67 kDa LN-R反义寡核苷酸对卵巢癌细胞生物学行为的影响

目的：探讨转染67 kDa层粘连蛋白受体（67 kDa laminin receptor,67 kDa LN-R）反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide,ASODN）后卵巢癌细胞HRA的生物学行为变化.方法：合成67 kDa LN-R反义及正义寡核苷酸片段（sense oligonucleotide SODN）,设定反义组、正义组及对照组并分别转染卵巢癌细胞HRA;采用形态学观察、MTT、流式检测各组细胞生长情况;免疫组化检测各组细胞67 kDa LN-R蛋白表达：Transwell小室法检测67 kDa LN-R反义寡核苷酸对卵巢癌细胞体外侵袭转移能力的影响.结果：转染24～48 h内细胞增殖受到不同程度抑制,48 h后细胞生长状态有所恢复.0.02、0.04、0.08μg/μlASODN处理24 h后细胞凋亡率分别为19.38%、21.62%、30.35%,差异有统计学意义（P＜0.05）.转染反义寡核苷酸组67 kDa LN-R的表达逐渐减少,且下调作用与ASODN浓度呈剂量依赖性,与正义组及对照组相比差异有显著性（P＜0.05）;转染后HRA穿透人工基底膜的能力显著降低并呈现剂量依赖性（P＜0.05）.结论：67 kDa LN-R ASODN可下调卵巢癌细胞HRA67 kDa LN-R表达并降低其体外侵袭转移能力.     

胆管癌细胞层粘连蛋白受体表达下调对蛋白水解酶尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶mRNA表达的影响

目的　研究层粘连蛋白受体 (LNR)反义寡核苷酸硫代修饰片段 (AS OD)对人胆管癌QBC939细胞尿激酶型纤维蛋白溶解酶原激酶 (u PA)基因表达的调节。方法　应用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)分析浓度 12 μmol/L的LNRAS OD在作用 4 8h后对QBC939细胞u PAmRNA表达水平的影响。结果　LNRAS OD能明显抑制人胆管癌细胞表达u PA ,与正常对照相比 ,其u PAmRNA水平下降了 30 0 % (P <0 0 5 )。结论　胆管癌细胞u PA基因表达水平与层粘连蛋白受体的表达水平明显相关 ,抑制层粘连蛋白受体的表达能够使胆管癌细胞u PA基因表达下降 ,提示层粘连蛋白受体在介导胆管癌转移中发挥重要作用     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作佑

目的探讨葡萄糖调节蛋白78(GRP78)在乳腺癌细胞(231)侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体,转染入231细胞,利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况;并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞;反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因,下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭及转移中的作用

目的探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法构建GRP78真核反义表达载体，转染入231细胞，利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况；并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞；反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论GRP78是乳腺癌的一个促癌基因，下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

葡萄糖调节蛋白78在乳腺癌细胞侵袭、转移的作用

目的 探讨葡萄糖调节蛋白78（GRP78）在乳腺癌细胞（231）侵袭、转移过程所起的作用。方法 构建GRP78真核反义表达载体，转染入231细胞，利用PCR和蛋白印迹方法检测转染有反义GRP78的231细胞和MCF-7细胞的GRP78表达情况；并用伤口愈合实验和体外侵袭实验证验转染细胞转移和侵袭的变化。结果 转染反义GRP78的231细胞内GRP78RNA和蛋白表达明显低于未转染细胞；反义GRP78基因对乳腺癌细胞231细胞的侵袭和转移有抑制作用。结论 GRP78是乳腺癌的一个促癌基因，下调GRP78基因表达能明显抑制乳腺癌细胞的侵袭和转移能力。GRP78为乳腺癌基因治疗的一个新靶点。     

