负载自体肿瘤抗原的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞在乳腺癌的临床研究

目的：探讨负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞（DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后，对CIK体外肿瘤细胞杀伤活性的影响，进一步观察负载自身肿瘤裂解物的DC联合CIK治疗乳腺癌患者的临床免疫学疗效、毒副反应。方法：选择20例乳腺癌患者，分离外周血单个核细胞，其中贴壁细胞经GM—CSF和IL-4诱导产生DC，并负载自体肿瘤细胞裂解物；悬浮细胞经IFN-γ、IL-2、抗CD3单抗、IL-1α体外诱导产生CIK细胞。将负载抗原的DC与CIK共培养，观察CIK在体外对自身肿瘤细胞和乳腺癌细胞株SKBR-3的杀伤活性。此外，20例患者在切除原发病灶后，接受Ag—DC＋CIK细胞的过继免疫治疗，观察临床免疫疗效。结果：①CIK细胞培养后可见CD3^＋、CD8^＋和CD3^＋CD56^＋细胞较培养前显著增加；②将负载自身肿瘤抗原的DC与CIK共培养后，CIK的体外特异性和非特异性杀瘤活性明显提高；③细胞治疗后患者外周淋巴细胞Ag—NORs的IS值明显增高；CD3^＋、CD8^＋、CD56^＋升高；PBMC对自身肿瘤细胞的杀伤活性增强（P〈0．05）；④除一过性发热、畏寒外未见其它不良反应。结论：负载自体肿瘤细胞裂解物的DC疫苗联合CIK细胞在体外能明显增强对乳腺癌细胞的杀伤作用，亦能增强乳腺癌患者的细胞免疫功能，取得较理想的临床免疫疗效。     

抗原负载的树突细胞对细胞因子诱导的杀伤细胞的影响

目的：研究树突细胞(DC)负载不同形式的抗原对其成熟和功能的影响,及DC对细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)增殖和功能的影响。方法：外周血单个核细胞(PBMC)经不同细胞因子作用后培养成DC和CIK细胞,将Bel 7402细胞制备成肿瘤细胞冻融物、坏死肿瘤细胞及正常生长的肿瘤细胞,并作为不同状态的肿瘤抗原刺激DC,以流式细胞仪检测DC表面分子的表达。应用MTT法检测肿瘤抗原负载的DC刺激的CIK对肿瘤细胞的杀伤力。结果：负载肿瘤细胞冻融物的Dc其表面cDla、CD80、CD83、HLA-DR高表达,促进CIK增殖和杀伤力的功能最强;与正常肿瘤细胞共培养的DC细胞成熟程度受到抑制;负载Bel 7402抗原的DC刺激的CIK对Bel 7402有较强杀伤力,而对HerpG2杀伤力弱。结论：肿瘤细胞冻融物预刺激的DC成熟程度最高,诱导抗原特异性CIK细胞的功能最强,为临床DC瘤苗和CIK的应用提供了实验依据。     

抗原致敏的树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞对肝癌细胞杀伤活性的研究

目的：观察肝癌细胞抗原致敏的树突状细胞（Dendritic cells,DC）与细胞因子诱导的杀伤细胞（Cytokine-induced killer cells,CIK）共培养后的细胞增殖活性、表型的变化及其对肝癌细胞HepG2的杀伤活性。方法：采集健康供者的外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMNC）,常规诱导出DC、CIK,用肝癌细胞HepG2抗原冲击DC（Ag-DC）,并将其与CIK共培养（Ag-DC-CIK）,观察CIK和Ag-DC-CIK的细胞表型及增殖活性,并以肝癌细胞HepG2作为靶细胞,用MTT法检测CIK和Ag-DC-CIK的杀伤活性。结果：肝癌细胞抗原致敏的DC与CIK细胞共培养后,Ag-DC-CIK细胞群增殖活性明显增强,且高表达CD3+CD8+、CD3+CD56+双阳性细胞,其增殖活性和杀伤活性较单纯的CIK细胞更高（P<0.05）。结论：肿瘤抗原致敏的DC与CIK共培养获得的Ag-DC-CIK增殖活性和对肝癌细胞的杀伤活性显著高于CIK细胞。     

