人源抗Met基因工程抗体scFv的改造与特性分析

目的:将已制备的抗Met单链抗体基因与人IgG Fc基因片段融合,表达有活性的融合蛋白分子,以增强单链抗体的可溶性.方法:从人淋巴细胞提取总RNA,经RT-PCR扩增并制备人IgG的Fc基因片段,并克隆于已构建好的pBAD-scFv原核表达载体中,转化大肠杆菌Top10,经阿拉伯糖诱导表达融合蛋白scFv-Fc.所表达的可溶性蛋白经亲和层析纯化、SDS-PAGE、Western blot分析鉴定,并用ELISA检测抗体效价.结果:序列分析表明重组质粒pBAD-scFv-Fc基因序列正确;SDS-PAGE分析表明,scFv-Fc融合蛋白分子量为60 ku,且为可溶性蛋白;该蛋白经过His亲和层析纯化、ELISA检测,结果表明,该融合蛋白能够与抗原分子Met特异性结合.结论:改造后的抗体融合蛋白scFv-Fc能与人Met特异性结合,增加了抗体蛋白溶解度,有利于抗体的大量制备.     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

人血清脂联素定量ELISA检测方法的建立及初步临床应用

目的:建立一种检测人血清中脂联素(APN)的酶联免疫吸附方法(ELISA),并初步探讨其在冠心病诊断中的应用。方法:构建表达质粒pET22b(+)/gAPN,在原核表达系统大肠杆菌中表达并纯化重组脂联素球状区(gAPN)蛋白。用抗APN单克隆抗体MAB10651包被微孔板,10%小牛血清作为封闭液,针对APN不同抗原表位的单克隆抗体MAB1065生物素化后作为标记抗体,联合生物素-亲和素信号放大系统,以gAPN重组蛋白为标准品绘制标准曲线,以准确性、特异性、重复性、回收率试验和方法对比试验评价ELISA方法。检测161例冠心病患者血清APN水平并结合冠状动脉造影结果和Gensini积分系统,探讨血清APN水平与冠心病的关系。结果:利用基因克隆技术成功构建了pET22b(+)/gAPN质粒,获得了相对分子质量约15 000的重组gAPN蛋白,产量较高(1.57 mg),纯度>90%,并以此为标准品初步建立了检测人血清APN的定量ELISA方法。该法具有良好的准确性和重复性,灵敏度达150 pg/ml,回收率为91.0%~108.0%,与深圳依诺金生物科技有限公司进口分装的ELISA试剂盒对照比较有良好的相关性(r=0.935,P<0.001)。临床检测表明冠心病组血清APN水平明显低于非冠心病组(P<0.01),且血清APN水平随冠状动脉狭窄程度的加重呈进行性下降趋势。结论:本实验成功建立了一种简便快速检测人血清APN的ELISA方法,对诊断冠心病有临床应用价值,为国内APN诊断试剂盒的研制和开发提供了科学实验依据。     

wCTLA-4胞外段与HBc融合DNA疫苗的构建和真核表达

目的构建土拨鼠细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白-4（wCTLA-4）细胞外部分和人乙型肝炎病毒核衣壳（HBe）融合蛋白表达质粒pwCTLA-4-HBe并在真核细胞中表达。方法通过限制性酶切和T14连接，以HBc基因片段置换pwCTLA-4-WHc质粒中的WHc片段，得到质粒pwCTLA-4-HBc，分别转染幼仓鼠肾细胞系（BHK）和人宫颈癌细胞系（Hela），间接免疫荧光和化学发光免疫法检测融合蛋白的表达。结果融合蛋白编码质粒转染BHK细胞后可检测到HBc抗原免疫荧光，转染Hela细胞后细胞裂解液和培养上清中均可检测到融合蛋白。结论成功构建wCTLA-4胞外段和HBc融合蛋白表达质粒pwCTLA-4-HBe，融合蛋白可以在真核细胞表达并分泌到细胞外。     

