RNAi干扰黑色素瘤细胞Notch1基因表达对小鼠肿瘤免疫机制影响

目的 探讨靶向Notch1的siRNA抑制恶性黑色素瘤Notch通路对小鼠机体抗肿瘤免疫的影响.方法 采用RNA干扰小鼠黑色素瘤细胞B16F1 Notch1基因的表达,酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测转染前后肿瘤细胞分泌免疫抑制因子转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白细胞介素10(interleukin-10,IL-10)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的变化.制作小鼠黑色素瘤模型,在肿瘤生长过程中瘤内注射si-Notch1,记录肿瘤生长情况,手术切除肿瘤组织,流式细胞术检测肿瘤组织中gp100抗原特异性CD8+T细胞的比例,ELISA法比较各组肿瘤匀浆上清中IFN-γ和免疫抑制因子TGF-β的含量变化,免疫组化法分析肿瘤组织中FoxP3+Treg细胞的数量.结果 siNotch1转染后,成功下调了黑色素瘤细胞Notch1基因的表达.ELISA实验结果显示,转染后siNotch1组、siNC组和mock组细胞上清TGF-β分泌量分别为(0.665±0.242)、(1.413±0.153)和(1.623±0.111) ng/mL,F=40.237,P=0.000 48;VEGF的分泌量分别为(399.9±79.42)、(397.3±107.0)和(388.6±136.8) ρg/mL,差异无统计学意义,F=0.015,P=0.986;IL-10的分泌量为(38.93±12.45) 、(41.84±9.85)和(45.81±9.36) ρg/mL,差异无统计学意义,F=0.525,P＝0.604.siNotch1瘤内注射之后,小鼠肿瘤生长明显减慢.流式细胞术检测结果显示,siNotch1组、siNC组和mock组gp100抗原特异性CD8+T细胞的比例分别为(5.54±1.68)％、(2.43±1.09)％和(2.57±1.16)％,F＝12.643,P=0.000 25.免疫组化结果显示,FoxP3平均阳性细胞数分别为23.13±6.75、38.63±10.68和41.75±12.10,F=7.802,P=0.003.肿瘤组织匀浆ELISA结果显示,siNotch1组、siNC组和mock组IFN-γ的浓度分别为(10.047±1.775)、(4.121±1.379)和(3.698±1.253)ng/mL,F＝45.660,P＝0.000 23;TGF-β的浓度分别为(3.738±1.203)、(7.663±2.114)和(7.545±2.080)ng/mL,F=11.687,P=0.000 39.结论 siNotch1抑制黑色素瘤细胞Notch通路后,可以降低其分泌TGF-β的含量,从而降低其对淋巴细胞的抑制作用,增加肿瘤组织中gp100抗原特异性CD8+T细胞的浸润,促进IFN-γ的分泌,降低Treg细胞的比例,增强机体抗肿瘤免疫功能.     

放疗协同免疫检查点阻滞剂治疗肿瘤的机制

随着对肿瘤免疫机制的深入研究,学者们注意到了放疗激活机体产生全身免疫效应的现象,改变了放疗是“免疫抑制性”的片面认识.然而,放疗虽能增强机体的抗肿瘤免疫,在临床上,接受放疗的患者仍避免不了复发、转移.研究表明,这与肿瘤微环境诱导的免疫检查点通路异常激活密切相关.因此,将放疗与免疫检查点阻滞剂联合应用,改善肿瘤微环境,能提高肿瘤治疗效果.     