DC-CIK与CIK体外抗肿瘤作用的实验研究

目的探讨树突状细胞（Dc）与细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）共培养后对白血病细胞株K562、淋巴瘤细胞株Raji、肺癌细胞株A549、胃癌细胞株BOG-803的杀伤作用。方法采集健康志愿者外周血50mL,用淋巴细胞分离液分离单个核细胞,分别用不同的细胞因子诱导,培养D0细胞与CIK细胞。然后将成熟的DC和CIK细胞混合培养,用流式细胞仪检测两组细胞中。D3＋CD56＋、CD3＋CD8＋T细胞的比例;用MTT法检测其对K562、P-ajj、A549、BCG-803细胞株的杀伤活性。结果DC-CIK组较CIK组具有较高的CD3＋CD56＋、CD3＋CD8＋T细胞比例（p〈0．05）;DC—GIK、GIK对K562、Pajj、A549、BCG-803细胞株均具有较强的杀伤作用,且随着效靶比的增加,杀伤活性逐渐增加;DC—CIK的杀伤活性较CIK明显增高（P〈0．05）。结论DC—CIK共培养体外可增强对肿瘤细胞的杀伤作用,为肿瘤的临床治疗提供了理论和实验依据。     

抗原负载的树突状细胞介导的抗自身膀胱癌作用研究

目的:研究膀胱癌肿瘤细胞冻融抗原负载的树突状细胞(DC)对特异性抗自身膀胱癌作用研究。方法:将膀胱癌肿瘤病人外周血单个核细胞来源的DC在体外用冻融负载,再与膀胱癌患者的经细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)共同培养,应用乳酸脱氢酶释放法观察其对自身膀胱癌细胞杀伤活性,与未负载肿瘤抗原的CIK组进行比较。结果:DC经抗原负载后介导的CIK对自身膀胱癌细胞杀伤性活性明显增强。结论:用肿瘤抗原负载可进一步提高DC介导的CIK细胞对膀胱癌细胞的杀伤活性。     

DCIK细胞特异性抗肿瘤生物学活性研究

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)分别与两种冻融抗原致敏DC细胞共培养后获得的DC细胞诱导的特异性肿瘤杀伤细胞(dendritic cell induced killer.DCIK)的增殖活性及其对K562、Namalwa细胞株的杀伤活性。方法采集健康供者的外周血单个核细胞(PMNC),先诱导培养CIK细胞及两组DC细胞(K562-DC和Namalwa-DC),然后将两组DC细胞分别和CIK细胞按1∶10的比例分别混合培养,并以CIK细胞单独培养组为对照。计数细胞扩增倍数,并于共培养6d MTT法测定各组细胞对K562、Namalwa细胞杀伤活性。结果两组DCIK细胞增殖速度明显快于单纯CIK细胞组(P0.05);共培养6d,相同的效靶比情况下,两组DCIK细胞对两种肿瘤细胞的杀伤活性都比单纯CIK细胞明显增强,而用相应肿瘤抗原致敏得到的DCIK细胞对该种肿瘤细胞的杀伤活性最强。结论 DCIK细胞的增殖能力、抗肿瘤活性均高于CIK细胞,致敏的DCIK细胞对相同肿瘤靶细胞有杀伤特异性。     

WT1抗原负载的DC联合CIK对鼻咽癌细胞的体外杀伤活性研究

目的：探讨WT1抗原负载的树突状细胞（DC）诱导多种细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对鼻咽癌细胞（CNE）的体外杀伤效应。方法采用密度梯度离心法获取外周血单个核细胞,常规法诱导DC、CIK细胞;流式细胞技术分析测定细胞表型;MIT法分别测定在4个不同效靶比时CIK、DC＋CIK和WT1抗原负载的DC＋CIK三组效应细胞对鼻咽癌细胞（ CNE）的杀伤活性。结果在4个不同效靶比时WT1抗原负载的DC诱导CIK对鼻咽癌细胞的体外杀伤效应明显高于CIK、DC＋CIK。结论 WT1抗原负载的DC诱导CIK对鼻咽癌细胞（ CNE）的体外杀伤效应增强,为肿瘤临床生物免疫治疗提供了实验室基础。     