双抗体间接夹心ELISA法检测血清MUC1蛋白方法的建立及其在肺癌诊断中的应用

目的:建立双抗体间接夹心酶联免疫吸附法（ELISA）试剂盒,检测血清黏蛋
白1（MUC1）水平,探讨其在肺癌诊断中的应用,阐明血清MUC1蛋白检测的临床应用
价值。方法:在前期制备的MUC1蛋白和兔抗人MUC1多克隆抗体的基础上,建立以鼠抗人MUC1
单克隆抗体为包被抗体,兔抗人MUC1多克隆抗体为检测抗体的双抗体间接夹心ELISA方法,
并通过对MUC1蛋白标准品的检测,绘制出标准曲线。临床上收集48例肺癌患者、7例肺良性
疾病患者和20例健康人的血清,应用本研究建立的ELISA方法检测各组标本血清MUC1蛋白表
达水平,绘制ROC曲线,确定最佳cut-off值,得出双抗体间接夹心ELISA方法检测肺癌的敏
感度、特异度及约登指数。同时与临床应用的CA15-3试剂盒检测结果进行比较。结果:应用双抗体间接夹心ELISA法确定血清MUC1的临界值为1.98 μg?L-1,检测
肺癌的敏感度为62.5%,特异度为100%,约登指数为0.625　0。CA15-3试剂盒检测肺癌的敏感度
为18.75%,特异度为100%,约登指数为0.187 5。结论:建立的双抗体间接夹心ELISA
试剂盒检测肺癌有更高的敏感度和特异度,优于临床常用的CA15-3试剂盒。     

重组人EGF-IL-18融合蛋白直接竞争ELISA方法的建立

目的：建立检测给药食蟹猴血清中重组人表皮生长因子-白介素-18 （rhEGF-IL-18）融合蛋白含量的直接竞争ELISA方法,为该融合蛋白的动力学研究提供方法学.方法：用棋盘法确定包被抗体和酶标抗原工作浓度,建立直接竞争ELISA方法,并对其进行方法学评价.结果：包被抗体和酶标抗原的最适工作浓度为4 μg/mL和1∶1 000.建立的标准曲线的曲线范围为100～ 900 ng/mL,R2为0.9898;日内精密度和日间精密度的最大变异系数分别为2.42％和2.20％;回收率95.3％ ～103.0％;样品在室温放置1 h、冻融2次和冻存20 d三种条件下检测结果均较稳定,相对标准差均小于15％;定量下限为20.0 ng/mL.结论：本研究建立的ELISA方法稳定且可行.     

人巨细胞病毒US31蛋白特异性抗体的制备及鉴定

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）US31蛋白及其多克隆抗体的制备及鉴定方法。方法：HCMV US31基因经原核密码子优化后进行全基因合成,克隆至pET21a（+）原核表达载体,构建pET21a（+）/HCMV US31重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导目的蛋白表达,Ni-NTA亲和层析法纯化US31蛋白,免疫新西兰兔制备多克隆抗体,ELISA、Western blot及免疫荧光方法检测抗体效价和特异性。结果：在大肠杆菌中诱导出高表达的HCMV US31融合蛋白,经Ni-NTA亲和纯化后获得高纯度的目的蛋白;免疫新西兰兔诱导产生特异性的IgG抗体,效价为1:49 600;经ELISA、Western blot以及免疫荧光均证实制备的特异性抗体可识别细胞中表达的US31蛋白。结论：成功制备了HCMV US31蛋白及特异性抗体,为进一步研究US31蛋白的生物学功能奠定了基础。     

人白细胞介素10 cDNA重组质粒在细胞和大鼠体内的转染和表达

目的研究人白细胞介素10（hIL-10）cDNA重组质粒的转染和表达,为以后的基因治疗研究奠定基础。方法构建hIL-10 cDNA真核表达重组质粒pcDNA3-hIL-10后进行酶切和测序鉴定。以SA脂质体介导对照质粒pcDNA3及重组质粒pcDNA3-hIL-10转染COS7细胞和SD大鼠,用ELISA方法检测COS7细胞培养液及大鼠胰腺、肺和肝脏组织中hIL-10的含量。结果用pcDNA3-hIL-10质粒转染COS7细胞48 h后,在培养液中检测到hIL-10蛋白浓度为38 000 pg／mL,而对照组仅为55 pg／mL。hIL-10基因转染24 h后大鼠胰腺、肺和肝脏组织hIL-10的产生量达到峰值,以后逐渐下降,至96 h仍显著高于对照组（P〈0．05）,1周后降至正常水平。结论本研究构建的pcDNA3-hIL-10重组质粒可以在真核细胞及大鼠体内高效表达。     