VEGF-C反义寡核苷酸对卵巢癌细胞SKOV3的黏附、侵袭能力的影响

目的:探讨VEGF-C反义寡核苷酸(VEGF-C,ASODN)对人卵巢癌细胞SKOV3黏附、侵袭能力的影响.方法:以VEGF-C基因编码区为靶点合成反义寡核苷酸,脂质体介导转染.MTT法检测卵巢癌细胞与细胞外基质黏附能力;利用transwell小室,检测卵巢癌细胞侵袭人工基底膜的能力;免疫组化法检测细胞中VEGF-C蛋白表达,western blot检测细胞中MMP-2蛋白表达.结果:与空白对照组及正义序列转染组相比,ASODN组对细胞外基质黏附率明显降低(P＜0.01),穿透重组基质膜数目明显下降(P＜0.01),细胞中VEGF-C、MMP-2蛋白表达明显下降(P＜0.01).结论:VEGF-C ASODN可明显抑制卵巢癌细胞体外实验中的黏附和侵袭能力,下调MMP-2的表达可能是其作用途径.     

miR-197靶向调节CD82对结肠癌细胞侵袭转移的影响

【摘要】 目的 探讨下调microRNA-197 (miR-197)对结肠癌HCT116细胞侵袭转移能力的影响及其作用机制。方法 将对数生长期HCT 116细胞随机分为miR-197反义寡核苷酸（inhibitor）组、无义序列阴性对照（NC）组、空白对照（Mock）组,采用脂质体介导转染法,将miR-197反义寡核苷酸（miR 197 inhibitor）转染HCT116细胞。运用荧光定量PCR (qRT-PCR)检测miR-197的表达水平;通过生物信息学预测miR-197靶基因,应用Western blot法检测CD82蛋白的表达;采用transwell小室实验检测HCT116细胞的侵袭、迁移能力的改变。结果 miR-197反义寡核苷酸转染HCT116细胞后,inhibitor组miR-197的表达较NC组和Mock组明显降低(P＜0.05);下调miR-197的表达后,inhibitor组的CD82蛋白表达较其余两组显著增加(P＜0.05);转染miR-197反义寡核苷酸的HCT116细胞的侵袭与迁移能力inhibitor组较NC组、Mock组均降低 (P＜0.05)。结论 下调结肠癌HCT116细胞中miR-197的表达能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移,其机制可能与其靶点CD82表达增加有关,这将为结肠癌的治疗提供新的靶点。     

反义寡核苷酸抑制整合素αv亚基表达对喉癌细胞侵袭和增殖的影响

目的应用反义寡核苷酸体外细胞转染技术抑制喉癌细胞整合素αv(integrin αv,ITGAV)表达,探讨ITGAV表达抑制对喉鳞癌Hep-2细胞侵袭和增殖能力的影响。方法设计合成特异性靶向整合素αv的反义寡核苷酸序列(antisense oligonucleotides sequence,ASONs),用阳离子脂质体包被并转染喉鳞癌Hep-2细胞,免疫荧光技术检测转染前后整合素αv亚基的蛋白表达,MTT法检测转染后Hep-2细胞的增殖情况,Boyden小室法检测转染前后喉癌细胞的侵袭能力。结果靶向整合素αv的ASONs对喉鳞癌细胞株的侵袭和增殖能力具有明显的抑制作用,并具有剂量-时间依从性。结论靶向整合素αv的ASONs能够抑制喉鳞癌细胞株生长,并使其侵袭能力减弱,整合素αv可能成为喉鳞癌基因治疗的新靶点。     