白介素-13受体α2抗原肽致敏的DC-CIK细胞对人胶质瘤U251细胞的杀伤效应

目的：观察人脑胶质母细胞瘤特异性抗原（IL-13Rα2）致敏的同源细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer,CIK）在体外对U251的细胞毒效应。方法：用密度梯度分离法获取HLA-A＊0201＋健康志愿者的人外周血树突状细胞（dendritic cells,DC）的前体细胞与淋巴细胞,并在体外诱导而获得成熟的DC细胞和CIK细胞。收获IL-13Rα2抗原负载的DC与CIK细胞共培养,使DC递呈肿瘤抗原予CIK细胞,并激活CIK细胞。激活的CIK细胞与U251细胞在96孔板内混合培养24 h后,以CCK-8试剂间接检测其对U251细胞杀伤率。结果：IL-13Rα2抗原肽成功负载DC,CIK细胞被负载抗原的DC激活并增殖;特异性抗原肽激活的CIK细胞对人胶质瘤U251细胞有杀伤效应（P〈0.01）。结论：IL-13Rα2抗原肽激活的CIK细胞对人胶质瘤U251细胞有杀伤效应。     

OK-432激活抗原负载的树突细胞对CIK细胞的作用

目的：探讨OK-432对人类外周血单个核细胞(PBMC)来源的树突状细胞(DC)体外培养的影响，及由此产生的DC对CIK细胞抗瘤效果的影响。方法：从PBMC中分离mCD14^ 的DC前体细胞，经粒细胞-单核细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素4(IL-4)的作用．得到不成熟DC，再予以负载肿瘤抗原及经促成熟因子(MPF)OK-432或LPS的刺激后得到成熟DC。同时将PBMC在细胞因子诱导下培养成细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)。通过对DC表面标志物的分析、经DC作用的CIK增殖活性、抗瘤效果的检测．研究了不同MPF对DC成熟和功能的影响。结果：OK-432可促进体外培养的DC高表达CDla、CD80、CD83、HLA—DR,其作用强于LPS；经OK-432作用的负载抗原的DC可促进CIK增殖、加强CIK的抗瘤效率。结论：OK-432可促进体外培养的DC成熟．并借此增强CIK的抗瘤作用。     

细胞因子诱导杀伤细胞与抗原特异性细胞因子诱导杀伤细胞杀伤肿瘤效应比较的实验研究

目的：制备具有抗原特异杀伤活性的效应细胞。方法：反复冻融法提取肿瘤可溶性抗原，甲基噻唑基四唑（methyl thiazoly terrazolium,MTT)法检测效应细胞杀伤活性。结果：经树突状细胞（dendritic cell,DC)摄取肿瘤细胞抗原，并提呈给细胞因子诱导杀伤（cytokine induced killer,CIK)细胞所获得的DC－A－CIK细胞对同一种肿瘤靶细胞的杀伤活性，较CIK细胞、未摄取抗原的DC－CIK细胞及摄取不相同肿瘤抗原的DC－A不相同－CIK细胞具有更高的杀伤活性。结论：摄取肿瘤可溶性抗原的DC细胞可明显提高CIK细胞对相同肿瘤靶细胞的杀伤特性性和杀伤活性。     