人NT-proBNP的高效原核表达及免疫学检测标准品的研究

目的 构建人NT-proBNP(氨基末端脑钠肽,amino.terminal pro-brain natriuretic peptide)的高效原核表达载体,建立重组NT-proBNP纯化工艺,制备NT-proBNP免疫学检测工作标准品.方法 采用人工合成和套叠(GeneSOEing)PCR技术相结合的方式对NT-proBNP基因序列进行密码子进行偏嗜性改造后克隆入原核表达质粒pET32a和pET42a构建不同形式的NT-proBNP原核表达重组质粒;采用离子交换、HIS和GST亲和层析柱以及肠激酶(EK酶)酶切等方法建立NT-proBNP重组蛋白的纯化工艺;用Roche公司NT-proBNP检测试剂盒测定所制备的标准品的免疫活性和稳定性.结果 pET32a和pET42a构建的不同形式NT-proBNP原核表达质粒在BL21(DE3)均实现了高效可溶性表达,通过多种纯化方案制备了纯度达98.3%的NT-proBNP-83重组蛋白,经测定具有良好免疫活性和稳定性,适合用于免疫学检测工作标准品.结论 成功构建了人NT-proBN的高效原核表达载体,筛选出较适合用于免疫学检测工作标准品的NT-proBNP重组蛋白.     

肠道病毒71型VP1基因的表达纯化及初步应用

摘　要：目的 表达纯化肠道病毒71型（EV71）VP1蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA检测方法。方法 通过化学法合成肠道病毒EV71型VP1全基因序列,构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,转化大肠杆菌Bl21（DE）3 ,IPTG诱导表达,镍金属亲和层析纯化目的蛋白,产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定。以目的蛋白作为包被抗原,初步建立间接ELISA 检测方法。结果 成功构建重组质粒pET-43.1a(+)/VP1,表达纯化出较高纯度的EV71 VP1融合蛋白,初步建立人血清中抗EV71 IgG间接ELISA 检测方法。检测77份6-10岁健康儿童、手足口病现症患儿血清中抗EV71 VP1 IgG抗体阳性率分别为51.22%、61.11%。结论 表达产物具有较好的免疫原性,可用于肠道病毒EV71抗体检测试剂盒的研制。     

雌二醇判断早期先兆流产预后的价值

目的：探讨血清雌二醇水平对判断早期先兆流产预后的价值。方法根据妊娠结局将102例早期先兆流产患者分为持续妊娠组83例和妊娠失败组19例。采用化学发光免疫法测定两组治疗前血清雌二醇水平。结果持续妊娠组血清雌二醇水平为（1279．23±352．33） pg/ml,明显高于妊娠失败组的（399．47±152．63） pg/ml （P＜0．05）;持续妊娠组血清雌二醇≥991 pg/ml比例为65．06％（54/83）,明显高于妊娠失败组的10．53％（2/19）（P＜0．05）;ROC曲线下面积为0．716,标准误为0．075,血清雌二醇水平预测先兆流产患者妊娠预后有统计学意义（P＜0．05）;以雌二醇水平为991 pg/ml判断妊娠预后的灵敏度为62．7％,特异度为21．7％。结论血清雌二醇对判断先兆流产预后的具有一定价值。     