逆转录病毒介导shRNA抑制Mig-7基因对人肝癌细胞血管生成拟态及体外侵袭转移的抑制作用

目的探讨逆转录病毒介导的短发夹RNA（shRNA）干扰迁移诱导基因7（Mig-7）对肝细胞癌（HCC）细胞血管生成拟态 （VM）形成及体外侵袭转移能力的影响。方法设计2条Mig-7 mRNA寡核苷酸序列（Mig-7 shRNA-1,Mig-7 shRNA-2）和1条 作为负对照的无关序列（Mig-7 shRNA-N）。构建Mig-7shRNA 逆转录病毒表达载体质粒,并将要接受转染的人肝癌细胞 MHCC-97H分为6组：转染Mig-7 shRNA-1组;转染Mig-7 shRNA-2组;转染Mig-7 shRNA-N组;转染空载质粒组（Vector）;重 组人血管内皮抑素（ES,商品名：恩度）组;MHCC-97H细胞对照组（Control）。半定量PCR、Western blot检测其对Mig-7表达的 影响;三维细胞培养观察其对VM形成的影响;细胞间粘附实验、Transwell侵袭实验及迁移实验观察其对细胞粘附、侵袭及迁移 能力的影响。结果转染后,Mig-7 shRNA-1组与Mig-7 shRNA-2组中Mig-7 mRNA与蛋白的表达、MHCC-97H细胞形成VM 能力、细胞侵袭、迁移能力明显减低（P<0.05）,细胞间粘附能力明显增加（P<0.05）;Mig-7 shRNA-N 组、Vector 组、ES 组中 MHCC-97H细胞Mig-7的表达、VM形成、细胞间粘附、迁移、侵袭能力较MHCC-97H细胞组均无明显变化。结论逆转录病毒 介导的shRNA能够有效下调Mig-7的表达并明显抑制HCC细胞VM形成能力及侵袭转移能力,增加细胞间的粘附作用;ES对 HCC细胞的Mig-7表达、VM形成、侵袭转移及粘附能力无明显影响。     

VEGF—C对胰腺癌细胞凋亡影响的实验研究

目的研究VEGF—C对胰腺癌细胞凋亡的影响。方法建立人胰腺癌细胞株PANC-1裸鼠原位种植瘤模型,原代培养原发和淋巴结转移灶中胰腺癌细胞,通过VEGF—C反义寡核苷酸体外转染抑制其表达,应用RT—PCR及流式细胞术等方法研究对淋巴结转移胰腺癌细胞凋亡及bcl-2的影响。结果体外转染后,原代培养原发和淋巴结转移灶中PANC-1胰腺癌细胞VEGF—C的mRNA表达水平显著降低（P〈0．01）。体外转染VEGF—C反义寡核苷酸抑制其表达后,对照组、SODN组、ASODN组淋巴结转移胰腺癌细胞的凋亡率为（2．83±1．01）％、（4．98±2．05）％、（13．22±2．17）％,ASODN组细胞凋亡率显著提高（P〈0．01）,而原发灶胰腺癌细胞的凋亡率分别为（3．51±1．38）％、（4．79±2．16）％、（5．33±2．18）％,凋亡率无明显影响（P〉0．05）;淋巴结转移胰腺癌细胞的反义组bcl-2表达水平明显下调（P〈0．05）,而原发灶胰腺癌细胞bcl-2表达水平无明显变化（P〉0．05）。结论抑制淋巴结转移灶中胰腺癌细胞VEGF—C的高表达可促进胰腺癌细胞凋亡,这和bcl-2表达下调有关;但对原发灶胰腺癌细胞无明显影响。     

PPAR-γ在肝门部胆管癌中的表达及其配体激活后对胆管癌细胞的作用

目的 探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）在人类肝门部胆管癌细胞系QBC939中的表达及经其配体吡格列酮（pioglitazone）激活后对QBC939细胞生长的影响。方法 培养QBC939细胞并分别加入不同浓度的吡格列酮进行干预培养，通过RT—PCR检测QBC939中PPAR—γmRNA的表达；光镜下细胞计数了解吡格列酮干预后对细胞增殖的作用；流式细胞技术了解吡格列酮对QBC939细胞周期及凋亡的影响。结果 QBC939中有PPAR—γmRNA表达；PPAR-γ经其配体激活后明显抑制细胞增殖，使细胞周期出现G2／M期停滞，并诱导细胞凋亡。结论 PPAR-γ经其配体激活后通过抑制细胞增殖及促使细胞周期G2／M期停滞而抑制细胞的生长，且诱导细胞凋亡的发生。因此PPAR-γ有可能成为胆管癌治疗的新的分子靶点。     