健康人和肿瘤患者CIK细胞的生物学特性

目的 比较健康人和肿瘤患者CIK（Cytokine—induced kiuer）细胞的体外扩增速度、细胞表型和杀伤活性,以期为临床应用中效应细胞的选择提供提供实验数据。方法健康人和肿瘤患者外周血各10例,经密度梯度离心获得单个核细胞（PBMC）,以干扰素-γ、CD3MAb、IL-2和IL-1为诱导剂制备CIK细胞,直接活细胞计数法比较两者的扩增速度。流式细胞杈检测比较两者细胞表型,MTT法比较两者对K562和LOVO细胞株的杀伤活性。结果健康人外周血CIK细胞的扩增速度、对K562和LOVO细胞株杀伤活性均显著高于肿瘤患者外周血CIK细胞,（P〈0．01）;流式细胞仪检测显示健康人外周血CIK细胞CD3^＋CD56^＋百分比显著高于肿瘤患者外周血CIK细胞,（P〈0．01）。结论健康人较肿瘤患者外周血CIK细胞体外扩增快,CD3^＋CD56^＋比例高,杀伤活性强。为临床应用CIK细胞进行过继性免疫治疗提供了实验依据。     

自体CIK细胞治疗恶性肿瘤免疫表型和杀伤活性变化

目的观察自体CIK细胞治疗恶性肿瘤前后免疫袁型和杀伤活性变化。方法采用流式细胞术检测50例肿瘤患者CIK细胞治疗前、后免疫表型的变化,采用3H—TdR释放法检测杀伤活性的变化。结果CIK治疗后,CD3^＋、CD4^＋细胞百分率上升,CD8^＋细胞百分率下调,CD4^＋／CD8^＋比值上升,CD19细胞百分率下降,与治疗前比较差异有统计学意义（P〈0．05）,但CD3^＋、CD4^＋、CD8^＋细胞绝对值未达到健康者水平（P〉0．05）。治疗后NK细胞百分率明显升高（P〈0．05）,达到健康者水平（P〉0．05）。在杀伤活性的研究中,与CIK细胞治疗前（19±6）％相比,治疗后杀伤活性百分率（22±5）％明显升高,达17．5％（P〈0．01）,但未达到健康者水平（P〈0．05）。结论自体CIK细胞治疗能明显提高肿瘤患者细胞免疫功能。     

CIK细胞与DC-CIK细胞抗肿瘤效应的对照研究

目的比较细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells,CIK）与树突状细胞（dendritic cells,DC）结合CIK细胞抗肿瘤效应。方法外周血单个核细胞诱导DC和CIK细胞,将DC与CIK共培养,以CIK细胞单独培养为对照。用MTT法测定杀伤活性,流式细胞术分析免疫表型,ELISA法测定干扰素-γ（IFN-γ）、白介素-12（IL-12）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的水平。结果 DC-CIK细胞增殖能力明显高于CIK细胞（P〈0.05）,DC-CIK细胞共培养后,CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋细胞比率较相同条件下CIK细胞组显著增多（P〈0.05）,共培养3 d,DC-CIK细胞上清液中IL-12、IFN-γ、TNF-α水平均比CIK细胞单独培养的水平高（P〈0.01）,DC-CIK细胞对白血病细胞与淋巴瘤细胞的杀伤率显著高于CIK细胞（P〈0.01）。结论 DC-CIK细胞比CIK细胞有更强的抗肿瘤效应。     

细胞因子诱导的杀伤细胞治疗急性白血病的研究进展

细胞因子诱导的杀伤（CIK）细胞是在体外用白细胞介素2、肿瘤坏死因子γ以及CD3单抗刺激外周血单个核细胞而获得的一组异质细胞群（CD3 ＋CD56 ＋）,其增殖能力和细胞毒活性都较高.其不但可逆转部分白血病细胞的多药耐药现象,还可能对G0期的瘤细胞有效.一些临床Ⅰ～Ⅱ期试验已经证实了CIK细胞治疗急性白血病的有效性和安全性.另外,临床上为进一步提高CIK细胞的疗效,还应用了一些辅助治疗方法（如白细胞介素2和树突状细胞等）.CIK细胞内在抗肿瘤的生物学机制与免疫系统的相互作用仍有待进一步研究,以期进一步提高治疗急性白血病的效果.     