X射线照射联合Veliparib诱导小鼠乳腺癌细胞衰老的相关研究

目的 电离辐射联合多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(PARP)抑制剂能够加速肿瘤细胞衰老,衰老的肿瘤细胞分泌水平会发生变化.本研究探讨X射线照射联合Veliparib诱导小鼠乳腺癌细胞衰老及其衰老相关分泌表型(senescenceassociated secretory phenotype,SASP)的变化.方法 采用X射线照射联合Veliparib处理小鼠乳腺癌细胞株4T1,诱导衰老肿瘤细胞模型;采用衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色试剂盒检测细胞SA-β-gal作为评估衰老的指征,根据细胞大小及颗粒流式分选大衰老肿瘤细胞;荧光定量PCR检测衰老相关分泌表型,比较对照组、Vel组、X射线组、X射线+ Vel组的相对表达量,观察X射线+Vel组细胞因子表达的动态变化;采用多重液相蛋白定量技术(cytometric beads array,CBA)检测细胞上清液中TNF-α、IFN-β和IFN-γ的浓度;荧光定量PCR检测流式分选出的大衰老细胞和非衰老细胞的分泌表型.结果 X射线+Vel组细胞在照射后第4天出现明显的衰老指征;对照组、Vel组、X射线组、X射线+Vel组中大衰老肿瘤细胞的比例分别为(2.633±0.961)％、(2.867±1.069)％、(20.133±3.570)％和(58.200±6.583)％,析因设计方差分析显示X射线照射(F=273.720,P＜0.001)及药物Veliparib(F=75.691,P＜0.001)的主效应差异均有统计学意义,X射线照射与药物Veliparib的交互效应显著(F=73.858,P＜0.001);X射线+Vel组大衰老细胞比例明显高于对照组(t=14.468,P＜0.001)、Vel组(t=14.371,P＜0.001)及X射线组(t=8.805,P=0.001).在SASP mRNA相对表达量方面,X射线及Veliparib的主效应与两者的交互效应均有统计学意义,X射线+Vel组p21、IFN-β、TNF-α、CCL5、CXCL9和CXCL10 mRNA的相对表达量最高,与对照组、Vel组、X射线组相比,差异均具有统计学意义,均P＜0.001;各细胞因子在联合处理后第4天出现表达高峰,随后下降;X射线+Vel组细胞上清液中TNF-α、IFN-β、IFN-γ的浓度最高,X射线+Vel组均明显高于对照组(P＜0.001)与X射线组,P＜0.001;流式分选出的衰老细胞较非衰老细胞p21、SASP表达水平更高,差异具有统计学意义,均P＜0.05.结论 X射线照射联合veliparib诱导4T1细胞衰老并导致其分泌表型发生明显变化,主要表现为免疫刺激的正向作用.     

sPD-1过表达增强衰老肿瘤细胞疫苗抗小鼠乳腺癌作用

目的探讨可溶性PD-1（sPD-1）过表达后对衰老肿瘤细胞疫苗（STCV）抗小鼠乳腺癌的增强作用。方法干扰素γ（IFN-γ） 刺激小鼠乳腺癌细胞4T1,流式细胞术检测PD-L1表达;sPD-1过表达慢病毒感染4T1,显微镜观察增强绿色荧光蛋白表达情况; CCK8实验比较4T1、4T1/sPD-1增殖活力;qRT-PCR、Western blot 从mRNA、蛋白质水平验证sPD-1表达;干扰素γ预处理4T1细 胞,添加4T1/sPD-1培养上清,孵育后流式细胞术检测PD-1阳性细胞比例;X射线照射联合Veliparib处理4T1、4T1/sPD-1细胞, 衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色,观察蓝染细胞比例;Balb/c小鼠右后腿皮下种植4T1,左后腿注射PBS、4T1 STCV、4T1/ sPD-1 STCV,观察各组小鼠成瘤率。结果IFN-γ能导致4T1细胞PD-L1上调（P<0.001）,且浓度越高,PD-L1表达上调越明显, 最高达（84.80±1.03）%;病毒感染4T1细胞后,显微镜下可见绿色荧光;CCK8实验中4T1、4T1/sPD-1细胞增殖曲线无明显差异 （P>0.05）;4T1/sPD-1细胞在mRNA和蛋白质上均可检测到sPD-1表达产物,4T1细胞则均未能检测到;干扰素γ预处理的4T1细 胞,PD-1阳性比例（6.893±0.271）%,添加4T1/sPD-1细胞培养液处理后,PD-1阳性细胞比例升高达（55.450±0.555）%（P<0.001）; 4T1、4T1/sPD-1在联合处理后,镜下见大量蓝染变形的衰老细胞;小鼠荷瘤实验中,预防肿瘤发生实验,PBS组所有小鼠出现肿 瘤生长,4T1 STCV组有28.787%小鼠未发生肿瘤,4T1/sPD-1 STCV组近55.556%小鼠未发现肿瘤发生;治疗肿瘤实验中,观察 期内PBS组小鼠均发生肿瘤,4T1 STCV、4T1/sPD-1 STCV组无瘤小鼠比例分别为11.111%和38.89%。结论衰老肿瘤细胞疫 苗对小鼠乳腺癌具有防治作用,且sPD-1过表达后能够增强衰老肿瘤细胞疫苗的抗肿瘤作用。     

过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞在肿瘤免疫微环境重建过程中抑制T细胞表面PD-1的表达