鸡卵黄抗体用于诺如病毒检测的初步研究

目的以鸡卵黄免疫球蛋白IgY代替哺乳动物来源的IgG抗体,建立ELISA双抗体夹心法．探索用于诺如病毒检测的可行性。方法以387型菌株（GⅡ．4型）诺如病毒P颗粒为抗原免疫健康产蛋来航鸡,制备、纯化特异性抗诺如病毒鸡卵黄免疫球蛋白IgY。采用过碘酸钠法对IgY进行酶标。以特异性抗体为捕获抗体,酶标抗体为检测抗体,建立双抗体夹心ELISA检测体系。评价其灵敏度、特异度及重复性。并将其与金标准进行比较。结果本实验建立的双抗体夹心ELISA检测体系最低检测限达20ng／ml。批内变异系数为1．021％,批间变异系数为1．150％。临床应用评价显示真阳性率为82．5％,真阴性率为81．82％。与金标准比较,检出率差异无统计学意义（P=0．629）。结论建立了基于特异性抗诺如病毒卵黄抗体IgY的双抗体夹心ELISA检测体系,用于腹泻患者粪便标本诺如病毒的检测具有较好的敏感性和特异性。     

来曲唑微刺激超排卵对卵泡液中IGF-Ⅰ和IGFBP-1水平的影响

目的：探讨来曲唑（LE）微刺激超排卵对卵泡液中胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）和胰岛素样生长因子结合蛋白1（IGFBP-1）水平的影响。方法：96例体外受精-胚胎移植（IVF-ET）患者分为两组,LE微刺激组（42例）采用LE微刺激超排卵,GnRH-a方案组（54例）采用GnRH-a方案超排卵做对照,酶联免疫吸附法（ELISA）检测取卵时平均直径16mm以上卵泡的卵泡液中IGF-Ⅰ、IGFBP-1水平。结果：（1）LE组超排卵天数、总促性腺激素（Gn）用量、hCG日血清E2水平、获卵数显著低于GnRH-a组,受精率、优质胚胎率、种植率、临床妊娠率两组相比均无显著性差异（P〉0．05）;（2）LE组卵泡液中IGF-Ⅰ水平（197．2±35．6）ng／mL显著高于GnRH-a组水平（118．5±23．8）ng／mL（P〈0．05）,IGFBP-1水平（3057．7±346．7）pg／mL显著低于GnRH-a组水平（7093．9±435．3）pg／mL（P〈0．05）。结论：LE微刺激超排卵可刺激卵泡液内IGF-Ⅰ分泌,使卵巢对Gn敏感性增加,用较少的Gn达到同GnRH-a方案相似的超排卵效果。     

胱抑素C的IgG-和IgY-ELISA检测体系的建立与评价

目的建立适用于检测人胱抑素C（Cystatin C）的IgG与IgY双抗体夹心ELISA检测体系。方法以人Cystatin C作为抗原免疫产蛋的罗曼鸡和新西兰兔,纯化抗Cystatin C的鸡抗体IgY和兔抗体IgG,并分别建立三种ELISA夹心检测体系,I：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋抗鸡IgY酶标抗体;Ⅱ：捕捉抗体IgG＋检测抗体IgY＋兔F（ab＇）2抗鸡酶标抗体;Ⅲ：捕捉抗体IgY＋检测抗体IgG＋抗兔IgG酶标抗体。通过比较Cystatin C的最低检测浓度和阴性对照的OD值评价三种夹心法的灵敏度和特异性。结果体系I的Cystatin C最低检测浓度为7.5ng/mL（阴性对照OD值为0.737）,体系Ⅱ的Cystatin C最低检测浓度为13ng/mL（阴性对照OD值为0.313）,体系Ⅲ的Cystatin C最低检测浓度为10ng/mL（阴性对照OD值为0.31）。结论成功建立了Cystatin C的双抗体夹心ELISA检测体系,体系I的灵敏度最高但其特异性差,体系Ⅱ和Ⅲ的检测灵敏度和特异性均较好,可以用于Cystatin C的检测。     

