4 .67± 2 .82天 ,P <0 .0 1 ) ;二者联合应用 ,APS能显著增强CD3AK细胞的抗肿瘤作用 ,延长荷瘤鼠的生存期 ,其生存期为 35 .65± 3 .74天 (P <0 .0 0 1 )。通过对荷瘤鼠进行细胞免疫功能观察发现 ,CD3AK细胞和APS均具有抵抗荷瘤鼠NK细胞活性、IL - 2产生能力下降的作用 ;APS对CD3AK仍有显著增强效应。结论　APS是一种实用而有效的生物反应调节剂 ,CD3AK和APS联合应用对晚期肿瘤有一定治疗效果     

IL-12联合B7-1基因放射治疗对小鼠B16移植肿瘤生长的影响

目的：探讨基因联合放疗对小鼠B16移植肿瘤的抑制作用。方法：碱裂解法提取纯化质粒DNA，微量注射法直接将质粒DNA导入体内肿瘤；建立荷瘤小鼠模型, 于小鼠右后肢皮下接种5×10⁵个B16黑色素瘤细胞，待肿瘤直径达0.3~0.5 cm时开始治疗；肿瘤局部注射pNE-mIL-12和pcDNA-B7-1质粒3次，并给予3次X线照射，观察小鼠移植肿瘤的生长情况。结果：pNE-mIL-12重组质粒与pcDNA-B7-1质粒联合2 Gy放射治疗组肿瘤生长速率最低，小鼠生存时间明显延长（P<0.01~P<0.001），末次照射后31 d小鼠死亡率仅为22.2%，而且其中有1只小鼠肿瘤消退。结论：多基因联合放疗可有效抑制小鼠B16移植肿瘤的生长，其效果好于单基因治疗和单纯放疗。     

Anti-tumor effects of pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid induced by X-irradiation and its mechanisms

Objective To study the effect of gene radiotherapy combining injection of recombinant plasmid pNEgr-mIL-12 with local X-irradiation on cancer growth and to elucidate the mechanisms of tumor inhibition. Methods Alkaline lysis was used to extract the plasmid and polyethylene glycol 8000 (PEG 8000) was applied for further purification of plasmids. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the expression of IL-12 protein. C57BL/6J mice were subcutaneously inoculated with B16 melanoma cells and the plasmid was injected directly into the tumor. Gene-radiotherapy combining pNEgr-mIL-12 recombinant plasmid with X-irradiation was given three times to C57BL/6J mice bearing B16 melanoma. Changes in immunologic parameters of tumor-bearing mice were detected with relevant immunologic assays. Results Results showed a significant decrease in tumor growth rate (P<0.05-0.001) after 3 times of gene-radiotherapy with IL-12 and X-irradiation. Immunologic studies showed a significant increase in CTL and NK cytolytic activity (P<0.05-0.001) and an up-regulated secretion of IFN-γ and TNF-α (P<0.01-0.001). Moreover, the expression of mIL-12 in B16 melanoma cells of the treated tumor-bearing mice was found to be higher than that of control. Conclusion pNEgr-mIL-12 plasmid combined with X-irradiation can increase tumor control and the mechanism of increased tumor inhibition is related to the enhancement of anticancer immunity in tumor-bearing mice.     

三七总皂苷联合环磷酰胺节律化疗抗肿瘤效应观察

目的研究三七总皂苷(panax notoginsenosides,PNS)联合低剂量环磷酰胺(CTX)节律化疗的抑瘤、抗血管生成及对免疫功能的调节作用。方法小鼠爪垫皮下注射B16细胞,建立B16-BL6黑色素瘤自发性转移模型。分为模型组、大剂量CTX组(MTD组)、低剂量CTX组(节律组)、三七总皂苷组、三七总皂苷联合低剂量CTX组(联合组)。观察抑瘤率、胸腺和脾脏的脏器指数;ELISA法测定IL-2含量;进行外周血白细胞计数;肿瘤微血管密度(MVD)、血管内皮生长因子(VEGF)和趋化因子受体4(CXCR4)的表达情况;计数肺转移结节数。结果节律组、三七总皂苷组及联合组小鼠肿瘤生长缓慢,抑瘤效果持久而稳定。联合组抑瘤率66.15%(P0.01),对瘤体有较好的抑制作用。节律组相对于大剂量CTX组毒副反应降低,与PNS伍用后免疫功能各项指标明显提升,与MTD组比较有显著性差异(P0.01),接近模型组水平,MVD、VEGF及CRCX4表达均下降(P0.05),能够有效减少肺转移瘤灶数量。结论三七总皂苷与低剂量CTX联合应用显示出有效地抗血管生成协同作用,减少转移,抑瘤效果持久,毒副反应小,能够提高小鼠整体机能状态与免疫水平。     

乙酰半胱氨酸抑制巨噬细胞诱导的泡沫细胞基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达

目的：探讨乙酰半胱氨酸(NAC)对巨噬细胞诱导的泡沫细胞基质金属蛋白酶MMP2和MMP9的抑制作用。方法：10只大白兔用球囊损伤主动脉进行球囊损伤,用高胆固醇食物（0.5%高胆固酶,4.5%椰子油）饲养8周,然后从主动脉粥样斑块中分离出巨噬细胞诱导的泡沫细胞,在无牛血清DMEM细胞培养液中加入 10 mmol•L^-1NAC为实验组,对照组(未经球损伤的组织细胞)不加NAC。两组均在37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养24 h、48 h和4 d后收集培养液,应用酶谱和免疫组化方法分别检测培养液和斑块主动脉粥样局部组织中的MMP2和MMP9的表达。结果：实验组24 h、48 h和4 d Pro-MMP9［分别为(654±33.5)、(780±65.0)和(799±48.9)INT•mm^-2］低于对照组 ［分别为(1 455±50.9)、(15 615±52.0)^-2和(1 467±48.8)INT•mm^-2］(P<0.01);实验组24 h、48 h和4 d　MMP2分别为［(221±25.3)、(224±25.0)和(202±33.9)INT•mm^-2］低于对照组［分别为(467±34.3)、(561±42.0)和(671±34.8)INT•mm^-2］(P<0.01)(P<0.01)。兔疸组化方法显示了巨噬细胞MMP２、MMP9均为阳性染色(+)。结论：NAC减少巨噬细胞诱导的泡沫细胞基质金属蛋白酶（MMPs）的表达,提示NAC可作为冠心病治疗的一个新靶点。      

转导白细胞介素2基因的B16细胞对机体免疫反应的影响

应用XM6逆转录病毒载体将人IL-2cDNA转入小鼠B16黑色素瘤细胞。丝裂霉素C处理的转染前后B16细胞作为瘤苗对小鼠进行免疫接种。结果显示，接种B16-IL-2细胞可明显排斥再移植黑色素瘤的生长。对脾淋巴细胞检测的结果表明，MLTR引起的淋巴细胞增殖与特异性CTL杀伤活性，以及NK、LAK活性与诱生的IL-2水平几项指标，B16-IL-2细胞免疫组均明显高于B16免疫组及对照组。提示转基因肿瘤细胞在体内分泌IL-2增强了机体的特异性与非特异性免疫功能。