半嵌合细胞因子诱导的杀伤细胞治疗晚期非小细胞肺癌的疗效

目的 观察半嵌合细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokines induced killer cells,CIK）治疗对中晚期非小细胞肺癌患者生存期的影响。方法 回顾性分析2010-2013年在解放军总医院接受治疗的47例中晚期非小细胞肺癌患者。其中观察组24例,对照组23例。观察组为经过半嵌合CIK细胞免疫治疗联合化疗方案的患者,对照组为仅采用化疗方案的患者,比较两治疗组的生存时间和免疫状态。结果 观察组治疗后外周血中总CD3^＋、CD3^＋CD56^＋、CD3^＋CD56^＋CD8^＋细胞百分比显著高于对照组（P〈0.001）;观察组中位无进展生存时间及1年生存率显著高于对照组（7.3个月vs 5.3个月,66.7%vs 41.4%）（P〈0.001）。结论 半嵌合CIK细胞联合化疗治疗非小细胞肺癌可以改善患者机体的免疫状况,有效延长患者生存时间。     

脐血来源CIK细胞的诱导及检测

目的探讨从脐血中大剂量制备CIK细胞的方法并检测其生物活性。方法利用Ficoll两步分离法分离获得脐血单个核细胞,细胞因子诱导分化扩增。光镜观察细胞形态,流式细胞仪检测培养物的免疫表型,MTT法检测其杀伤活性。结果CIK细胞经诱导后第4天细胞形态开始出现体积增大,胞核不规则,细胞数目增多,培养10 d后细胞数目成对数扩增,30 d后逐渐下降;免疫表型中以CD3~+、CD16+56~+细胞扩增最显著(P<0.01);第14天时CIK细胞对K562和Raji细胞株表现出强大的杀伤活性。结论细胞因子在体外可以大剂量培养脐血CIK细胞,扩增倍数高,杀伤活性强。     

DC疫苗联合CIK细胞治疗非小细胞肺癌疗效观察

目的探讨自体肿瘤抗原负载的树突状细胞（DC）联合细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）在非小细胞肺癌治疗中的临床疗效.方法采集70例非小细胞肺癌患者外周血单个核细胞,加入细胞因子定向诱导成CIK及DC,培养的第5天用自体肿瘤抗原（Ag）负载DC,第8天将DC与CIK细胞共培养,14d后将联合培养的细胞（Ag-DC-CIK）分次回输给患者.治疗4周后,流式细胞仪检测患者外周血T细胞亚群及细胞因子水平,以评价细胞免疫功能,结合临床指标综合评价疗效,同时观察不良反应;以35例单纯的CIK细胞治疗作为对照.结果（1）培养的第14天,Ag-DC-CIK细胞的增殖达（20.6±2.16）倍,对照组仅为（12.2±2.65）倍（P〈0.05）;CD3＋CD8＋细胞及CD3＋CD56＋细胞的表达也明显高于对照组（P〈0.05）;（2）70例接受治疗的患者中CD3、CD4、CD8T细胞的百分比均较治疗前有不同程度的提高,Ag-DC-CIK组57.14%（20例）的患者CD4/CD8比例调节至正常,与对照组（42.85%,15例）相比差异有统计学意义（P〈0.05）;（3）Ag-DC-CIK治疗后51.42%（18例）的患者Thl/Th2细胞因子比例恢复正常,而对照组恢复正常者仅占37.14%（13例）（P〈0.05）;（4）Ag-DC-CIK治疗组中Ⅱ、Ⅲ期患者的有效率分别为39.30%和28.60%,与对照组的相应期别（Ⅱ期26.90%,Ⅲ期22.20%）相比差异有统计学意义（P〈0.05）;（5）治疗后的副反应包括寒颤、发热及兴奋失眠,无1例出现毛细血管渗漏综合征及实质脏器的损害.结论肿瘤抗原负载的DC细胞可增强CIK细胞在非小细胞肺癌治疗中的临床疗效,有推广运用的价值.     