吡格列酮对肝门部胆管癌QBC939细胞增殖、凋亡和侵袭力的影响

目的：探讨过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）配体吡格列酮（pioglitazone,PGZ）对胆管癌细胞增殖、凋亡和体外侵袭力的影响．方法：体外培养人肝门胆管癌QBC939细胞;采用流式细胞技术与TUNEL酶标记法检测PGZ对QBC939细胞增殖和凋亡的影响．通过Matrigel侵袭实验和过河实验检测PGZ对QBC939细胞体外侵袭力和运动能力的影响．结果：流式细胞仪分析显示,PGZ能明显抑制QBC939细胞增殖,使其停滞于G2／M期,促使诱导细胞凋亡;TUNEL酶标记显示凋亡的QBC939细胞出现凋亡小体;Matrigel侵袭实验和过河实验显示,随着PGZ浓度的增加,透过Matrigel膜的细胞数减少,过河时间延长（P〈0．01）,呈剂量一效应关系．结论：PGZ能明显抑制QBC939细胞增殖,诱导细胞凋亡,对QBC939细胞的体外侵袭力有明显的抑制作用．PPAR-γ配体PGZ有望成为治疗胆管癌新的切入点．     

转染反义寡核苷酸对人胆管癌QBC939细胞XIAP基因表达及细胞周期作用的实验研究

目的研究转染反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucleotide,ASODN）对人胆管癌细胞株QBC939细胞凋亡抑制蛋白基因（X-linked inhibitor of apoptosisprotein,XIAP）表达的抑制作用及对细胞周期凋亡的影响．方法脂质体介导ASODN瞬时转染QBC939细胞,荧光显微镜观察ASODN转染入细胞的情况,并计算转染率;RT—PCR检测转染前后XIAPmRNA表达的变化;流式细胞仪检测转染后细胞周期的变化和凋亡率．结果转染后24h可达到最佳的转染效果;ASODN组的XIAP基因水平明显低于对照组（P〈0．05）,流式结果显示转染后QBC939G0／G1期细胞高于阴性对照组,凋亡率高于对照组（P〈0．05）．结论脂质体介导转染ASODN能特异性地抑制QBC939细胞中的XIAP基因表达,使其发生G0／G1期阻滞,并诱导胆管癌细胞凋亡,有望成为胆管癌基因治疗新的靶点．     

腹膜浸润筛选模型体外筛选胆管癌细胞不同转移性亚群

目的　探讨以腹膜为载体用于体外细胞筛选的可行性。方法　利用经处理后的脏层腹膜 ,分离筛选胆管癌细胞不同转移性亚群 ,并以体外侵袭实验验证所筛选出的不同转移性亚群细胞间侵袭能力的差别。结果　以腹膜为筛选介质 ,成功地筛选出胆管癌细胞高、低转移性亚群 ,两亚群细胞间在粘附、迁移能力上均存在着显著的差别 (P <0 0 5 )。结论　腹膜浸润筛选模型用于细胞筛选可行、有效。     

脂质体介导Bcl-2反义寡核苷酸对胆管癌细胞株QBC939的作用

目的：观察Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ASODN）对人胆管癌QBC939细胞的作用及对Bcl-2蛋白表达的影响。方法：脂质体LipofectamineTM2000介导Bcl-2 ASODN转染QBC939细胞,应用台盼篮拒染实验检测细胞存活率、克隆形成实验检测克隆形成率、Western blot检测Bcl-2蛋白表达。结果：Bcl-2 ASODN转染后Bcl-2蛋白免疫印迹条带光密度显著低于对照组（P<0.01）;台盼篮拒染实验和克隆形成实验均显示Bcl-2 ASODN可以部分抑制QBC939细胞增殖,经ASODN作用,细胞的存活率和克隆形成率均显著低于对照组（P<0.05）。结论：Bcl-2 ASODN通过封闭人胆管癌QBC939细胞bcl-2基因表达抑制人胆管癌QBC939细胞的增殖。     

Effect of ligand pioglitazone activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro and the expression regulation of related genes]

OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of ligand pioglitazone (PGZ) activating PPAR-gamma on the invasiveness of cholangiocarcinoma cell in vitro. METHODS: Human hilar cholangiocarcinoma cell line QBC939 was selected and cultured in vitro for this research. The rate of QBC939 cell growth inhibition was detected by MTT, and the influence of PGZ on the expression of MMP-7 mRNA and TIMP-1 mRNA was measured by using FQ-PCR. The in vitro invasiveness and mobility of QBC939 were quantified by Matrigel invasion assay and crossing-river test. RESULTS: Among the low concentration (5 micromol/L-40 micromol/L) groups at the point of 12-hours, PGZ did not show to inhibit significantly the growth of QBC939 cells (P>0. 05). However, the PGZ could down-regulate the expression of MMP-7 mRNA in QBC939 cells (P<0. 01), and up-regulate the TIMP-1 mRNA expression to be without obvious statistics significance (P>0. 05). At last, PGZ could reduce the number of QBC939 cell breaking through the matrigel and prolonging the time of crossing-river significantly (P< 0. 01) in a dose-dependent manner. CONCLUSION: For ligand PGZ to activate PPAR-gamma can inhibit the invasiveness of QBC939 cells in vitro via regulating the expression of MMP-7 and the mobility of QBC939 cells probably.     

5-氮-2′-脱氧胞苷对胆管癌细胞株生长周期及凋亡的影响

目的 研究甲基化抑制剂5-氮-2’-脱氧胞苷对胆管癌细胞株生长周期及凋亡的影响,初步探讨其应用于临床治疗的可能性。方法 应用MTT法检测不同浓度的5-氮-2’-脱氧胞苷对胆管癌细胞株QBC939存活率的影响,应用流式细胞术检测5-氮-2’-脱氧胞苷对QBC939细胞生长周期及凋亡率的影响。结果 5-氮-2’-脱氧胞苷在浓度为0.5μmol/L时即可以抑制胆管癌细胞QBC939的增殖,24 h半数致死量为5.0 μmol/L,细胞周期中处于G0/G1期的细胞比例增多,凋亡的发生率增高,而且以上作用与药物浓度及作用时间在一定范围内呈正相关。结论 5-氮-2’-脱氧胞苷可能通过消除某些抑癌基因的启动子甲基化状态,使其重新表达而抑制胆管癌细胞的生长,并促进其凋亡。     

腺病毒介导的p53和顺铂的联合应用对胆管癌细胞系QBC939的生长抑制作用

目的：研究ｐ５３基因和顺铂联合应用对胆管癌细胞的作用。方法：将重组体腺病毒ｐ５３和顺铂联合作用于人胆管癌细胞ＱＢＣ９３９，对ｐ５３基因的表达、细胞的生长抑制及机制进行分析。结果：用Ａｄ－ＬａｃＺ进行复组腺病毒转导效率的检测，发现当ＭＯＩ为１００以上时，重组腺病毒可使９０％以上的培养的人胆管癌ＱＢＣ９３９细胞被传导，用ＲＴ－ＰＣＲ方法，在胆管癌ＱＢＣ３９细胞系中ｐ５３无表达。重组体腺病毒能介导外源基     

RRM2在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达和意义

目的:探讨核糖核苷酸还原酶M2(RRM2)在人胆管癌组织及胆管癌细胞系中的表达、分布以及生物学意义。方法:采用免疫组织化学技术(SP法)检测RRM2基因和蛋白在40例胆管癌标本、40例癌旁胆管组织以及10例正常胆管组织标本中的表达;同时采用RT-PCR法及Western blot法分别检测了RRM2基因mRNA及其蛋白在人胆管癌细胞系QBC939以及人正常胆管上皮细胞系HIBEC中的表达。结果:RRM2基因蛋白在胆管癌组织中表达阳性率为72.5%,而在癌旁胆管组织和正常胆管组织中未能检测到RRM2表达。在人胆管癌细胞系QBC939中,RRM2的mRNA及蛋白均特异性表达,而在正常人胆管上皮细胞系HIBEC中未见RRM2的表达。结论:RRM2在人类胆管癌组织和胆管癌细胞系中选择性高表达,可能与胆管癌的发生、发展密切相关。