原发性肝细胞癌患者TGF-β及VEGF-C测定的临床意义

目的分析转化生长因子-β(TGF-β)和血管内皮生长因子-C(VEGF-C)在原发性肝细胞癌(PHC)中的表达及其临床意义。方法应用SP免疫组织化学法检测TGF-β和VEGF-C在PHC组患者及正常组肝组织中的表达情况,并用酶联免疫吸附试验法检测两组患者血清TGF-β和VEGF-C含量,并进行对比分析。结果 56例PHC组肝组织的VEGF-C和TGF-β阳性表达率分别是76.8%(43/56)、92.8%(52/56),60例正常组的阳性表达率分别是3.36%(2/60)、10.0%(6/60),二者之间的VEGF-C和TGF-β阳性表达率均有统计学差异(P0.05)。PHC组血清TGF-β和VEGF-C含量分别为(290.8±65.8)pg/mL,(372.6±86.3)pg/mL,正常组血清TGF-β和VEGF-C含量分别为(70.1±25.6)pg/mL,(81.3±16.5)pg/mL,差异均有统计学意义(P0.05)。结论 TGF-β和VEGF-C异常表达与PHC的发展密切相关,可以提高PHC的诊断率,对预测PHC肿瘤侵袭转移及判断预后具有一定价值。     

CC16及转录因子T-bet、GATA-3对支气管哮喘患者气道炎症的调控作用

目的探讨Clara细胞分泌蛋白(CC16)及转录因子T-bet、GATA-3在支气管哮喘患者气道炎症中的价值。方法采取病例对照研究,收集25例哮喘急性发作期患者和33例健康对照组。采外周静脉血分离血浆,提取外周血单个核细胞(PBMC),用ELISA测定血浆中CC16、IFN-γ、IL-4的水平;用RT-PCR法检测PBMC转录因子T-bet mRNA和Gata-3 mRNA表达水平。结果哮喘组CC16及IFN-γ分别为(21.96±7.31)ng/mL和(118.73±22.59)pg/mL,明显低于对照组[(64.88±25.27)ng/mL和(145.53±29.50)pg/mL,P均0.01],哮喘组IL-4高于对照组[(425.22±4.37)pg/mL比(69.72±10.15)pg/mL,P0.01]。哮喘组T-bet mRNA、T-bet/GATA-3表达水平(0.12±0.01,0.25±0.04)显著低于对照组(0.48±0.12,1.89±0.65)(P均0.01),GATA-3 mRNA表达(0.45±0.05)较对照组(0.30±0.08)明显升高(P0.01)。CC16与T-bet mRNA表达水平、T-bet/GATA-3呈正相关(r值分别为0.792和0.761,P均0.01);与GATA-3 mRNA无明显相关性(r=-0.146,P=0.551)。结论哮喘患者CC16水平降低,对气道炎症的保护性削弱,可能与T-bet/GATA-3和IFN-γ/IL-4的失衡有关。     

慢性粒细胞白血病BCR-ABL融合基因实时定量检测平台的建立

目的：建立慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia ,CML）患者BCR-ABL融合基因检测及微小残留病变实时定量监测的诊断平台。方法依据GenBank中编码P210蛋白的融合基因M（ b2a2,b3a3）及ABL的基因序列,分别设计引物及Taqman探针,以BCR-ABL阳性的CML患者cDNA为模板,通过PCR扩增出587 bp的基因片段,连入pMD 18-T载体,制备成标准品并绘制标准曲线,运用实时荧光定量PCR（ real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技术监测BCR-ABL转录水平的变化。结果成功构建BCR-ABL标准品。应用RQ-PCR探针法,以ABL为内参,对CML患者进行BCR-ABL融合基因的检测,得到比较稳定的定量数据,与定性结果一致。结论自行构建BCR-ABL质粒为标准品,运用RQ-PCR实时监测BCR-ABL融合基因的表达变化,敏感性好,稳定性高,对临床检验具有普遍意义。     