目的 探讨过表达IL-12的恶性黑色素瘤细胞B16对肿瘤免疫微环境重建过程中T细胞表面PD-1表达水平的影响。方法 利用慢病毒感染小鼠黑色素瘤细胞B16以构建稳定过表达IL-12的B16细胞株;利用qRT-PCR、ELISA检测IL-12的表达情况;通过平板细胞克隆形成实验验证转染病毒对B16细胞增殖能力的影响;利用ELISA检测B16/IL-12细胞在体内表达IL-12的能力;将健康的C57BL/6小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,14 d后用流式细胞术检测肿瘤引流区淋巴结中高表达PD-1的T细胞比例;利用650cGy剂量的放射线照射C57BL/6小鼠以构建免疫重建模型,并将造模后的小鼠随机分为2组,分别接种B16细胞及B16/IL-12细胞,将未接受放疗处理的小鼠作为对照组接种B16细胞,记录各组小鼠肿瘤生长情况,接种细胞14 d后用流式细胞术分别检测肿瘤引流区淋巴结以及肿瘤组织中PD-1+T细胞比例。结果 B16/IL-12细胞相比于B16细胞显著增加IL-12的表达（P<0.001）;转染IL-12过表达慢病毒并未对B16细胞增殖能力造成显著影响（P>0.05）;接种B16/IL-12细胞的何瘤小鼠在其肿瘤组织中含有更高水平的IL-12（P<0.01）;常规荷瘤小鼠模型中,B16/IL-12组小鼠较B16组小鼠具有更低比例的CD4+PD-1+T细胞（P<0.01）,而CD8+T细胞群中,PD-1表达水平差异不显著（P>0.05）;免疫重建小鼠模型中,接种B16细胞的小鼠肿瘤引流区淋巴结和肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞（P<0.05）及CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.01）均高于正常B16组小鼠,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠肿瘤引流区淋巴结及肿瘤组织中的CD4+PD-1+T细胞比例（P<0.01）和CD8+ PD-1+T细胞比例（P<0.001）相比于接种B16细胞的免疫重建小鼠均有显著降低;在小鼠肿瘤生长过程中,接种B16/IL-12细胞的免疫重建小鼠的肿瘤生长受到明显抑制（P<0.001）。结论 肿瘤区域过表达IL-12后可减少免疫重建过程中肿瘤区域T细胞表面PD-1 的表达,达到良好的肿瘤控制效果。     

C反应蛋白/白蛋白比率预测结直肠癌病人预后关系

目的 探讨初诊时C反应蛋白/白蛋白比率(CAR)与结直肠癌患者预后的关系,并与其他基于全身炎症反应的评分系统格拉斯哥预后评分(GPS)和中性粒细胞/淋巴细胞比率(NLR)进行比较.方法 收集2007年1月～2014年12月于南方医院确诊的原发新发且临床病理因素资料完整的结直肠癌病人163例,并对其预后进行回顾性分析.各个病理因素的最佳界值用受试者工作特征曲线分析;曲线下面积的测量和比较用De Long等确立的方法;分析初诊时CAR与临床病理因素的关系,分类变量组间对比采用x2检验,连续变量组间对比采用Mann-Whitney U检验;生存曲线比较采用Log-rank检验;单因素和多因素生存分析采用Cox比例风险回归模型.结果 CAR的最佳界值是0.132,CAR低组(CAR＜0.132)的中位生存时间为2157.0±395.3天,CAR高组(CAR≥0.132)的中位生存时间为1661.0±136.4天,组间比较P＜0.001.CAR、NLR和GPS的受试者工作特征曲线下面积分别为0.656、0.550和0.642,CAR相比NLR和GPS有更高的曲线下面积,对NLR和GPS评分后的病人采用CAR再次评估,部分病人得到相反的预后预测结果.单因素生存分析中,年龄、C反应蛋白、白蛋白、CAR、NLR、GPS、血小板计数、TMN分期、Dukes分期和化疗方式均与总生存时间相关(P＜0.05);多因素生存分析上述临床病理因素,显示TMN分期(Ⅰ～Ⅳ期,风险比HR=1.689,95％ CI:1.146-2.488,P=0.008)和Dukes分期(A/B/C,风险比HR=2.447,95％ CI:1.349-4.441,P=0.003)与总生存时间相关.结论 如以前报道的基于全身炎症反应的评分系统(GPS和NLR)一样,CAR也能有效预测结直肠癌病人的预后,且CAR能弥补这两种评分系统的不足.