紫杉醇对人树突状细胞的生物活性的影响

目的 探讨常用化疗药物紫杉醇（TAX）对人树突状细胞（DC）生物活性的影响及作用机制,为化疗联合生物免疫治疗抗肿瘤提供理论基础.方法 体外实验：分别在紫杉醇5 ng/mL（b组）、10 ng/mL（c组）、20 ng/mL（d组）、40 ng/mL（e组）的浓度下及不加紫杉醇的条件下（a组）培养DC细胞,检测各组DC细胞的存活率、细胞成熟标志物及细胞因子分泌量,探究紫杉醇对人树突状细胞生物活性的影响,同时通过乳酸脱氢酶释放法（LDH）测定与紫杉醇处理的树突细胞共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）对肺癌A549细胞株的杀伤作用,测定紫杉醇对树突细胞抗原呈递作用的影响.体内实验：采用人肺癌细胞株A549的肿瘤组织块,皮下接种于裸鼠腋下,建立裸鼠肺癌模型.2d后将30只裸鼠随机分成5组,分别为A组（对照组）：细胞株A549＋盐水（NS）;B组：细胞株A549＋DC＋CIK;C组：细胞株A549＋CIK＋TAX;D组：细胞株A549＋TAX;E组：细胞株A549＋TAX＋DC＋CIK.每3天检测1次肿瘤大小、裸鼠存活时间.结果 体外实验：在共培养6d的前提下,b、c组第6天存活率与第0天存活率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）,d、e组第6天存活率与第0天存活率比较,差异有高度统计学意义（P＜0.01）,e组存活率仅为17.5％.c组和e组CD86、CD40、MHCⅡ的表达以及IL-12的分泌与正常组相比有显著增加（P＜0.05）,d组除了CD86,其他检测指标较正常组差异均有统计学意义,b组中只有MHCⅡ较正常组差异有统计学意义,经10 ng/mL紫杉醇处理的细胞在效靶比5∶1和10∶1的情况下,杀伤效果明显高于未经紫杉醇处理的细胞.其中紫杉醇处理组的细胞在效靶比为10∶1的情况下,杀伤活性已经到达（91.37±5.24）％.体内实验：B、C、D、E组的平均存活时间分别为33.0、34.0、31.8、41.8 d,明显高于对照A组（23.8 d）（P＜ 0.05）.E组平均存活时间大于41.8 d,明显高于B、C、D组（P＜ 0.01）,其中E组中,45 d仍有3只存活,D组在前25 d体现出较好的治疗效果,但是25 d后瘤体增长速度增加,与B组差异无统计学意义.结论 低中浓度的紫杉醇可促进树突状细胞的成熟并提高其抗原呈递能力.高浓度紫杉醇可杀死树突状细胞,抑制其免疫活性.中浓度紫杉醇能促进树突状细胞分泌白介素12.紫杉醇、DC、CIK联合应用可提高荷瘤裸鼠生存时间.     

CIK细胞在肿瘤免疫治疗中的作用

目的研究细胞因子诱导的杀伤细胞（CIKcells）的体外扩增特性及其在抗肿瘤免疫治疗中的作用。方法通过提取健康供血者的PBMNC,培养诱导CIK细胞,显微镜下观察其扩增倍数、增殖速率,流式细胞仪分析细胞免疫表型,用MTT法观察其对K562细胞的体外杀伤效应,并通过流式细胞仪进一步分析30例实体瘤患者CIK细胞输注前后外周血免疫活性细胞表型的改变。结果经2周培养,CIK细胞平均增加了30倍,总数达（4.8～5.0）×109,活性细胞比例〉90%;体外杀伤率约50%,表型检测效应细胞CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋、CD3＋CD56＋亚群比例显著升高,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。实体瘤患者CIK细胞输注后外周血中免疫活性细胞比例也明显升高,差异也有统计学意义（P〈0.05）。结论CIK细胞在体内外能明显抑制肿瘤生长,有效改善患者的免疫功能,为晚期肿瘤治疗提供了新的方法。