幽门螺杆菌脂蛋白Lpp20的表达纯化及其临床应用的初步研究

目的获得重组幽门螺杆菌（H．pylori）脂蛋白（rLpp20）,并研究其在血清学诊断中的应用价值。方法应用重组质粒pGEX-6P．2／Lpp20在大肠杆菌（E．coli）BL21中表达,并进行GST亲和层析纯化,用Western．blot检测纯化产物（rLpp20）的免疫反应性;以rLpp20为包被抗原建立ELISA法对200份患者血清标本进行特异性IgG抗体检测,并与幽门螺杆菌-IgG抗体检测试剂盒法进行比较。结果成功表达的rLpp20（43000Mr）,纯化产物可被幽门螺杆菌多克隆抗体及阳性血清识别;成功建立了以rLpp20为包被抗原的间接ELISA法,其灵敏度为91．0％,特异度为100％。与试剂盒法比较,两者的符合率为95．5％。结论Lpp20具有良好的免疫反应性,能与幽门螺杆菌阳性血清特异性结合,有望应用于幽门螺杆菌血清学诊断。     

姜黄素对铜绿假单胞菌诱导人肺上皮细胞产生细胞因子的影响及其分子机制研究

目的 探讨姜黄素对铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa,Pa）感染的肺上皮细胞的体外抗炎效应.方法 体外培养肺上皮细胞系NCI-H292,加入姜黄素和培养的Pa感染不同时间.Western blot检测和实时定量PCR分别检测NCI-H292细胞中红素氧合酶1（Heme oxygenase-1,HO-1）mRNA和蛋白表达情况;ELISA检测IL-1β和IL-8的产生.同时采用RNA干扰HO-1表达后,观察对Pa诱导IL-1β和IL-8产生的影响.结果 Pa感染NCI-H292细胞后,IL-1β和IL-8含量分别为（87.52±7.96）pg/mL和（205.63 ±34.25） pg/mL,50 μg/mL姜黄素孵育8h后,其含量分别降至（15.78±10.74）pg/mL和（49.82±14.28）pg/mL,处理前后差异有统计学意义（P＜0.05）.同时,姜黄素能在转录翻译水平分别调控HO-1 mRNA和蛋白表达,其中50 μg/mL姜黄素能将HO-1 mRNA增高19倍,蛋白表达水平提高4.8倍（P＜0.05）.HO-1 siRNA沉默HO-1表达后,与Pa组相比,IL-1β和IL-8分泌进一步增高.结论 姜黄素可能通过上调HO-1的表达而发挥对肺上皮细胞的抗炎作用.     

Establishment of a Sandwich ELISA Method for Detection of Vascular Endothelial Growth Factor in Serum Samples of Hepatocellular Carcinoma Patients1

Objective To establish a sandwich ELISA method for detecting vascular endothelial growth factor(VEGF)in sera of population and the patients with hepatocellular carcinoma(HCC). Methods Full length and two truncated human VEGF cDNA sequences were amplified from a commercial plasmid pBLAST49-bVEGF by PCR and inserted into the prokaryotic-expression plasmid pET-32a or pGEX-2T. Various VEGF proteins were expressed and purified from E. coli in His-Trx or GST fusion forms.The specific VEGF antibodies were elicited in experimental rabbits and mice by immunization of the full length VEGF fusion protein His-Trx-VEGF1-165.After purification of antibodies with chromatograph of Protein G.a sandwich ELISA technique was established.Serum VEGF levels were evaluated in 229 adults and 291 HCC patients.Results SDS-PAGE displayed that the molecular weights of the expressed full length(His-Trx-VEGF1-165),N-terminal(His-Trx-VEGF1-100)and C-terminal(GST-VEGF100-165)human VEGF fusion proteins were about 38KD,31KD,and 33KD,respectively.Western blots confirmed that the prepared antisera were able to recognize both prokaryoticly and eukaryoticly expressed recombinant VEGF proteins.Assays of serially diluted His-Trx-VEGF1-100 by the established sandwich ELISA method showed that the linear range of the standard curve was 0.625-320 ng/mL.with the squared correlation coefficient R2=0.991.Screening of a serum panel containing 291 serum samples of HCC patients and 229 health adults rovealed that the average VEGF level in HCC patients was higher than that in healthy controls,with a statically significant difference. Conclusion The established sandwich ELISA reflects the level of serum VEGF and provide scientific basis for scrcening metastasis and recurrence of HCC using serum VEGF as an index.